Name: fret imaging in three-dimensional hydrogels
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

المؤلفون تقر بدعم مالي من كلية طب الأسنان في جامعة بيتسبرغ، والمعاهد الوطنية للصحة جائزة K01 AR062598، وDE030740 منحة P30. أشكر الكتاب أيضا الدكتور جين تشانغ لالبلازميد ICUE1، واين Rasband لتطوير يماغيج ومايكل Cammer للماكرو يماغيج.

The authors have no conflicts to declare.

الإشارات الخلوية على حد سواء معقدة والتبعية للعديد من المجالات، بما في ذلك علم الصيدلة، هندسة الأنسجة والطب التجديدي. هناك حاجة إلى أدوات الفحص مفيدة لزيادة فهمنا للبيولوجيا الخلية وتطوير المواد المثلى لتجديد الأنسجة. فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) التصوير هو أداة أساسية تمكن من تحليل تنشيط مستقبلات، التشكل الجزيئي، والتفاعلات supramolecular (على سبيل المثال، بروتين / الحمض النووي complexation) في الخلايا الحية. الحنق هو نوع من نقل الطاقة غير الإشعاعي بين fluorophores 1. ولديه الكفاءة التي تتناسب عكسيا مع قوة السادسة من المسافة بين fluorophore المانحة وfluorophore المتقبلة. وهكذا، يمكن أن توفر معلومات عن المسافة المكانية بين اثنين من جزيئات مختلفة أو عبر مناطق جزيء واحد على مقياس النانومتر (عادة 1-10 نانومتر) 2. قد يكون fluorophores المانحة ومتقبل م مختلفةأنواع olecule (مغاير الحنق)، الذي المانحة لديه انبعاث طاقة أعلى (أقصر طول موجي)، أو من نفس النوع (هومو-الحنق). الحنق التصوير لا يمكن أن يؤديها على خلايا ثابتة أو الحية، ولكن بصفة عامة تستخدم خلايا ثابتة للتصوير التفاعلات الجزيئية في قرار مكانية عالية عندما نظم مبائر سرعة عالية غير متوفرة. تستخدم الخلايا الحية لدراسة التفاعلات والعمليات التي تحول دون أو تعديلها من قبل التثبيت، مثل داخل الخلايا في الوقت الحقيقي مما يشير إلى استجابة 3. دراسات الخلية الحية التي تستخدم الحنق استخدام التصوير ثنائي الأبعاد (2D) الثقافات الخلوية وذلك جزئيا بسبب البساطة وانخفاض الخلفية (أي انبعاث من خارج الخلايا الطائرة). ومع ذلك، ثقافات 2D أيضا تغيير العديد من العمليات الخلوية مقارنة المكروية الفسيولوجية وثلاثية الأبعاد (3D) ثقافة 4،5. على سبيل المثال، يتم تغيير الخلية الأم إلى الخلية والخلية إلى التفاعلات المصفوفة خارج الخلية بشكل كبير في ثقافة 2D المؤدية إلى قمة شرق آسيالاحظ إيلي التغييرات في شكل الخلية والاستقطاب 6. microdomains غشاء (على سبيل المثال، caveolae والدهون الطوافات) والإشارات المستقبلة وينظم بقوة عن البيئة والثقافة، ويرجع ذلك جزئيا إلى ربط مكونات هيكل الخلية 7،8 وشكل الخلية وهيكل الخلية هيكل وينظم بقوة بيئة الثقافة المكانية 9. لا يتأثر Mechanotransduction إلا من خلال مصفوفة 3D، ولكن بسبب الظروف تحميل الثانوية أكثر تعقيدا تولدت في بيئات 3D مقارنة الثقافات 2D 10. وأخيرا، نفاذية المصفوفات 3D أقل من مستنبت، بشكل عام مع انخفاض انتشار وزيادة ملزمة من الخلايا الجزيئات مما يشير مقارنة الثقافات 2D. مع الثقافات 3D واحد قادر على خلق ومراقبة المكروية أكثر مماثلة لفيزيولوجي فيما يتعلق اللاصقة والكيميائية، والعظة الميكانيكية. خلية إلى خلية التفاعلات يمكن تعزيز وخصائص لاصقة يمكن التحكم ثإيث هيكل، وتكوينها، والهندسة المعمارية (الزخرفة) من المادة 3D 11-13. يمكن أيضا الخواص الميكانيكية للمواد تكون مصممة من قبل تكوين وبنية 14،15. زراعة الخلايا في الهلاميات المائية بالتالي تصاريح الحنق دراسات على الخلايا الأولية التي من شأنها التقليل من يفرق خلاف ذلك أو تغيير في النمط الظاهري باستخدام التقنيات التقليدية، على سبيل المثال، الخلايا من الغضروف المفصلي. وبالتالي، هناك حاجة إلى وسيلة لتمكين المقايسات الحنق في الثقافات 3D حية. السقالات هيدروجيل مثالية للدراسات تستند 3D الحنق لأنها يمكن أن تكون شفافة بصريا ومصممة للسيطرة على المكروية وتقديم العظة الخلوية. وقد استخدمت الهلاميات المائية المصنوعة من البوليمرات الطبيعية في زراعة الخلايا على مدى عقود، بما في ذلك الجيلاتين والفيبرين 16. ويمكن تحقيق قدر أكبر من السيطرة المكروية الخلوية مع التعديل الكيميائي لهذه البوليمرات ومع استخدام البوليمرات الاصطناعية 17،18. HYDRogel صلابة الميكانيكية ويمكن التحكم نفاذية عن طريق تغيير تركيبتها البوليمر وشبكة حجم (البوليمر وكثافة تشعبي) 19،20. وعلاوة على ذلك، الهلاميات المائية ويمكن إجراء النشطة بيولوجيا من خلال إدراج عوامل النمو وبروابط الخلوية. بسبب هذه الاحتمالات، وتطوير الهلاميات المائية لbiosensing، تسليم المخدرات، وتطبيقات هندسة الأنسجة هي منطقة نشطة جدا من الأبحاث 21. 3D الطباعة من الهلاميات المائية يخضع لعملية تطوير لتصنيع الأنسجة الدقيقة و-organs 15. وهكذا، الحنق التصوير من الخلايا في الهلاميات المائية هو مفيد ليس فقط كوسيلة لتقريب سلوك الخلوية الفسيولوجية، ولكن أيضا كأداة لدراسة وتحسين نمو الأنسجة هندسيا. ثنائية تحقيقات الحنق ratiometric مفيدة جدا في دراسة الإشارات الخلوية، ويمكن الاستفادة منها في الثقافات هيدروجيل. للحصول على قائمة جزئية من الفلورسنت المنشورة والحنق تحقيقات، راجع خلية اتحاد هجرة الموقع <sup&gt; 22. نوع التحقيق الأكثر شيوعا يحتوي على اثنين fluorophores المختلفة التي ترتبط أو ترتبط بها عنصر الاعتراف (ق) (تحليلها المنطقة الحساسة). هذه المناطق تخضع لتغيير متعلق بتكوين أو جمعية أو تبرؤ عند الكشف عن الحليلة (على سبيل المثال، ربط أيون أو جزيء، انشقاق الأنزيمي في المنطقة) أن يغير المسافة بين fluorophores، وبالتالي فإن حجم الحنق (إما أعلى أو أقل) 23. وهناك نوع مسبار أقل شيوعا ولكنها مفيدة يعتمد على التغيير حساسة تحليلها في التداخل الطيفي للfluorophores اثنين، الذي يغير الحنق الحجم. &quot;وحيد سلسلة&quot; تحقيقات ratiometric الاستفادة من زوج fluorophore مرتبط على جزيء واحد. &quot;مزدوجة سلسلة&quot; تحقيقات الاستفادة أزواج fluorophore على جزيئات منفصلة، ​​ولكن التعبير عنها يمكن أن يقترن تحت نفس التعبير كاسيت 24. على عكس الدراسات مع التعبير fluorophore واحد (على سبيل المثال. والبروتينات الانصهار فلوري)، ودراسات مع ratiometricتحقيقات الحنق لا تتطلب ترنسفكأيشن المزدوج للسيطرة على كفاءة ترنسفكأيشن أو بقاء الخلية. تحقيقات Ratiometric الحنق لا تعير اهتماما نسبيا لكفاءة ترنسفكأيشن عندما أعرب فوق الحد الأدنى عتبة (تركيز حساسة) 23،25. فهي حساسة لتقلبات مصدر الإثارة وغيرها من العوامل البيئة داخل الخلايا (على سبيل المثال.، ودرجة الحموضة، أيونات) ما دام كل fluorophores تستجيب على نحو مماثل. وبالإضافة إلى ذلك، ردهم لا تخضع لتأخير النسخي، على عكس فلوري وإضاءة الحيوية المروج مراسل يبني 26،27. وبسهولة وغالبا ما يلجأ تحقيقات Ratiometric الحنق في أنظمة المجهر widefield epifluorescence التقليدية. ويفضل المجاهر Widefield على الأنظمة مبائر خط المسح الضوئي لتصوير الخلايا الحية بسبب المخاوف بشأن تكلفة النظام، وتبيض fluorophore، والتقاط التغيرات إشارة لقرار زمني يكفي. وبالإضافة إلى ذلك، الشرج خلية واحدةيسيس على عدد كبير من الخلايا هو ممكن مع القبض على مرحلة وصورة الآلية على حقول نظر متعددة. يتطلب Widefield المجهري تحليل كثافة أساس الإشارات التحقيق مغاير الحنق. على الرغم من تحليل كثافة لا تتطلب أجهزة معقدة مثل أساليب الزخرفة أخرى، هناك حاجة إلى مزيد من العمل بعد الحيازة لتصحيح آثار السلوكيات fluorophore والمجهر / التصوير تكوينات النظام 28. كثافة الانبعاثات القبض على fluorophore هي وظيفة من طاقة الإثارة، fluorophore العائد الكم، وتصفية جنبا إلى جنب والكاميرا / كشف الحساسية الطيفية والخطي 2. قد تكون هذه تختلف عن الجهة المانحة ومتقبل وسوف يتطلب معايرة للتحليل الكمي. وبالإضافة إلى ذلك، يتأثر التصوير من الانبعاثات متقبل من خلال التداخل الطيفي للfluorophores (الإثارة من متقبل من قبل الجهات المانحة ضوء الإثارة وتنزف من خلال انبعاث المانحة إلى أطياف الانبعاث متقبل) 2.4؛ واحدة سلسلة &quot;تحقيقات تم تطبيع داخليا بسبب fluorophores هم متساوي المولية على مقياس النانو، في حين أن fluorophores من&quot; مزدوجة سلسلة &quot;تحقيقات قد تكون موجودة في النسبة المولارية المختلفة في جميع أنحاء خلية 25،28 إذا كان fluorophores من&quot; سلسلة واحدة &quot; تحقيقات ذات سطوع مماثل (وظيفة من معامل الانقراض والعائد الكم)، وآثار للكشف عن حساسية غير الخطية هي تصحيح صغير والوحيد لمضان الخلفية ونوعية حساسية العائد / كاشف جانب هناك حاجة إلى 23 وهكذا &quot;سلسلة واحدة&quot; تنفذ تحقيقات ratiometric الحنق أكثر سهولة في widefield المجهري 24. وتصف هذه الورقة تقنية واضحة لأداء الحنق التصوير من الخلايا الحية في الثقافات هيدروجيل 3D باستخدام المجهر widefield epifluorescent التقليدية. ويمكن بسهولة اعتمدت من قبل مختبرات تحمل بالفعل تجارب الحنق في 2D، وكذلك المختبرات المهتمة في ما بينالإشارات الخلوية في microtissues. نحن هنا لشرح الطريقة مع قياس الحنق التصوير أساس من الأدينوزين الحلقي الأدينوساين (المخيم) مستويات في غضروفية الحية داخل photocrosslinking (PC-جل، البولي ايثيلين جلايكول dimethacrylate) وthermoresponsive (TR-جل، Matrigel) الهلاميات المائية. ويستخدم مجس الحنق ratiometric على أساس EPAC1 (ICUE1) للكشف عن مستويات المخيم ردا على forskolin، ناهض الكيميائية لمحلقة أدينيليل الذي يحفز تحويل ATP إلى المخيم. المخيم هو واحد من رسل الثانية الرئيسية التوسط G البروتين يقترن مستقبلات الإشارات وأنه ينشط عوامل مختلفة، بما في ذلك البروتينات صرف المصب تفعيلها مباشرة من المخيم (EPACs). وfluorophores تتحرك بعيدا على مخيم ملزمة إلى المجال EPAC مما أدى إلى انخفاض في الحنق. وصفت هنا هو إعداد المواد هيدروجيل، ترنسفكأيشن الخلية مع لجنة التحقيق ICUE1، وتضمين الخلايا في الهلاميات المائية 3D. إجراء تجربة 3D الحنق وتحليل الصور ضروريوأوضح النشاط التحقيق في خلية لتقييم. نحن أيضا مناقشة القيود المتأصلة في تحليل الحنق في 2D و 3D باستخدام widefield المجهر. تقنية المعروضة هنا هي تحسنا عن طرق القائم 2D لأنه تمكن من تحليل في سياق أكثر الفسيولوجية ويتطلب أقل تصحيح الصورة والمعايرة. فائدة كبيرة تكمن في حقيقة أن العديد من مواد شفافة يمكن استخدامها في حين يمكن الحفاظ على الخلية وترنسفكأيشن التفضيلات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td>
			<td style="width:119px;">NC0162601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM)</td>
			<td style="width:71px;">Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95904</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6514</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">3-glycidoxypropyltrimethoxysilane</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">440167</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">149470-5g</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC244280100</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC149670010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC199871000</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">190764</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sigmacote (siliconizing reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">SL2</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Toluene&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC36441-0010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH3025601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11058-021</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cellstripper (cell dissociation solution)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-056-CI</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Forskolin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipette Tips (10,200,1000 &#956;l)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-149-863B</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">01-213-100</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Biopsy punch (3 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">3332</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544C</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precoated glass coverslips (epoxysilane)</td>
			<td style="width:71px;">Arrayit</td>
			<td style="width:119px;">CCSL</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass slide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12550D</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile vials (15 mL, 50 ml conical)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-70C, 14-959-49A</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish (6-well)</td>
			<td style="width:71px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351146</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Epifluorescent Microscope with motorized stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Adjustable Specimen Holder for XY Stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">77011393</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MRD01605</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source &#38; wheel, Lambda emission filter system)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Sutter Instrument reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77016231, 77016088</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">CYF/YFP filter set</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Chroma Technology Corp)</td>
			<td style="width:119px;">77014928</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:216px;">Camera (ORCA Flash 4.0 v1)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Hamamatsu reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77054076</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab-equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">NIS-Elements 40.20.02 microscope software)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MQS31100&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Prism (spreadsheet and graphing software)</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software, Inc</td>
			<td style="width:119px;">Version 6</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (&#955;=365 or 405)</td>
			<td style="width:71px;">OmniCure</td>
			<td style="width:119px;">S1000</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pipette Aid&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DP-100</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:71px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Reichert Bright-Line 1475</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vacuum desiccator chamber/degasser&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Chemical Fume Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Oven</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Spatula</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fret imaging in three-dimensional hydrogels

تصوير فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) هو أداة قوية لفحص بيولوجيا الخلية في الوقت الحقيقي. الدراسات باستخدام الحنق عادة توظف ثنائي الأبعاد (2D) والثقافة، والتي لا تحاكي ثلاثية الأبعاد (3D) المكروية الخلوية. تم توضيح طريقة لأداء الانبعاثات مروي الحنق التصوير باستخدام التقليدية المجهر widefield epifluorescence من الخلايا داخل بيئة هيدروجيل 3D. هنا يتم وصف طريقة تحليل للتحقيقات الحنق ratiometric التي تعطي نسب الخطية على نطاق تفعيل التحقيق. ويظهر قياس (المخيم) مستويات الخلايا أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي في غضروفية تحت التحفيز forskolin باستخدام مسبار لEPAC1 تفعيل (ICUE1) والقدرة على اكتشاف الفروق في مخيم يشير هذا يعتمد على نوع المواد هيدروجيل، هنا هيدروجيل photocrosslinking (PC-جل، البولي ايثيلين جلايكول dimethacrylate) وهيدروجيل thermoresponsive (TR-جل). بالمقارنة مع الطرق 2D الحنق،يتطلب هذا الأسلوب العمل الإضافي القليل. يمكن أن المختبرات التي تستخدم بالفعل الحنق التصوير في 2D تعتمد هذه الطريقة بسهولة لإجراء الدراسات الخلوية في المكروية 3D. ويمكن كذلك تطبيقها على الإنتاجية العالية فحص المخدرات في microtissues 3D هندسيا. بالإضافة إلى ذلك، وهو متوافق مع أشكال أخرى من التصوير الحنق، مثل قياس تباين والتصوير مضان عمر (FLIM)، ومع منصات متقدمة المجهري باستخدام مبائر، نابض، أو إضاءة التضمين.

وقد أعدت كل السلائف، والخلايا، وقوالب الصب هيدروجيل كما هو موضح أعلاه. ويلقي الخلية حلول السلائف لادن في قوالب PDMS ثم طرد قبل دبق / photocrosslinking لشل حركة الخلايا بالقرب من ساترة وتسهيل الحنق تحليل التصوير (الشكل 1). وضعت الهلاميات المائية مع coverslips المرافق خلال مستعدة الآبار التصوير PDMS للتصوير المجهري (الشكل 2). ثم تم تعيين تكوينات بصرية والمعلمات الحصول على الصور كما هو مبين في الشكل 3A. ويتجلى القبض على كل قنوات الصورة ذات الصلة الحنق أربعة لCFP-YFP أزواج fluorophore (انظر تحت عنوان &quot;أسيوط البصري.&quot; في الشكل 3)، كما هو مطلوب للتحقيقات غير الثنائية. ولكن في هذا العمل مطلوب اثنين فقط من الصور لسلسلة واحدة التحقيق ICUE1 ثنائي، QE = &quot;CFP CFP&quot; وAEM = &quot;YFP YFP&quot; (الانبعاثات الإثارة). FOVs متعددة (موقف س صوقد تم اختيار اللغات) التي عدة خلايا يقيمون داخل منطقة الإضاءة متجانسة (الشكل 3B). بعد اكتساب مرور الوقت، تم تصدير البيانات إشارة للتحقيق. رويس لتصحيح خلفية إشارات القناة ولتحليل الخلية كانت مخصصة باستخدام الصور AEM thresholded من بداية التجارب (الشكل 4). وقد تم اختيار الخلايا من بين تجمع الخلايا مثل تلك معربا كافية (لا قاتمة للغاية)، ولكن ليست عالية جدا (بشكل مفرط مشرق) تحقيق (الشكل 4B). حسبت بورصة قطر وSE الحنق نسب لكل بكسل في كل اكتساب باستخدام تقسيم الفاصلة العائمة من خلفية طرح قنوات الصورة. متوسط ​​نسبة الحنق في كل خلية (أي في ROI) تم حسابها، تطبيع إشارة خط الأساس قبل التحفيز (أي تراجع في الأساس تطرح من جميع نقاط الوقت)، وتآمر مع أشرطة الخطأ كما في الخطأ المعياري لل يعني (SEM). كل من بورصة قطر وCSE على أساس نسب الحنق ديTECT زيادة النشاط المخيم في غضروفية تحت التحفيز forskolin (100 نيوتن متر، الشكل 5). وكانت نسبة QE الحنق أكثر حساسية للتصويب خلفية من نسبة CSE الحنق لأن إشارة بورصة قطر كانت أقل نظرا لمستوى القاعدية انخفاض النشاط المخيم في غضروفية جزءا لا يتجزأ من داخل الهلاميات المائية. وأظهرت كلا النوعين هيدروجيل (TR-جل وPC-جل) زيادة في نسبة الحنق على مر الزمن (الشكل 6)، مما يدل على زيادة استجابة المخيم مما يشير إلى إضافة Forskolin. كما يتضح من نسبة QE الحنق، غضروفية في الهلاميات المائية PC-جل تظهر تغييرا أكبر في المخيم (كما هو موضح) ومستوى القاعدية أعلى من مخيم (E QE = 0.19 في PC-جل مقابل E QE = 0.09 في TR-جل، لا هو مبين في الشكل الأساس تطرح). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> الشكل 1: توزيع الخلايا في Photocrosslinked هيدروجيل (PC-جل) </قوية&gt; تم طرد والسلائف الخلية محملة هيدروجيل لزيادة عدد الخلايا في طائرة الوصل بالقرب من ساترة: A. باء: وهذا يزيد من عدد الخلايا في مجال الرؤية ويقلل إشارة الخلفية من خارج الخلايا الطائرة. (مقياس بار = 200 ميكرون) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> الشكل 2: هيدروجيل في PDMS الصحن وضعت هيدروجيل داخل PDMS طويل القامة أيضا (10X حجم هيدروجيل) مع قاعدة ساترة للتصوير المجهري والتحفيز تحليلها. الهلاميات المائية PC-جل شفافة والمستعبدين إلى ساترة بحيث تبقى في مكانها طوال الفحص. وPDMS بشكل جيد يمكن أن تكون أكبر لاحتواء 10X أكثر المتوسطة من حجم هيدروجيل باستخدام أوسع لكمة خزعة بالإضافة إلى فيhicker PDMS ورقة. (مقياس بار = 2 ملم) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> الرقم 3: تكوين لاكتساب الحنق التصوير تم تكوين اقتناء لالتقاط صورة كل 7 ثوان في مواقع متعددة: A. لبورصة قطر الحنق نسبة الحساب، هناك حاجة إلى اثنين فقط من القنوات صورة للتحقيق ICUE1 المستخدمة هنا (ثنائي سلسلة واحدة التحقيق)، QE = &quot;CFP CFP&quot; وAEM = &quot;YFP YFP&quot; (الانبعاثات الإثارة) تحت عنوان &quot;أسيوط البصرية&quot;. عمود في علامة التبويب λ من البرنامج المجهر. وقد تم اختيار FOVs ( &quot;XY&quot; المواقف) التي عدة خلايا يقيمون داخل منطقة الإضاءة متجانسة: B. المؤامرة أسفل الصورة يظهر شدة الإضاءة على طول الخط arrowed الأزرقأن يخترق من خلال مركز مجال الرؤية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> الشكل 4: اختيار رويس لتحليل الحنق التصوير وقد تم اختيار المنطقة ذات الاهتمام (ROI) خالية من الخلايا لتصحيح إشارة الخلفية على كل قناة: A. صورة من هيدروجيل خالية من الخلايا بدلا من ذلك قد يتم استخدامها لخلفية الطرح إذا كثافة الخلايا أو هجرة عالية، أو إذا لم يتم استخدام قناع التظليل عندما الخلايا التي لا تقع ضمن حقل الإضاءة متجانسة. ب: تم ​​تحديد رويس الخلية باستخدام العتبة الصورة وإخفاء ثنائي القناة AEM. اختيار العائد على الاستثمار أكبر من الخلايا سوف تؤثر سلبا على حساب متوسط ​​نسبة الحنق في الخلية نتيجة لإدراج نسب الخلية الناتجة عن خلفية نإيل دو فرانس. لا ينصح حساب نسبة الحنق الخلوية باستخدام متوسط ​​كل قناة لكل خلية لأن ذلك يقلل من نسبة. (مقياس بار = 50 ميكرون) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> الرقم 5: مقارنة بين نسب الحنق في Thermoresponsive هيدروجيل (TR-جل) كل من بورصة قطر ونسب الحنق SE استنادا للكشف عن زيادة النشاط المخيم في غضروفية تحت التحفيز forskolin. Forskolin هو إنزيم ناهض أدينيل الذي يدفع إنتاج المخيم. الحنق يقلل عندما يتحد التحقيق ICUE1 المخيم، وبالتالي فإن نسبة QE الحنق (E QE = SQE / (صائم س QS)) يزيد. على العكس من ذلك، فإن نسبة SE الحنق تنخفض وبالتالي تآمرت كما E SE = 1 - CSE / صائم. في هيدروجيل جزءا لا يتجزأ من غضروفية، بورصة قطر Fنسبة RET هي أكثر حساسية لتصحيح الخلفية من نسبة SE الحنق لأن إشارة التسهيل الكمي منخفضة بسبب النشاط المخيم القاعدية منخفضة. أشرطة الخطأ = SEM، ن = 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> الشكل 6: مقارنة نسبة الحنق في الهلاميات المائية المختلفة ردت غضروفية في كلا النوعين هيدروجيل لتحفيز forskolin مع زيادة في النشاط المخيم كما يدل على ذلك زيادة نسبة QE الحنق على مر الزمن. آثار نوع هيدروجيل الاستجابة الخلوية من خلال العديد من الآثار، بما في ذلك الاختلافات في نفاذية لforskolin وفي النشاط المخيم الخلوي القاعدية (E QE = 0.19 في PC-جل مقابل E QE = 0.09 في TR-جل، لا تظهر). أشرطة الخطأ = SEM، ن لTR-جل= 25، ن لPC-جل = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) التصوير هو أداة قوية في الوقت الحقيقي للدراسات بيولوجيا الخلية. هنا يتم تقديم وسيلة للخلايا التصوير الحنق في الفسيولوجية microenvironments ثلاثي الأبعاد (3D) هيدروجيل باستخدام المجهر epifluorescence التقليدية. يوصف تحليلا للتحقيقات الحنق ratiometric التي تعطي نسب الخطية على نطاق التنشيط.

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

رقاقة المستندة إلى خلية ثقافة ثلاثي الأبعاد في المفاعلات الصغيرة Perfused

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

التصنيع الدقيق للرقاقة الحجم السقالات لزراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

أداة تحليلية يحدد مقدار التغييرات الخلوية الصرف من التقاط صور ثلاثية الأبعاد الإسفار

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التلاعب في مسارات إشارات وتصوير لايف ثلاثي الأبعاد التنمية الزغبة

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

وحيد الخلية القرار التصوير ثلاثي الأبعاد من organoids سليمة

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

تحلل Proteolytically Alginate Hydrogels والميكروبات الهيدروفوبية ل Porcine Oocyte تغليف

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

تلطيخ وتصوير عالي الدقة لنماذج عضوية وكروية ثلاثية الأبعاد

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...