Name: methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues
Uploaded: 2016-10-31T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues at JoVE.com

Arbetet stöds av CPRIT Research Training Award RP140105, liksom delvis stöd av amerikanska National Institutes of Health (NIH) ger R01 GM114142 och William &amp; Ella Owens Medical Research Foundation.

Alla vävnader erhålls efter godkännande av Institutional Review Board kommitté och när alla deltagare samtyckt till både molekylära analyser och uppföljningsstudier. Protokollen är godkända av Human Studies kommittén vid University of Texas Health Science Center i San Antonio. 1. Metyl-bindande DNA Capture (MBDCap) <ol><li> Provsamling och DNA-isolering <ol><li> Samla bulk tumör eller normala vävnadsprover från patienter paraffininbäddade vävnadsprover. </li><li> Använda ett k...

<ol>
	<li>Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+a+perspective+on+the+role+of+DNA+methylation+in+acquired+endocrine.">Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine.</a> Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).</li><li>Nair, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methyl-DNA+immunoprecipitation+(MeDIP)+and+methyl-CpG+binding+domain+(MBD)+protein+capture+for+genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveal+CpG+sequence+coverage+bias.">Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias.</a> Epigenetics. 6, 34-44 (2011).</li><li>Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+DNA+methylation+profiling.">Methods in DNA methylation profiling.</a> Epigenomics. 1, 331-345 (2009).</li><li>Clark, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+whole+genome+approach+of+MeDIP-seq+to+the+targeted+approach+of+the+Infinium+HumanMethylation450+BeadChip((R))+for+methylome+profiling.">A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling.</a> PLoS One. 7, e50233 (2012).</li><li>Walker, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+profiling:+comparison+of+genome-wide+sequencing+methods+and+the+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chip.">DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip.</a> Epigenomics. , 1-16 (2015).</li><li>Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+DNA+methylomes+from+microarray+to+genome-scale+sequencing.">Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing.</a> Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).</li><li>Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MBD-isolated+Genome+Sequencing+provides+a+high-throughput+and+comprehensive+survey+of+DNA+methylation+in+the+human+genome.">MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).</li><li>Brinkman, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+DNA+methylation+profiling+using+MethylCap-seq.">Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq.</a> Methods. 52, 232-236 (2010).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LOcating+non-unique+matched+tags+(LONUT)+to+improve+the+detection+of+the+enriched+regions+for+ChIP-seq+data.">LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data.</a> PLoS One. 8, e67788 (2013).</li><li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMS:+a+web-based+system+for+visualization+and+analysis+of+genome-wide+methylation+data+of+human+cancers.">CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers.</a> PLoS One. 8, e60980 (2013).</li><li>Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W-ChIPeaks:+a+comprehensive+web+application+tool+for+processing+ChIP-chip+and+ChIP-seq+data.">W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data.</a> Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).</li><li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveals+estrogen-mediated+epigenetic+repression+of+metallothionein-1+gene+cluster+in+breast+cancer.">Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer.</a> Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).</li><li>Hsu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+hypomethylation+of+EpCAM-regulated+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+recurrent+endometrial+cancer.">Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).</li><li>Wang, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Distal+and+Genic+Methylation+in+the+Development+of+Prostate+Tumorigenesis+Revealed+by+Genome-wide+DNA+Methylation+Analysis.">Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis.</a> Sci. Rep. , (2015).</li><li>Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+profiling+of+DNA+modifications:+cytosine+methylation+and+beyond.">Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond.</a> Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).</li><li>Riebler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BayMeth:+improved+DNA+methylation+quantification+for+affinity+capture+sequencing+data+using+a+flexible+Bayesian+approach.">BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach.</a> Genome Biol. 15, R35 (2014).</li></ol>

Den MBDCap-punkter teknik är en affinitetsanrikning metod 3, betraktas som ett kostnadseffektivt alternativ vid utredning kohorter med ett stort antal patienter 15. Rörledningen som presenteras här beskriver en övergripande strategi från prov upphandling dataanalys och tolkning. En av de viktigaste stegen är att inrätta en PCR-förstärkning förfarande för att främja PCR effektivitet GC berikade områdena i genomet eftersom det är där DNA-metylering förekommer. Dessutom är det viktigt att se till att efte...

Epigenetisk reglering av gener genom DNA-metylering är en av de väsentliga mekanismer som krävs för att bestämma cell öde genom stabil differentiering av olika vävnadstyper i kroppen 1. Dysreglering av denna process har varit kända för att orsaka olika sjukdomar inklusive cancer 2. Denna process innebär främst tillsättning av metylgrupper på cytosin rester i CpG-dinukleotider i DNA 3. Det finns några olika tekniker som för närvarande används för att undersöka denna mekanism, var och en har sina egna fördelar som beskrivs i många studier 2-8. Här kommer vi att diskutera en av dessa tekniker kallas metyl-bindande DNA-Capture-sekvensering (MBDCap-punkter), där vi använder en affinitetsanrikning teknik för att identifiera denaturerad regioner av DNA. Denna teknik bygger på metyl-bindningsförmågan hos MBD2-proteinet för att anrika de genomiska DNA-fragment innehållande metylerade CpG platser. Vi använder en kommersiell metylerat DNA anrikning kitför isolering av dessa metylerade regioner. Vårt laboratorium har screening hundratals patientprover med denna teknik och här erbjuder vi en omfattande optimerat protokoll, som kan användas för att undersöka stora patientgrupper. Som framgår med någon nästa generations sekvenseringsteknologi, MBDCap-punkter kräver också en specifika bioinformatik strategi för att exakt kvantifiera nivåerna av metylering över proven. Det har varit många nya studier i ett försök att optimera normalisering och analysprocessen av de sekvensdata 9, 10. I detta protokoll visar vi en av dessa metoder som genomför en unik läsning återhämtning strategi - LONUT - följt av linjär normalisering av varje prov för att möjliggöra objektiva jämförelser mellan stort antal patientprover.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Methylminer DNA enrichment Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ME10025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112-05D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus Sonication Device</td>
			<td>diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate pH 5.2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIworks Fragment Library System I</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A50100</td>
			<td>Fully automated library construction system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter Primers</td>
			<td>Bioo Scientific</td>
			<td>514104</td>
			<td>PCR primer mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Fluorometric Quantitation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix</td>
			<td>KAPA scientific</td>
			<td>KK2621</td>
			<td>PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues

Metylering är en av de väsentliga epigenetiska modifieringar av DNA, som är ansvarig för den exakta regleringen av gener som krävs för stabil utveckling och differentiering av olika vävnadstyper. Dysreglering av denna process är ofta kännetecknande för olika sjukdomar som cancer. Här, vi beskriva en av de senaste sekvenseringstekniker, metyl-bindande DNA-Capture-sekvensering (MBDCap-punkter), som används för att kvantifiera metylering i olika normala och sjukdoms vävnader för stora patientgrupper. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för denna affinitetsanrikning tillvägagångssätt tillsammans med en bioinformatik pipeline för att uppnå optimal kvantifiering. Denna teknik har använts för att sekvensera hundratals patienter inom olika cancertyper som en del av den 1000 methylome projektet (Cancer Methylome System).

Vi har använt MBDCap-seq för att studera DNA-metylering förändringar i ett stort antal patienter från olika cancertyper inklusive bröst 12, endometrial 13, prostata 14, och levercancer bland andra. Här visar vi lite information från bröstcancer studie som publicerades nyligen 12. I detta fall har vi använt hela genomet sekvense metod för att identifiera CpG-öar som differentiellt metylerade i tumörer med avseende på normal mellan olika genomiska regioner. Undersökningen visade att a...

Watch this Scientific Journal Video about Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues at JoVE.com

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka genomet bred DNA-metylering i storskaliga kliniska patientscreeningstudier med hjälp av metyl-bindande DNA-Capture-sekvensering (MBDCap-punkter eller MBD-punkter) teknik och efterföljande bioinformatik analys pipeline.

Metyl-bindande DNA fånga sekvensering för patientvävnader

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Rening av hög molekylvikt Genomiskt DNA från mjöldagg för lång Läs Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimering och jämförande analys av organellära DNA-berikningsmetoder lämpliga för nästa generations sekvensering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Omfattande DNA-metyleringsanalys med användning av en metyl-CpG-bindande domänfångningsbaserad metod i patienter med kronisk lymfocytisk leukemi

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion för herbarieexemplar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation av Genome-wide kromatin konformation fånga bibliotek från tätt stegvis tidiga Drosophila embryon

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekvensering: Kompletterande DNA bibliotek förberedelse protokoll använder Formalin-fast Paraffin-inbäddat RNA exemplar

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detektion av sällsynta händelser med fel-korrigerade DNA och RNA-sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halvledar sekvensering för preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA från helblod med Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...