Name: fret imaging in three-dimensional hydrogels
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

Forfatterne anerkender den økonomiske støtte i School of Dental Medicine ved University of Pittsburgh, National Institutes of Health award K01 AR062598, og tilskud P30 DE030740. Forfatterne også takke Dr. Jin Zhang for ICUE1 plasmidet, Wayne Rasband for at udvikle ImageJ og Michael Cammer for ImageJ makro.

The authors have no conflicts to declare.

Dette arbejde viser, hvordan FRET billeddannelse kan bruges til at analysere cellulær signalering i 3D hydrogeler. Mens tidligere undersøgelser har vist FRET billeddannelse af celler podet på hydrogel substrater 35-37, af ekstracellulære interaktioner med hydrogeler 38, og af molekyler fanget i hydrogeler 39-41, dette er den første offentliggørelse at beskrive FRET billeddannelse baseret intracellulær analyse af celler indlejret i 3D hydrogeler. Arbejdet løser flere problemer med gennemførelsen ved oversættelse FRET billeddannelse fra 2D til 3D. Først er brug for store numeriske apertur mål for FRET billeddannelse at samle tilstrækkelig emission signal, men de begrænser dybdeskarphed. Cellerne her får lov til let afvikle via centrifugering for at øge antallet af celler i en fokalplan nær glasset for at kompensere for dette. For det andet kan 3D hydrogel scaffolds glide hen over synsfeltet under billedbehandling hvilket komplicerer analysen. Hydrogelerne her er bundet til coverslip så de ligger fast i hele forsøget. Tredje, udvælgelse af passende hydrogel præparater til 3D FRET er afgørende, fordi hydrogeler kan hindre visualisering af cellerne. Her transparente hydrogeler af PC-gel og TR-gel anvendes. Imidlertid kan samle cellerne med centrifugering til et fokalplan nær dækglasset anvendes til at afbilde celler i hydrogeler med højere diffraction.The valg af hydrogel afhænger mikromiljøet betingelser, der skal simuleres som kan findes i en bedømmelse på hydrogeler 42 . For det fjerde er en alternativ beregning ansat her for FRET forholdet mellem enkelt kæde ICUE1 sonde (dvs. E QE = QE / cAem) for at minimere antallet af billedkanaler kræves til analyse og dermed minimere fotoblegning. Det gennemsnitlige FRET forholdet per celle er beregnet som gennemsnittet af de nøgletal per pixel i en celle for at minimere undervurdering af den faktiske FRET forholdet. Endelig en lineær ratiometrisk analyse og midlerat beregne den aktiverede del af enkeltkædede binære prober er beskrevet. Der er flere kritiske aspekter af udførelsen vellykkede FRET eksperimenter ved hjælp vidvinklede mikroskopi. Med hensyn til hardware, skal kameraet være følsomme nok til at løse små signal ændringer, efterlader nyere videnskabelige CMOS kameraer og elektron multiplicere CCD&#39;er passer bedre end konventionelle CCD&#39;er. For bedst at analysere den rumlige fordeling af FRET-forholdet, skal kameraet på minimum besidder to gange den rumlige opløsning af punktspredningsfunktionen af ​​formålet (Nyquist kriteriet). Dette gør dual-view-systemer mindre egnet til opgaven. Mere afgørende er at vælge en passende eksponering og image erhvervelse sats for den givne FRET parret for at minimere fotoblegning af fluoroforer. En nedsat erhvervelse sats anbefales som eksperiment varighed øges. Anvendelsen af ​​filterhurtigskifterens hjul øger erhvervelse og antallet af FOVs til analyse mens undgåing registreringskravene billede problemer med dual-view og tårn filter kuber. Den inhomogene belysning felt komplicerer korrektion for baggrund fluorescens, der opstår fra prøve autofluorescens og kamera system støj. Nogle hydrogeler, især sådanne indeholdende kollagenproteiner er yderst autofluorescerende 43,44. FRET nøgletal er undervurderet uden baggrund korrektion. Her anvender vi en enkel baggrund korrektion metode, der bygger på den relativt flade feltbelysning som ofte kan konfigureres med epi-fluorescens belysning over midten af billedet (figur 3B, trin 7.2). Denne fremgangsmåde begrænser derfor celler af interesse for dem inden dette feltbelysning. Baggrunden korrektion beskrevet her tager ikke højde for cellulær autofluorescens i bølgelængder læses for den binære probe. I et sådant tilfælde bør umærkede celler (ingen sonde transfektion) afbildes på samme vilkår og baggrunden trækkes. En mix af mærkede og umærkede celler kan anvendes, og de umærkede celler udvalgt til baggrunden ROI. Alternative metoder, som tilvejebringer celle analyse over hele billedfeltet omfatter brug af en skygge maske, flere baggrund ROIs eller identiske prøver uden celler og en protokol er til rådighed efter anmodning. Specifikt til 3D FRET billeddannelse, probe reaktion er meget følsom over hydrogelen permeabilitet for analysanden (figur 6). de samme hydrogel regioner er derfor sammenlignes på tværs eksperimentelle behandlinger, fortrinsvis ved et punkt af geometri symmetri såsom nær stilladset center som anvendt her. Alternativt mikrofluide kamre / bioreaktorer kan anvendes til hurtigt og ensartet perfuse hydrogelen med analytopløsningen 45. muligvis ikke fundet et FRET-signal (signal til støj-forholdet er for lav), når hydrogelens autofluorescens er for høj; bør der anvendes en tyndere hydrogel eller forskellige probe (forskellige fluoroforer).Med hensyn til 3D FRET billeddannelse i fotokrydsbundet hydrogeler, anbefales brug af minimal bestråling eksponering og bølgelængder uden for excitation spektre af sonden fluoroforer. LAP kan anvendes med en synlig lyskilde ved 405 nm til yderligere at minimere potentiel celleskade 31,46. hjælp LAP med 365 nm bestråling anbefales dog, da dette minimerer sonde blegning. 365 nm ligger for enden af ​​den fælles fiskeripolitik donor excitation spektrum, mens 405 nm ligger på toppen excitation. Alternativt kan proben ekspression lov til at komme i en dag. Anvendelse af binære sonder minimerer spørgsmål af følsomhed over for forskelle i ekspressionsniveauerne og i molekylær diffusion af donor- og acceptor fluoroforer. Ikke-binære prober kan anvendes, men med SE stedet for QE billeddannelse og yderligere korrektion for spektral gennemblødning af excitations- og emissionsspektre (se nedenfor). Desuden den lave kommercielle tilgængelighed og kompleksiteten i at designe FRET sonderkan være en hindring. Den mest kritiske faktor for succesfulde eksperimenter forbliver ordentlig korrektion og analyse af fluorescens-signaler. En alternativ beregning af FRET forholdet udnyttes til flere andre grunde udover minimering af fotoblegning. For binære single-kæde sonder, den almindeligt rapporterede forholdet er acceptor emission under donor excitation (sensibiliserede emission, SE) til donor emission under donor excitation (slukket emission, QE), dvs FRET ratio = SE / QE 25,47,48. SE / QE er ikke-lineær i forhold til ændringer i FRET effektivitet 21,22,47. Nemlig forholdet har en eksponentielt ikke-lineær sammenhæng til iboende FRET effektivitet af proben (Ei) (Donius, AE, Taboas, JM udgivet værk. (2015)), idet forholdet mest lineære for Ei mindre end ca. 15%. SE / QE vil også undervurdere den del af aktiverede prober (FAP, dvs, fraktion af sonder bindende analyt). therefore, analyse af SE / QE kræver en besværlig ligevægt dosis respons studie og kurve pasform. Heldigvis forholdene mellem SE eller QE til acceptor emission under acceptor excitation (AEM) er lineær med hensyn til Ei og FAP, dvs FRET nøgletal SE / AEM og QE / AEM. SE / AEM bruges ofte til binære sonder og kræver kun endepunkt kalibrering (uden sonde aktivitet og fuld sonde aktivitet), men basal cellulær signalering gør det vanskeligt. For at eliminere behovet for endpoint kalibrering, kan SE korrigeres (CSE) for spektral overlapning af donor- og acceptor excitations- og emissions- spektre (spektral gennemblødning) og for kvanteudbytte og spektral følsomhed (QS) af de kombinerede probe fluoroforer og mikroskop billeddannelsessystem. Den korrigerede SE FRET forhold baseret på CSE definerer den observerede FRET effektiviteten af sonderne inden for hver pixel i et billede, dvs E SE = CSE / AEM. Kommerciel og fri software er tilgængelig til at korrigere SE for disse effekter oglæseren henvises til arbejdet i Chen og Periasamy 2006 for en detaljeret forklaring af de metoder, 50. Men beregning E SE kræver indfangning af tre billedfiler kanaler pr time-point (SE, QE, AEM),. Derfor, i dette arbejde beskæftiger vi også en alternativ FRET forholdet E QE = 1 - QE / cAem, som kræver indfangning af kun to billedkanaler (QE og AEM). Beregning E QE fra disse kanaler kræver kun korrigere AEM for QS (cAem = AEM x QS). QS = Dem / AEM let estimeres ved hjælp af to billeder fra den ene kalibrering prøve, hvor Dem er donor emission under donor excitation med acceptor bleget. FAP på ethvert øjeblik kan beregnes ved at sammenligne E SE eller E QE til Ei af sonden. I sidste ende bør FRET-forholdet valg (E SE = CSE / AEM vs E QE = QE / cAem) træffes på baggrund af sonden type og kanalerne med bedst signal. både enpproaches omfatter baggrundsstøj korrektion af billeder pr ramme som beskrevet ovenfor til grund for ændringer i autofluorescens over tid. De antager ingen overlapning af AEM excitation lys ind i Dem ekscitationsspektret, som det ofte er tilfældet som følge af sonde design og mikroskop filter konfiguration. Single-kæde sonder kan bruge enten og udvælgelse er baseret på bedste sonde signal (lysstyrke) til kamera støj og til baggrunden signal på SE og QE kanaler. For ICUE1 sonde og eksperimentelle her anvendte betingelser (celle- og hydrogel typer), SE har et stærkere signal end QE. Dual-kæde-prober kræver brug af E SE grund af ikke-ækvimolær fordeling af donor- og acceptor-fluoroforer. For sonder, der sænker i FRET efter binding analyt såsom ICUE1, ærgre effektivitet kan &quot;omvendt&quot; til at præsentere en positiv signalering ændring ved binding analysanden, som vi gør her, med E SE = 1 - CSE / AEM eller E QE = QE / (AEM x QS). Analyse af the FAP er følsom over for korrekt korrektion af FRET nøgletal samt til skøn over Ei. Det kan vurderes med samme kalibrering anvendte prøve til QS og en konventionel endpoint FRET effektivitet assay som Ei = 1- (QE / DEM) (QE billede efterfulgt af acceptor fotoblegning og et Dem billede) 28, men man skal være opmærksom på at minimere utilsigtet blegning af donoren. Vi beskriver en modificeret version, hvor estimatet af Dem baseret på AEM korrigeret for QS substitueres, dvs Ei = 1 - (QE / (AEM x QS)). Alternativt kan Ei = CSE / AEM anvendes. Estimering af Ei i levende celler kræver, at alle sonder blive drevet til fuld FRET. Dette er vanskeligt at opnå i praksis for sonder, såsom ICUE1 Dette fald i FRET efter binding analytten. En in vitro baseret beregning af Ei hjælp cellelysater og oprenset analyt er bedst, men uden for rammerne af dette arbejde. Her anbefaler vi at bruge 2 &#39;, 5&#39;-dideoxyadenosin at mindske cAMP i cellerne. Dog kan en relativ FAP be beregnet med en Ei estimat stammer fra baseline niveau af signalering. Af disse årsager undersøgelser rapporterer oftest FRET ratio (som gjort her) eller en slægtning FAP baseret på endpoint kalibrering, hvor signalering baseline før tilsætning agonist er den nedre grænse og signalet efter tilsætning af en anden agonist, der mætter signalering er den øvre bundet. Forskolin bruges ofte som en kontrol agonist til at mætte cAMP signal. Alternativt kan et cAMP-analog anvendes, såsom 8-Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-cyklisk monophosphat. Positive kontroller bruges ved afslutningen af ​​undersøgelser for at identificere potentielle ændringer i signalvejen blandt eksperimentelle behandlinger anbefales. Beregning af den gennemsnitlige signalering respons per celle kræver overvejelse af flere faktorer. Først bør det gennemsnitlige FRET-forholdet beregnes som gennemsnittet af forholdene for hver pixel inden for en celle, dvs. (Σ (QE/cAem)) / (antal pixel), i stedet for ratio af gennemsnittet QE og AEM i en celle, dvs. (ΣQE) / (ΣcAem). Om sidstnævnte ikke kræver omhyggelig maskering som baggrundsstøjen er lav, er det alvorligt undervurderer den sande gennemsnitlige FRET ratio. Imidlertid pixelforhold kræver floating-point beregning og omhyggelig binær maskering af celleområdet at definere ROI&#39;er og undgå indbefatningen af ​​uægte nøgletal genereret fra baggrundsstøj uden for cellen. Hele celle område skal kvantificeres for at undgå forspændingsorgan resultater på celle form. Den maskering skal måske omdefineres over tid afhængig af ændringer i celle form og migration. Alternativt kan ROIs større end cellen anvendes, hvis udelukkelseskriterier er defineret til at fjerne pixel nøgletal fra QE og AEM signaler, der falder langt under cellulære niveauer og er nær baggrundsniveauer. Den beskrevne analysemetoder detaljer de grundlæggende trin, der anvendes i dette arbejde for FRET analyse uden specialiserede software / plugins. Mikroskop fabrikanter og andre leverandører sælger tillægsmoduls for deres mikroskop software, der understøtter automatiseret ratiometrisk og FRET-analyse. Ligeledes det offentlige rum ImageJ software har flere plugins til rådighed for partikel og FRET analyse, såsom RiFRET. Sekund, pixel-baserede gennemsnitlige FRET forholdet undervurderer den sande gennemsnitlige forhold af 3D cellestruktur fordi et 2D billede bruges. 2D signaler repræsenterer og gennemsnitlige langs z-aksen. Beregning af 3D rumlige fordeling af FRET-forhold i levende celler er ikke muligt uden højhastigheds 3D imaging (f.eks. Ved hjælp af roterende skive konfokal mikroskopi). Dette er et problem for både 2D og 3D-kulturer, men har en større effekt i 3D som mere af den cellulære struktur eksisterer ud af flyet. Dette er af stor bekymring for prober, der lokaliserer til cellulære strukturer, såsom plasmamembranen EPAC1 probe PM-ICUE. Se Spiering et al. 2013 til forslag til at korrigere for tykkelse celle virkninger på forholdet beregninger 24. Analyse af fordelingen af ​​AEM kan anvendes tilopdage, hvis sonde akkumuleres i områder af cellen og billedplanet justeret. Dette vil også bidrage til at fortolke den rumlige fordeling af FRET nøgletal og fjerne falske resultater, f.eks., Identificere sonde mætning (dvs. vil en lav AEM regionen har koncentrationen lav sonde og kan udvise sonde mætning og høj FRET forhold). Det tredje forskellige FRET baselineniveauer kan indikere en forskel i transfektionseffektiviteten, sonde udtryk, eller basal signalering mellem forsøgsgrupper. &quot;Relativ Analysis&quot; (trin 10.1.1) hjælper med at fjerne afdrift i FRET forholdet over tid, hvis til stede. Det letter sammenligning af den relative størrelse af svarene mellem prøver, men hæmmer sammenligning med tidsforløbet for respons for referenceprøven (kontrol plot er en flad linje). &quot;Absolute Analysis&quot; (trin 10.1.2) letter sammenligning af hastigheden af ​​respons på tværs prøver, men hindrer sammenligning af størrelsen af ​​respons, fordi hver linje skaleres ved en dissimnende konstant. Undersøgelser bruger ofte en lineær regression på grundlinjen for at korrigere for afdrift i FRET-forholdet med tiden. Den beskrevne 3D FRET metode er en nyttig og praktisk måde at fremstille og udføre time-lapse billeddannelse af celle- lastet 3D hydrogeler, som kan anvendes til andre sonder og billeddannende modaliteter. Andre FRET-systemet udover enkeltkædede binære prober vil kræve mere komplekse korrektion af intensitet baseret signaler, som beskrevet ovenfor. Alternativt kan fluorescenslevetid billeddannelse af FRET (FLIM-FRET) anvendes til at beregne FRET effektivitet via en ændring i emission levetid af sonden donor. I modsætning til intensitet baseret FRET, FLIM-FRET er ufølsom over for baggrundsstøj, spektral gennemblødning, kvante effektivitet, og detektor spektrale følsomhed 2. Men flim systemer er dyre, komplekse og ualmindelige, og fungerer bedst med fluoroforer med enkelt eksponent henfald og ingen FLIM afstrømning 49. Den beskrevne fremgangsmåde kan også anvendes med more avancerede mikroskop platforme (f.eks., FRET-TIRF, fluorescens anisotropi, og spektral korrelation FRET). Anvendelsen af ​​denne metode til 3D-billeder med høj hastighed konfokal og multifoton mikroskopi vil lette analyse af sub-cellulære fordeling af signalering respons og øge nøjagtigheden af ​​signalering analyse. Denne 3D FRET metode vil muliggøre avancerede cellebiologiske studier i simulerede 3D cellulære mikromiljøer. Som sådan kan det let påføres farmakologi og regenerativ medicin behov, herunder studere intercellulær signalering og screening lægemiddelrespons i manipulerede hydrogel-baserede microtissues.

Cellulær signalering er både komplekse og følgeskader for mange områder, herunder farmakologi, tissue engineering, og regenerativ medicin. Nyttige testpræparater værktøjer er nødvendige for at fremme vores forståelse af cellebiologi og udvikle optimale materialer til væv regenerering. Förster resonans (FRET) billeddannelse er et vigtigt redskab, hvormed analyse af receptor-aktivering, molekylær kropsbygning, og supramolekylære interaktioner (f.eks., Protein / DNA kompleksdannelse) i levende celler. FRET er en form for ikke-radiative energioverførsel mellem fluoroforer 1. Det har en effektivitet, der er omvendt proportional med den sjette potens af afstanden mellem en donorfluorofor og acceptor fluorophor. Således kan det give oplysninger om den rumlige afstand mellem to forskellige molekyler eller på tværs regioner af et molekyle på nanometer skala (typisk 1 - 10 nm) 2. Donor- og acceptor-fluoroforer kan være forskellige molecule typer (hetero-FRET), hvor donor har højere energi emission (kortere bølgelængde) eller af samme type (homo-FRET). FRET billeddannelse kan udføres på faste eller levende celler, men generelt anvendes faste celler til billeddannelse af molekylære interaktioner med høj rumlig opløsning, når høj hastighed konfokale systemer er ikke tilgængelige. Levende celler anvendes til at studere interaktioner og processer, der inhiberes eller ændret af fiksering, såsom realtids intracellulære signalering respons 3. Levende celle undersøgelser, der beskæftiger FRET imaging brug todimensionale (2D) cellekulturer dels på grund af enkelhed og lavere baggrund (ingen emission fra ud af plane celler). Men 2D kulturer også ændre talrige cellulære processer i forhold til den fysiologiske mikromiljø og tredimensionale (3D) kultur 4,5. For eksempel er nativ celle til celle og celle til ekstracellulære matrix-interaktioner drastisk ændret i 2D kultur førte til de easily observerede ændringer i cellemorfologi og polaritet 6. Membran mikrodomæner (f.eks., Caveolae og lipidklumper) og receptor signalering er stærkt reguleret af kultur miljø, delvis fordi de binder cytoskeletale komponenter 7,8 og cellens form og cytoskelet struktur er stærkt reguleret af den rumlige kultur miljø 9. Mechanotransduction er ikke kun påvirket af 3D matrix, men af de mere komplekse sekundære belastningsforhold affødt i 3D-miljøer i forhold til 2D kulturer 10. Endelig permeabiliteten af ​​3D matricer er mindre end dyrkningsmediet, generelt med nedsat diffusion og forøget binding af celle signalering molekyler sammenlignet med 2D kulturer. Med 3D kulturer man er i stand til at skabe og observere en mikromiljø mere ligner den fysiologiske med hensyn til lim, kemiske og mekaniske signaler. Celle til celle-interaktioner kan fremmes og de klæbende egenskaber kan styres wed struktur, sammensætning og arkitektur (mønsterdannelse) af 3D materiale 11-13. De mekaniske egenskaber af materialet kan ligeledes skræddersys ved sammensætning og struktur 14,15. Dyrkning af celler i hydrogeler derfor tillader FRET undersøgelser af primære celler, der ellers ville de-differentiere eller ændring i fænotype ved anvendelse af traditionelle teknikker, f.eks., Celler fra ledbrusk. Således er der behov for en metode til at aktivere FRET assays i levende 3D kulturer. Hydrogel stilladser er ideelle til 3D FRET-baserede eksempler, fordi de kan gøres optisk transparent og tilpasset til at styre mikromiljø og tilvejebringe cellulære signaler. Hydrogeler fremstillet af naturlige polymerer er blevet anvendt i cellekultur i årtier, herunder gelatine og fibrin 16. Kan opnås større kontrol over det cellulære mikromiljø med kemisk modifikation af disse polymerer og med anvendelse af syntetiske polymerer 17,18. Hydrogel mekanisk stivhed og permeabilitet kan styres ved at ændre deres polymere sammensætning og maskestørrelse (polymer og tværbindingsdensitet) 19,20. Endvidere kan hydrogeler gøres bioaktivt ved inkorporering af vækstfaktorer og cellulære ligander. På grund af disse muligheder, udvikling af hydrogeler til biosensorer, drug delivery, og vævsdyrkningsapplikationer er en meget aktiv forskningsområde 21. 3D-print af hydrogeler er også under udvikling til fremstilling af mikro-væv og -organs 15. Således FRET billeddannelse af celler i hydrogeler er ikke kun nyttig som et middel til at tilnærme fysiologiske cellulære adfærd, men også som et værktøj til at studere og optimere manipuleret vævsvækst. Binære ratiometriske FRET-prober er meget nyttige i at studere cellulær signalering og kan anvendes i hydrogel kulturer. For en delvis liste over offentliggjorte fluorescerende og FRET sonder, se Cell Migration Consortium hjemmeside <sup&gt; 22. Den mest almindelige probe typen indeholder to forskellige fluoroforer, der er forbundet eller forbundet af en anerkendelse element (er) (analyt følsomme region). Disse regioner undergår en konformationel ændring, forening eller dissociering ved detektering af analytten (fx., Binding af en ion eller et molekyle, enzymatisk spaltning af område), som ændrer afstanden mellem fluorophorer og derfor FRET størrelsesorden (enten højere eller lavere) 23. En mindre almindelig alligevel nyttige probe typen er afhængig af en analyt følsom ændring i spektral overlapning af de to fluorophorer, som ændrer FRET størrelsesorden. &quot;Single-chain&quot; ratiometriske prober udnytte en fluorofor par forbundet på et enkelt molekyle. &quot;Dual-kæden&quot; prober udnytte fluoroforen par på separate molekyler, men deres ekspression kan kobles under samme ekspressionskassette 24. I modsætning til undersøgelser med enkelt fluorophor udtryk (f.eks., Fluorescerende fusion proteiner), undersøgelser med ratiometriskFRET prober kræver ikke dobbelt transfektion til kontrol for transfektionseffektivitet eller cellelevedygtighed. Ratiometrisk FRET sonder er relativt ufølsomme over for transfektion effektivitet, når udtrykkes over en minimumstærskel (koncentration ufølsom) 23,25. De er ufølsomme over for excitation source svingninger og andre intracellulære miljø faktorer (f.eks., PH, ioner) så længe begge fluoroforer er ligeledes reagerer. Desuden deres svar er ikke underlagt transkriptionel forsinkelse, i modsætning til fluorescerende og selvlysende promotor-reporter konstruerer 26,27. Ratiometrisk FRET prober let og hyppigt anvendt i konventionelle Vidvinklet epifluorescensmikroskop systemer. Vidvinklet mikroskoper er foretrukket frem for linje scanning konfokale systemer til levende celler på grund af bekymringer over systemets omkostninger, fluorophor blegning, og erobringen af ​​signal ændringer med tilstrækkelig tidsmæssig opløsning. Derudover enkelt celle analysis over en stor population af celler er muligt med et motoriseret trin og billedoptagelse over flere synsfelter. Vidvinklet mikroskopi kræver intensitet baseret analyse af hetero-FRET probesignaler. Selvom intensitet analyse ikke kræver kompliceret hardware som andre FRET metoder, er mere post-erhvervelse arbejde for at korrigere for virkningerne af fluoroforen adfærd og mikroskop / imaging systemkonfigurationer 28. Det optagne emissionsintensitet en fluorofor er en funktion af excitationsenergi, fluorophor kvanteudbytte, og det kombinerede filter og kamera / detektor spektral følsomhed og linearitet 2. Disse kan være forskellig for donoren og acceptor og vil kræve kalibrering for kvantitativ analyse. Desuden er billeddannelse af acceptor emission påvirket af spektral overlapning af de fluoroforer (excitation af acceptoren ved donor excitationslys og gennemblødning af donor emission til acceptor emissionsspektrene) 2.4, Single-kæden &quot;sonder er internt normaliseret, fordi deres fluoroforer er ækvimolær på nanoskala, mens fluoroforer af&quot; dual-kæden &quot;prober kan eksistere på forskellige støkiometrier hele en celle 25,28 Hvis fluoroforer af.&quot; Single-chain &quot; prober er af tilsvarende lysstyrke (funktion af ekstinktionskoefficienten og kvantumudbytte), virkningerne af ikke-lineære detektor følsomhed er lille og kun korrektion for baggrundsfluorescens og det koblede kvanteudbytte / detektor følsomhed er behov 23. således &quot;single-chain&quot; ratiometrisk FRET sonder lettest implementeret i Vidvinklet mikroskopi 24. Dette papir beskriver en enkel teknik til at udføre FRET billeddannelse af levende celler i 3D-hydrogel kulturer ved hjælp af en konventionel Vidvinklet epifluorescensmikroskop. Det kan let vedtaget af laboratorier allerede udfører FRET eksperimenter i 2D, samt laboratorier interesseret i intercellulær signalering i microtissues. Her demonstrerer vi metoden med FRET billeddannelse baseret måling af cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) niveauer i levende chondrocytter inden fotokrydsbinding (PC-gel, polyethylenglycol-dimethacrylat) og termoresponsiv (TR-gel, Matrigel) hydrogeler. En ratiometrisk FRET probe anvendes baseret på EPAC1 (ICUE1) for at detektere cAMP-niveauer som respons på forskolin, en kemisk agonist til adenylylcyclase, der katalyserer omdannelsen af ​​ATP til cAMP. cAMP er en af ​​de vigtigste sekundære budbringere medierer G-protein-koblet receptor signalering og det aktiverer forskellige faktorer, herunder downstream exchange proteiner direkte aktiveres af cAMP (EPACs). Fluoroforerne sig fra hinanden ved cAMP-binding til EPAC domæne resulterer i et fald i FRET. Beskrevet her er fremstillingen af ​​hydrogelmaterialer, celletransfektion med ICUE1 probe og indlejring af cellerne i 3D hydrogeler. eksperiment procedure 3D FRET og billedet analyse nødvendigat evaluere probe aktivitet per celle er forklaret. Vi diskuterer også de iboende begrænsninger FRET analyse i 2D og 3D ved hjælp Widefield mikroskopi. Teknikken præsenteres her, er en forbedring i forhold til eksisterende 2D metoder, da det gør det muligt analyse i et mere fysiologisk kontekst og kræver mindre billedkorrektion og kalibrering. Stor anvendelighed ligger i det faktum, at mange transparente materialer kan bruges, mens celle- og transfektion præferencer kan opretholdes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td>
			<td style="width:119px;">NC0162601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM)</td>
			<td style="width:71px;">Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95904</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6514</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">3-glycidoxypropyltrimethoxysilane</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">440167</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">149470-5g</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC244280100</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC149670010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC199871000</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">190764</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sigmacote (siliconizing reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">SL2</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Toluene&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC36441-0010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH3025601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11058-021</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cellstripper (cell dissociation solution)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-056-CI</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Forskolin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipette Tips (10,200,1000 &#956;l)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-149-863B</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">01-213-100</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Biopsy punch (3 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">3332</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544C</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precoated glass coverslips (epoxysilane)</td>
			<td style="width:71px;">Arrayit</td>
			<td style="width:119px;">CCSL</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass slide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12550D</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile vials (15 mL, 50 ml conical)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-70C, 14-959-49A</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish (6-well)</td>
			<td style="width:71px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351146</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Epifluorescent Microscope with motorized stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Adjustable Specimen Holder for XY Stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">77011393</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MRD01605</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source &#38; wheel, Lambda emission filter system)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Sutter Instrument reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77016231, 77016088</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">CYF/YFP filter set</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Chroma Technology Corp)</td>
			<td style="width:119px;">77014928</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:216px;">Camera (ORCA Flash 4.0 v1)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Hamamatsu reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77054076</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab-equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">NIS-Elements 40.20.02 microscope software)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MQS31100&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Prism (spreadsheet and graphing software)</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software, Inc</td>
			<td style="width:119px;">Version 6</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (&#955;=365 or 405)</td>
			<td style="width:71px;">OmniCure</td>
			<td style="width:119px;">S1000</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pipette Aid&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DP-100</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:71px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Reichert Bright-Line 1475</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vacuum desiccator chamber/degasser&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Chemical Fume Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Oven</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Spatula</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fret imaging in three-dimensional hydrogels

Imaging af Förster resonans (FRET) er et kraftfuldt værktøj til at undersøge cellebiologi i real-tid. Forsøg med FRET almindeligt ansætte todimensional (2D) kultur, som ikke efterligner den tredimensionale (3D) cellulære mikromiljø. En metode til at udføre standset emission FRET billeddannelse under anvendelse af konventionel Vidvinklet epifluorescensmikroskopi af celler i en 3D hydrogel miljø præsenteres. Her beskrives en analysemetode til ratiometriske FRET sonder, der giver lineære nøgletal over sonden aktivering rækkevidde. Måling af intracellulær cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) niveauer er påvist i chondrocytter under forskolin-stimulering under anvendelse af en probe for EPAC1 aktivering (ICUE1) og evnen til at detektere forskelle i cAMP signaling afhængige af hydrogelmateriale type, heri en fototværbinding hydrogel (PC-gel, polyethylenglycoldimethacrylat) og en termoresponsiv hydrogel (TR-gel). Sammenlignet med 2D FRET metoder,denne metode kræver lidt ekstra arbejde. Laboratorier allerede udnytter FRET billeddannelse i 2D kan nemt vedtage denne metode til at udføre cellulære studier i en 3D mikromiljø. Det kan endvidere anvendes til high throughput lægemiddel-screening i manipuleret 3D microtissues. Desuden er det kompatibelt med andre former for FRET billeddannelse, såsom anisotropi måling og fluorescens levetid imaging (FLIM), og med avancerede mikroskopi platforme ved hjælp af konfokal, pulserende eller moduleret belysning.

Alle hydrogelmaterialer forstadier, celler og støbeforme blev fremstillet som beskrevet ovenfor. Cellen lastet precursor-opløsningerne blev støbt i PDMS forme og derefter centrifugeret før gelering / fototværbinding at immobilisere celler nær dækglasset og lette FRET billeddannelse analyse (figur 1). Hydrogelerne med vedhæftede dækglas blev anbragt inden forberedte PDMS billeddannende brønde til mikroskopisk billeddannelse (figur 2). De optiske konfigurationer og billedoptagelse parametre blev derefter indstillet som vist i figur 3A. Capture af alle fire FRET relateret billede kanaler for FFP-YFP fluoroforen par demonstreres (se under &quot;Optisk Conf.&quot; I figur 3), som er nødvendig for ikke-binære sonder. Men i dette arbejde kræves kun to billeder for enkelt kæde binære ICUE1 sonde, QE = &quot;FFP FFP&quot; og AEM = &quot;YFP YFP&quot; (excitation emission). Multiple FOVs (xy positions) blev udvalgt, hvor flere celler boede i den homogene belysning område (figur 3B). Efter tid bortfalder erhvervelse, blev signalet data for sonden eksporteres. ROI&#39;er til baggrund korrektion af kanalsignaler og for celleanalyse blev betegnet under anvendelse tærsklingsbehandlede AEM billeder fra starten af eksperimenterne (figur 4). Celler blev udvalgt blandt cellen puljen som dem, der udtrykker tilstrækkelig (ikke for dim), men ikke for høj (overdrevent lyst) probe (figur 4B). QE og SE FRET nøgletal per pixel på hver købet blev beregnet ved hjælp af floating-point opdeling af baggrunden trækkes billedkanaler. Det gennemsnitlige FRET forholdet per celle (dvs. pr ROI) blev beregnet, normaliseret til baseline signal forud for stimulation (dvs. en regression på basislinien trækkes fra alle tidspunkter), og plottet med fejlsøjler som standard fejl af mean (SEM). Både QE og CSE baseret FRET nøgletal detect den øgede cAMP aktivitet i chondrocytter under forskolin-stimulering (100 nM, Figur 5). QE FRET forholdet var mere følsom over for baggrund korrektion end CSE FRET-forholdet, fordi QE signalet var lavere på grund af det lave basale niveau af cAMP aktivitet i chondrocytter indlejret i hydrogelerne. Begge hydrogel typer (TR-gel og PC-gel) viste en stigning i FRET-forhold over tid (figur 6), hvilket indikerer en forøget cAMP signalering respons på tilsætningen af forskolin. Som angivet af QE FRET ratio, chondrocytter i PC-gel hydrogeler udviser en større ændring i cAMP (vist) og en højere basalt niveau af cAMP (E QE = 0,19 i PC-gel vs. E QE = 0,09 i TR-gel, ikke vist i baseline fratrukket figur). <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> Figur 1: Cell Distribution i fotokrydsbundet Hydrogel (PC-gel) </strong&gt; A: Cellen lastet hydrogel precursor blev centrifugeret for at maksimere antallet af celler ved en fokalplan nær dækglasset. B: Dette forøger antallet af celler i FOV og minimerer baggrundssignal fra ud af plane celler. (Scale bar = 200 um) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> Figur 2: Hydrogel i PDMS Dish Hydrogelen blev anbragt indvendigt i et tall PDMS brønd (10x volumen af ​​hydrogel) med et dækglas base for mikroskopisk billeddannelse og analyt stimulation. De PC-gel hydrogeler er gennemsigtige og bundet til dækglasset, så de forbliver på plads i hele analysen. PDMS godt kan gøres større for at indeholde 10x mere medium end hydrogel volumen under anvendelse af en bredere biopsitang foruden påhicker PDMS ark. (Skala bar = 2 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> Figur 3: Køb konfiguration for FRET Imaging A: Købet blev konfigureret til billedoptagelse hver 7 sek på flere steder. For QE FRET-forholdet beregning, er der behov for kun to billedkanaler for den anvendte her ICUE1 sonde (binær enkelt kæde probe), QE = &quot;FFP FFP&quot; og AEM = &quot;YFP YFP&quot; (excitation emission) under &quot;Optisk Conf.&quot; kolonne i fanen λ af mikroskopet software. B: FOVs ( &quot;XY&quot; positioner) blev udvalgt, hvor flere celler boede inden for det homogene belysning område. Plottet under billedet viser belysningen intensitet langs blå pile linjeder krydser gennem midten af den FOV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> Figur 4: Valg af ROI&#39;er for FRET Imaging Analysis A: En region af interesse (ROI) fri af celler blev udvalgt til at korrigere for baggrundssignal på hver kanal. Et billede af en cellefri hydrogel kan i stedet bruges til baggrund subtraktion hvis celletæthed eller migration er høj, eller hvis en skygge maske ikke bruges, når cellerne ikke ligger inden for et homogent feltbelysning. B: Cellen ROI&#39;er blev udvalgt under anvendelse billede tærskling og binær maskering af AEM kanal. Valg af en ROI større end cellerne vil påvirke beregningen af ​​den gennemsnitlige FRET forholdet per celle på grund af inddragelse af ekstracellulære nøgletal genereret fra baggrunden nOise. Beregning af den cellulære FRET forholdet ved hjælp af gennemsnittet for hver kanal per celle anbefales ikke, da dette undervurderer forholdet. (Scale bar = 50 um) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> Figur 5: Sammenligning af FRET nøgletal i termoresponsiv Hydrogel (TR-gel) Både QE og SE baserede FRET nøgletal detektere den forøgede cAMP aktivitet i chondrocytter under forskolin-stimulering. Forskolin er en adenylcyclase agonist, der inducerer cAMP-produktion. FRET falder, når ICUE1 proben binder cAMP, og dermed QE FRET ratio (E QE = SQE / (SAEM x QS)) stiger. Omvendt falder SE FRET-forholdet og er derfor afbildet som E SE = 1 - CSE / SAEM. I hydrogel indlejret chondrocytter, QE FRET-forholdet er mere følsomme over for baggrund korrektion end SE FRET-forholdet, fordi QE signal er lav på grund af den lave basale cAMP-aktivitet. Fejl barer = SEM, n = 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> Figur 6: Sammenligning af FRET Ratio i forskellige Hydrogeler Chondrocytterne i begge hydrogel typer reagerede på forskolin stimulering med en stigning i cAMP-aktivitet som demonstreret ved den øgede QE FRET-forhold over tid. Hydrogelen typen påvirker cellulære respons gennem flere effekter, herunder forskelle i permeabilitet for forskolin og i basal cellulær cAMP-aktivitet (E QE = 0,19 i PC-gel vs. E QE = 0,09 i TR-gel, ikke vist). Fejllinjer = SEM, n for TR-gel= 25, n til PC-gel = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Förster resonans (FRET) imaging er et kraftfuldt værktøj til realtid cellebiologiske undersøgelser. Her en fremgangsmåde til FRET billeddannelse celler i fysiologiske tredimensionale (3D) hydrogel mikromiljøer anvendelse af traditionel epifluorescensmikroskopi præsenteres. En analyse for ratiometriske FRET sonder, der giver lineære nøgletal over aktiveringen sortiment er beskrevet.

FRET Imaging i Tre-dimensionelle Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Et analyseværktøj, der kvantificerer cellemorfologi Ændringer fra Tredimensionelle fluorescensbilleder

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

To-og tre-dimensionelle Live-Cell Imaging af DNA skade responset Proteiner

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mus Føtal Hele Tarm Kultur System for<em&gt; Ex vivo</em&gt; Manipulation af signaleringsforløb og Tre-dimensionel Live-Imaging af Villus Udvikling

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-klar: En væv Clearing metode til tredimensional billeddannelse af fedtvæv

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Encellet opløsning tredimensionel billeddannelse af intakte organoider

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Proteolytisk nedbrudt alginathydrgels og hydrofobe mikrobioreaktorer til Porcine Oocyt Indkapsling

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Farvning og billeddannelse i høj opløsning af tredimensionelle organoid- og sfæroidmodeller

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...