Name: fret imaging in three-dimensional hydrogels
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

המחברים מודים על התמיכה הכספית של בית הספר לרפואת שיניים באוניברסיטת פיטסבורג, ה- National Institutes of Health בפרס K01 AR062598, ו DE030740 P30 מענק. המחברים גם להודות לד&quot;ר ג&#39;ין ג&#39;אנג עבור פלסמיד ICUE1, וויין Rasband לפיתוח ImageJ ומיכאל Cammer עבור מאקרו ImageJ.

The authors have no conflicts to declare.

איתות הסלולר הוא גם מורכב תוצאתיים עבור בתחומים רבים, כולל פרמקולוגיה, הנדסת רקמות, ורפואה רגנרטיבית. כלים מחקריים שימושיים נדרשים כדי לקדם את ההבנה שלנו של ביולוגיה של התא לפתח חומרים אופטימלי לשחזור רקמות. הדמית תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) היא כלי חיוני המאפשר ניתוח של הפעלת קולטן, קונפורמציה מולקולרית, ואינטראקציות מולקולריות (למשל., חלבון / DNA complexation) בתאים חיים. סריג הוא סוג של העברת אנרגיה הלא מקרין בין fluorophores 1. יש לו יעיל כי הוא ביחס הפוך הכח שישית של המרחק בין fluorophore תורם fluorophore acceptor. לשם כך היא יכולה לספק מידע על המרחק הפיסי בין שתי מולקולות שונות או בין אזורים של מולקולה אחת על בקנה מידה ננומטרי (בדרך כלל 1 - 10 ננומטר) 2. Fluorophores התורם acceptor עשוי להיות מ שונהסוגי olecule (סריג הטרו), שבו יש לתורם פליטת האנרגיה הגבוהה יותר (אורך גל קצר יותר), או מאותו הסוג (הומו-סריג). הדמית סריג יכולה להתבצע על תאים קבועים או לחיות, אבל באופן כללי תאים קבועים משמשים הדמיה של אינטראקציות מולקולריות ברזולוציה מרחבית גבוהה כאשר מערכות confocal במהירות גבוהה אינן זמינות. תאי חיים משמשים כדי לחקור אינטראקציות ותהליכים מעוכבים או הוחלפו על ידי קיבוע, כגון תאיים בזמן אמת איתות בתגובה 3. מחקרי תא חיים מעסיקות סריג שימוש הדמיה דו ממדים (2D) תרבויות הסלולר בין שאר בשל פשטות רקע נמוך (לא פליטה מחוץ תאי מטוס). עם זאת, תרבויות 2D גם לשנות תהליכים תאיים רבים לעומת במיקרו-סביבה של פיזיולוגי תלת ממדי (3D) תרבות 4,5. לדוגמה, תא יליד תא ותא לאינטראקציות מטריקס הם שינו באופן דרסטי בתרבות 2D המוביל EASily נצפה שינויים במורפולוגיה תא קוטבי 6. Microdomains ממברנה (למשל., Caveolae ודוברות שומנים בדם) ואיתות קולטן מוסדר במידה רבה על ידי סביבת התרבות, בין שאר משום שהם לאגד רכיבי cytoskeletal 7,8 ואת מבנה צורת cytoskeletal תא מוסדרים במידה רבה על ידי סביבת התרבות מרחבית 9. Mechanotransduction אינה מושפעת רק על ידי מטריקס 3D, אלא על ידי תנאי הטעינה משני המורכבים יותר הולידה בסביבות 3D בהשוואה לתרבויות 2D 10. לבסוף, את החדירות של מטריצות 3D היא פחות מדיום התרבות, בכלל עם ירידת דיפוזיה מוגברת עקדת תא מולקולות איתות בהשוואה לתרבויות 2D. עם תרבויות 3D אחד הוא מסוגל ליצור וצפה microenvironment דומה יותר הפיזיולוגי ביחס דבק, כימי, רמזים מכאניים. תא אינטראקציות תא ניתן לקדם את מאפייני ההדבקה ניתן לשלוט wה- i מבנה, רכב, והאדריכלות (דפוסים) של חומר 3D 11-13. התכונות המכאניות של החומר ניתן להתאים גם על ידי 14,15 הרכב והמבנה. Culturing תאים הידרוג ולכן היתרי סריג מחקרים על תאים ראשוניים שאחרת דה להבדיל או שינוי פנוטיפ באמצעות טכניקות קונבנציונליות, למשל., תאי סחוס במפרק. לפיכך, שיטה נדרשה כדי לאפשר מבחני סריג בתרבויות 3D לחיות. פיגומים הידרוג&#39;ל הם אידיאליים עבור מחקרים המבוססים 3D סריג כי הם יכולים להיעשות אופטיים שקופים ומותאמים לשלוט microenvironment ולספק רמזים הסלולר. הידרוג עשוי פולימרים טבעיים שמש תרבית תאים במשך עשרות שנים, כוללים ג&#39;לטין הפיברין 16. שליטה רבה יותר על המיקרו-סביבה הסלולר ניתן להשיג עם שינוי כימי של פולימרים אלו ועם השימוש בפולימרים סינתטיים 17,18. hydrogel נוקשות מכנית וחדירות יכול להיות נשלט על ידי שינוי המבנה פולימריות שלהם ואת רשת גודל (פולימר וצפיפות crosslink) 19,20. יתר על כן, ניתן לבצע הידרוג ביו, באמצעות שילוב של גורמי גדילה הליגנדים הסלולר. בגלל האפשרויות הללו, ההתפתחות הידרוג עבור biosensing, אספקת סמים, ויישומי הנדסת רקמות היא אזור מאוד פעיל של מחקר 21. הדפסה של הידרוג 3D גם עוברת פיתוח עבור ייצור של רקמות מיקרו -organs 15. לפיכך, סריג הדמיה של תאים הידרוג הוא לא רק שימושי כאמצעי משוער התנהגות הסלולר פיזיולוגי, אלא גם ככלי ללמוד לייעל צמיחה רקמות מהונדסות. בדיקות סריג ratiometric בינארי הן מאוד שימושיות בלימוד איתות הסלולר יכולות להיות מנוצלות בתרבויות הידרוג&#39;ל. לקבלת רשימה חלקית של פלורסנט שפורסמו סריג בדיקות, ראה באתר Consortium נדידת תאים <sup&gt; 22. סוג בדיקה הנפוץ ביותר מכיל שני fluorophores שונים הקשורים או מקושרים על ידי אלמנט הכרה (ים) (אזור רגיש אנליטי). אזורים אלה לעבור שינוי קונפורמציה, עמותה או התנערות על זיהוי של אנליטי (למשל., עקדת יון או מולקולה, מחשוף האנזימטית של האזור), שמשנה את המרחק בין fluorophores ולכן גודל הסריג (לחיוב או לשלילה) 23. סימן פחות סוג בדיקה נפוץ עדיין שימושי מסתמך על שינוי אנליטי רגיש חפיפה ספקטרלית של שני fluorophores, אשר משנה גודל סריג. &quot;Single-שרשרת&quot; בדיקות ratiometric לנצל זוג fluorophore צמוד על מולקולה בודדת. &quot;Dual-שרשרת&quot; בדיקות לנצל זוגות fluorophore על מולקולות נפרדות, אך הביטוי שלהם ניתן בשילוב באותם קלטת ביטוי 24. בשונה ממחקרים עם ביטוי fluorophore היחיד (למשל., חלבוני היתוך ניאון), מחקרים עם ratiometricבדיקות סריג אינם דורשים transfection כפול לשלוט ליעילות transfection או כדאיות התא. בדיקות ratiometric סריג הם רגישים יחסית יעילות transfection כאשר הביעו מעל סף מינימום (ריכוז רגיש) 23,25. הם אינם רגישים לתנודות מקור עירור וגורם סביבה תאית אחרים (למשל., PH, יונים) כל עוד שני fluorophores מגיב באופן דומה. בנוסף, התגובה שלהם אינה כפופה עיכוב תעתיק, בניגוד פלורסנט אמרגן-כתב bioluminescent בונה 26,27. בדיקות ratiometric סריג הן בקלות מועסקת לעתים קרובות במערכות מיקרוסקופ קונבנציונליות widefield epifluorescence. מיקרוסקופי widefield עדיפים על פני מערכות confocal סריקת קו הדמית תא חייה בגלל חשש עלות מערכת, הלבנת fluorophore, ואת כיבושה שינויי אות עם רזולוציה של זמן מספיק. בנוסף, אנאלי תא בודדיסיס על אוכלוסייה גדולה של תאים אפשרי עם לכידת במה ותמונה ממונעת מעל שדות מרובים של נוף. מיקרוסקופיה widefield דורשת ניתוח מבוסס עוצמת האותות החלליים הטרו-הסריג. למרות ניתוח עוצם אינו דורש חומרה מורכבת כמו שיטות סריג אחרות, יותר עבודה שלאחר רכישה יש צורך לתקן את ההשפעות של התנהגויות fluorophore ותצורות מערכת מיקרוסקופ / הדמיה 28. עוצמת פליטת בשבי של fluorophore היא פונקציה של אנרגית העירור, Fluorophore תשואה קוונטית, ואת המסנן המשולב מצלמה / רגישות ספקטרלית גלאי ליניאריות 2. אלה עשויים להיות שונים עבור התורם acceptor ידרוש כיול עבור ניתוח כמותי. בנוסף, הדמיה של פליטת acceptor מושפעת חפיפה ספקטרלית של fluorophores (עירור של acceptor ידי אור עירור התורם לדמם דרך של פליטת התורם לתוך ספקטרום פליטה acceptor) 2.4; Single-שרשרת &quot;בדיקות הן פנימי מנורמל כי fluorophores שלהם הם equimolar ב הננומטרי, בעוד fluorophores של&quot; כפול שרשרת &quot;חלליות יכולה להתקיים בבית stoichiometries שונים ברחבי תא 25,28 אם fluorophores של.&quot; שרשרת אחת &quot; בדיקות הן של בהירות דומה (פונקציה של מקדם הכחדה ואת תשואת קוונטים), את ההשפעות של רגישות גלאי שאינו ליניארי הן תיקון קטן ורק עבור הקרינה רקע ואת רגישות תשואה / גלאי קוונטים המצמידים נדרשת 23. לפיכך &quot;חד שרשרת&quot; בדיקות ratiometric סריג מיושמות ביותר בקלות במיקרוסקופ widefield 24. מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה לבצע הדמיה סריג של תאים חיים בתרבויות הידרוג&#39;ל 3D באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent widefield קונבנציונאלי. זה יכול לאמץ בקלות על ידי מעבדות כבר בביצוע ניסויי סריג ב 2D, כמו גם מעבדות מעוניינות היתראיתות הסלולר microtissues. כאן אנו מדגימים את השיטה עם מדידה מבוססת הדמית סריג של monophosphate אדנוזין המחזורי (cAMP) רמות chondrocytes חי בתוך photocrosslinking (PC-ג&#39;ל, dimethacrylate פוליאתילן גליקול) ו thermoresponsive (TR-ג&#39;ל, Matrigel) הידרוג. בדיקת סריג ratiometric נוצל מבוסס על EPAC1 (ICUE1) כדי לזהות רמות cAMP בתגובת forskolin, אגוניסט כימי cyclase adenylyl אשר מזרז את ההמרה של ה- ATP ל cAMP. מחנה הוא אחד השליחים השניים העיקריים בתיווך איתות קולטן המצומד לחלבון G וזה מפעיל גורמים שונים, כוללים חלבוני חליפין במורד זרם מופעלים ישירות על ידי cAMP (EPACs). Fluorophores מתרחק על cAMP מחייב את תחום EPAC וכתוצאה מכך ירידת הסריג. המתואר כאן הוא הכנת החומרים הידרוג&#39;ל, transfection התא עם החללית ICUE1, והטבעה של התאים הידרוג 3D. הליך ניסוי 3D הסריג ועל ניתוח התמונה הכרחילשם הערכת פעילות חללית לכל תא מוסברת. כמו כן נדונו ולמגבלות של ניתוח הסריג ב 2 ד ו 3D באמצעות מיקרוסקופ widefield. הטכניקה המוצגת כאן היא שיפור לעומת השיטות 2D הקיימים מאז שהוא מאפשר ניתוח בהקשר פיזיולוגי יותר ודורש תיקון תמונה פחות וכיול. שירות גדול טמון בעובדה כי חומרים שקופים רבים ניתן להשתמש בם תוך העדפות תא transfection יכולות להישמר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td>
			<td style="width:119px;">NC0162601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM)</td>
			<td style="width:71px;">Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95904</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6514</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">3-glycidoxypropyltrimethoxysilane</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">440167</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">149470-5g</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC244280100</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC149670010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC199871000</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">190764</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sigmacote (siliconizing reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">SL2</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Toluene&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC36441-0010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH3025601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11058-021</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cellstripper (cell dissociation solution)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-056-CI</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Forskolin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipette Tips (10,200,1000 &#956;l)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-149-863B</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">01-213-100</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Biopsy punch (3 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">3332</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544C</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precoated glass coverslips (epoxysilane)</td>
			<td style="width:71px;">Arrayit</td>
			<td style="width:119px;">CCSL</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass slide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12550D</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile vials (15 mL, 50 ml conical)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-70C, 14-959-49A</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish (6-well)</td>
			<td style="width:71px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351146</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Epifluorescent Microscope with motorized stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Adjustable Specimen Holder for XY Stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">77011393</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MRD01605</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source &#38; wheel, Lambda emission filter system)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Sutter Instrument reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77016231, 77016088</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">CYF/YFP filter set</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Chroma Technology Corp)</td>
			<td style="width:119px;">77014928</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:216px;">Camera (ORCA Flash 4.0 v1)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Hamamatsu reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77054076</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab-equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">NIS-Elements 40.20.02 microscope software)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MQS31100&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Prism (spreadsheet and graphing software)</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software, Inc</td>
			<td style="width:119px;">Version 6</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (&#955;=365 or 405)</td>
			<td style="width:71px;">OmniCure</td>
			<td style="width:119px;">S1000</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pipette Aid&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DP-100</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:71px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Reichert Bright-Line 1475</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vacuum desiccator chamber/degasser&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Chemical Fume Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Oven</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Spatula</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fret imaging in three-dimensional hydrogels

הדמיה של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) הוא כלי רב עוצמה לבחינת ביולוגיה של התא בזמן אמת. מחקרים ניצול סריג נפוץ להעסיק דו מימדי (2D) תרבות, אשר אינו לחקות את microenvironment הסלולר תלת ממדי (3D). שיטה לבצע הדמיה רווה פליטת סריג באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונלי widefield epifluorescence של תאים בתוך סביבת הידרוג&#39;ל 3D מוצגת. הנה שיטה לניתוח עבור בדיקות סריג ratiometric מניב יחסי ליניארי על פני טווח הפעלת בדיקה מתוארת. מדידת רמות monophosphate אדנוזין מחזורית התאית (cAMP) מודגמת chondrocytes תחת גירוי forskolin באמצעות בדיקה עבור EPAC1 הפעלה (ICUE1) ואת היכולת לזהות הבדלי cAMP איתות תלוי בסוג החומר הידרוג&#39;ל, בזאת הידרוג photocrosslinking (ג&#39;ל PC, פוליאתילן גליקול dimethacrylate) וכן הידרוג&#39;ל thermoresponsive (TR-ג&#39;ל). בהשוואה לשיטות 2D סריג,שיטה זו דורשת עבודה נוספת קטנה. מעבדות כבר ניצול הדמיה סריג ב 2D יכול בקלות לאמץ שיטה זו לבצע מחקרים הסלולר בתוך microenvironment 3D. זה יכול להיות מיושם נוסף הקרנת סמי תפוקה גבוהה ב microtissues 3D המהונדס. בנוסף, זה תואם עם צורות אחרות של הדמית סריג, כגון מדידת אנאיזוטרופיה והדמית חי קרינה (FLIM), ועם פלטפורמות מיקרוסקופיה מתקדמות באמצעות confocal, פעם, או תאורה מווסתת.

כל מבשרי הידרוג&#39;ל, תאים, תבניות יציקה הוכנו כפי שתואר לעיל. הפתרונות מבשר תא עמוס שנוצקו בתבניות PDMS ולאחר מכן centrifuged לפני gelation / photocrosslinking לשתק תאי ליד coverslip ולהקל סריג ניתוח הדמיה (איור 1). את הידרוג עם coverslips המצורפת הושם בתוך בארות הדמית PDMS מוכנות הדמיה מיקרוסקופית (איור 2). התצורות אופטי ופרמטרים רכישת התמונה שנקבעו אז כפי שמוצג באיור 3 א. לכידה של כל ערוצי תמונת הארבעה הקשורים סריג עבור זוגות fluorophore CFP-YFP מודגמת (ראה תחת &quot;Conf האופטי.&quot; באיור 3), כפי שנדרש עבור בדיקות לא בינאריות. עם זאת בעבודה זו רק שתי תמונות נדרשות עבור חללית ICUE1 בינארי שרשרת האחת, QE = &quot;CFP CFP&quot; ו AEM = &quot;YFP YFP&quot; (פליטת עירור). FOVs המרובה (מיקום XYים) נבחרו שבו מספר תאים התגוררו בתחומי שטח התאורה הומוגנית (איור 3 ב). לאחר רכישת הזמן לשגות, נתוני האות החללית יוצאים. ROIs לתיקון רקע של אותות ערוץ לניתוח תא יועדו באמצעות תמונות AEM thresholded מההתחלה של הניסויים (איור 4). תאים נבחרו מקרב ברכת התא כמו המביעים מספיק (לא יותר מדי עמום), אבל לא גבוה מדי בדיקה (בהירה מדי) (איור 4 ב). יחסי QE ו SE סריג לפיקסל בכל רכישה חושבו באמצעות חלוקת נקודה צפה של ערוצי התמונה מופחתים ברקע. יחס הסריג הממוצע לכל תא (כלומר, לכל ROI) חושב, מנורמל אות הבסיס לפני הגירוי (כלומר, נסיגה על קו הבסיס מופחת כל נקודות הזמן), ו זמם עם ברי שגיאה כטעות התקן של אומר (SEM). שניהם יחסי סריג דה QE ו CSE מבוססtect פעילות cAMP המוגברת chondrocytes תחת גירוי forskolin (100 ננומטר, איור 5). יחס סריג QE היה רגיש יותר תיקון רקע מייחס CSE הסריג כי את אות QE הייתה נמוכה בשל רמת בסיס פעילות הנמוכה מחנה chondrocytes מוטבע בתוך הידרוג. שני הסוגים הידרוג&#39;ל (TR-ג&#39;ל ג&#39;ל PC) הראו עלייה יחס סריג לאורך זמן (איור 6), מה שמעיד על תגובה איתות cAMP עלה ל תוספת של Forskolin. כפי שצוין על ידי יחס סריג QE, chondrocytes ב הידרוג ג&#39;ל PC להראות שינוי גדול יותר cAMP (מוצג) ורמת בסיס גבוהה של cAMP (E QE = 0.19 ג&#39;ל PC לעומת E QE = 0.09 ב TR-ג&#39;ל, לא מוצג באיור בסיס מופחת). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> איור 1: חלוקת התא ב Photocrosslinked הידרוג&#39;ל (PC-ג&#39;ל) </strong&gt; ת: מבשר הידרוג&#39;ל עמוס התא centrifuged כדי למקסם את מספר התאים בכל מישור המוקד ליד coverslip. B: זה מגדיל את מספר תאי FOV וממזער אות רקע מחוץ תאי מטוס. (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> איור 2: הידרוג&#39;ל בצלחת PDMS הידרוג הוצב בתוך PDMS גבוה היטב (10x היקף הידרוג&#39;ל) עם בסיס coverslip הדמיה מיקרוסקופית וגירוי אנליטי. הידרוג PC-ג&#39;ל שקוף מלוכד אל coverslip כך הם נשארים במקום לאורך כל assay. את PDMS גם יכול להתבצע גדול להכיל בינוני 10x יותר מאשר נפח הידרוג&#39;ל באמצעות אגרוף ביופסיה רחב יותר בנוסף עלגיליון hicker PDMS. (סרגל קנה מידה = 2 מ&quot;מ) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> איור 3: תצורת רכישת הדמית הסריג ת: הרכישה הוגדרה עבור לכידת תמונה כל 7 שניות במקומות מרובים. בחישוב יחס QE סריג, רק שני ערוצים תמונה נדרשים החללית ICUE1 משמש כאן (בדיקה שרשרת אחת בינארי), QE = &quot;CFP CFP&quot; ו AEM = &quot;YFP YFP&quot; (פליטת עירור) תחת &quot;Conf אופטי.&quot; עמודות בכרטיסייה λ של תוכנת מיקרוסקופ. B: FOVs ( &quot;XY&quot; עמדות) נבחרו שבו מספר תאים התגוררו בתחומי השטח תאורה הומוגנית. העלילה מתחת לתמונה מראה את עוצמת התאורה לאורך הכחול מחודדת קושחוצה דרך המרכז של FOV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> איור 4: מבחר ROIs עבור ניתוח הדמיה סריג ת: אזור של (ROI) הריבית חסר תאים נבחר לתקן אות רקע על כל ערוץ. דמות של הידרוג&#39;ל תא ללא עשויה במקום לשמש רקע חיסור אם צפיפות או נדידת תאים היא גבוהה, או אם מסכת הצללה אינה משמשת כאשר תאים לא משקרים בתוך שדה תאורה הומוגנית. B: ROIs תא נבחרו באמצעות thresholding התמונה מיסוך בינארי של ערוץ AEM. בחירת ROI גדול יותר תאים ישפיע לרעה חישוב יחס סריג הממוצע לכל תא בשל הכללת יחסי תאיים המופק n רקעoise. חישוב יחס הסלולר סריג באמצעות הממוצע של כל ערוץ לכל תא אינה מומלצת מכיוון שהדבר אינו מעריך נכון את היחס. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> איור 5: השוואה בין יחסי סריג ב Thermoresponsive הידרוג&#39;ל (TR-ג&#39;ל) שניהם QE ויחסי סריג מבוסס SE לזהות את פעילות cAMP מוגברת chondrocytes תחת גירוי forskolin. Forskolin הוא אגוניסט cyclase adenyl אשר גורם ייצור cAMP. סריג פוחתת כאשר החללית ICUE1 נקשר cAMP, ובכך יחס סריג QE (E QE = SQE / (Saem x QS)) עולה. לעומת זאת, יחס סריג SE פוחתת וכך הוא זמם כמו E SE = 1 - CSE / Saem. בשנת chondrocytes מוטבע הידרוג&#39;ל, את QE Fיחס RET רגיש יותר תיקון רקע מייחס SE הסריג כי את אות QE היא נמוכה בשל פעילות cAMP בסיס הנמוכה. ברי שגיאה = SEM, n = 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> איור 6: השוואת יחס הסריג ב הידרוג שונה Chondrocytes בשני סוגי הידרוג&#39;ל הגיב לגירוי forskolin עם עלייה בפעילות cAMP כפי שהפגין יחס QE הסריג המוגבר לאורך זמן. ההשפעות סוג הידרוג&#39;ל התגובה התאית באמצעות מספר אפקטים, כולל הבדלים בחדירות כדי forskolin ובפעילות cAMP הסלולר הבזליים (E QE = 0.19 ג&#39;ל PC לעומת E QE = 0.09 ב TR-ג&#39;ל, לא מוצג). ברי שגיאה = SEM, n עבור TR-ג&#39;ל= 25, n עבור ג&#39;ל PC = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

הדמיה תהודה העברת אנרגיה פורסטר (סריג) הוא כלי רב עוצמה עבור מחקרים בביולוגיה של התא בזמן אמת. הנה שיטת תאי הדמית סריג ב פיסיולוגי תלת ממדי (3D) microenvironments הידרוג&#39;ל באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הקונבנציונלי מוצגת. מניתוח עבור בדיקות ratiometric סריג המניב יחסי ליניארי על פני טווח ההפעלה מתואר.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

שבב מבוסס תלת ממדי נייד תרבות Micro-bioreactors perfused

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...