Name: fret imaging in three-dimensional hydrogels
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00
Duration: 9 min 47 s
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著者らは、ピッツバーグ、健康賞K01 AR062598の国立研究所、および助成金P30のDE030740の大学歯科医学部の財政支援を認めます。著者らはまた、ImageJのマクロのためのImageJとマイケル・カメロを開発するためのICUE1プラスミド、ウェインRasband博士ジンチャンに感謝します。

The authors have no conflicts to declare.

細胞シグナリングは複雑で、薬理学、組織工学、再生医療などの多くの分野のための必然でもあります。有用な治験ツールは、細胞生物学の理解を促進し、組織再生のための最適な材料を開発するために必要とされます。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）イメージングは受容体の活性化、分子のコンホメーション、および生細胞中で超分子相互作用を（ 例えば 、タンパク質/ DNA複合体形成）の分析を可能に不可欠なツールです。 FRETは、蛍光色素分子1との間の非放射エネルギー転送のタイプです。これは、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォア間の距離の6乗に反比例する効率を有します。 （ - 10ナノメートル、典型的には1）2このように、ナノメートルスケールでの2つの異なる分子間または1つの分子の領域にわたって空間的な距離情報を提供することができます。ドナーとアクセプターフルオロフォアは異なるメートルとすることができますolecule型ドナーは、より高いエネルギー放出（より短い波長）を有する、（ヘテロFRET）、または同じタイプの（ホモFRET）。 FRET画像化は、固定または生細胞に対して行うことができるが、高速共焦点システムが利用できない場合、一般的に固定された細胞は、高い空間分解能での分子相互作用のイメージングのために使用されます。生細胞は、このような応答3シグナリングリアルタイム細胞内などの阻害または固定することによって変更される相互作用およびプロセスを研究するために使用されます。 なぜなら、シンプルさとより低いバックグラウンド（平面セルのうちから無発光）の一部でFRETイメージング用2次元（2D）の細胞培養液を使用し、生細胞の研究。しかし、2D培養物はまた、生理学的微小環境と3次元（3D）培養4,5に比べて非常に多くの細胞プロセスを変化させます。例えば、細胞外マトリックス相互作用のセルとセルの天然の細胞が大幅にEASをもたらす2D培養で変更されますILY細胞形態と極性6の変化を観察しました。それらは、細胞骨格成分7,8及び細胞形状および細胞骨格構造が強く空間培養環境9によって調節される結合ので、膜マイクロドメイン（ 例えば 、カベオラおよび脂質ラフト）と受容体シグナル伝達が強く部分的に、培養環境によって調節されます。メカノだけ3Dマトリックスの影響を受けますが、より複雑な二次負荷条件によって2D培養10と比較して、3D環境で生み出されていません。最後に、3Dマトリックスの透過性は拡散を減少し、2D培養物と比較してシグナル伝達分子の細胞への結合の増加とともに一般に、培地未満です。 3D培養物と一つの接着剤、化学的、及び機械的な合図に対して生理学的により類似微小環境を作成して観察することができます。細胞相互作用の細胞を促進することができ、接着性がwを制御することができます3D素材11-13の構造、組成、およびアーキテクチャ（パターニング）は、i番目。材料の機械的性質は、同様の組成および構造14,15によって調整することができます。ヒドロゲル中の細胞を培養することは、したがって、許可は、他の脱分化になる初代細胞、または従来の技術を使用して表現型の変化、 例えば、上で検討をFRET、関節軟骨からの細胞。したがって、この方法は、ライブ3D培養におけるFRETアッセイを可能にするために必要とされます。 彼らは、光学的に透明と微小環境を制御し、携帯手がかりを提供するように調整することができるので、ヒドロゲル足場は、3D FRETベースの研究に最適です。天然ポリマーから作られるヒドロゲルは、ゼラチンおよびフィブリン16などの数十年のための細胞培養に使用されてきました。携帯の微小環境をより細かく制御は、これらのポリマーの化学修飾とし、合成ポリマー17,18の使用によって達成することができます。 Hydr機械的剛性をogel透磁率は、そのポリマー組成物を変えることによって制御することができ、サイズ（ポリマーと架橋密度）19,20メッシュ 。さらに、ヒドロゲルは、増殖因子および細胞リガンドを組み込むことによって、生物活性にすることができます。なぜならこれらの可能性、バイオセンシング、薬物送達、および組織工学用途のためのヒドロゲルの開発は、研究21の非常に活発な領域です。ヒドロゲルの3Dプリントはまた、微細組織の製造のための開発を受けて、15を -organsされます。したがって、ヒドロゲル中の細胞のFRETイメージングは​​、生理的な細胞挙動を近似するための手段として有用であるだけでなく、勉強や工学的組織の成長を最適化するためのツールと​​してだけではありません。 バイナリレシオメトリックFRETプローブは、細胞のシグナル伝達を研究するのに非常に有用であり、ヒドロゲル培養物中で利用することができます。公開された蛍光及びFRETプローブの部分的なリストについては、細胞遊走コンソーシアムのWebサイトを参照してください<sup&gt; 22。最も一般的なプローブタイプは、認識要素（複数可）（検体感知領域）によって関連するか、またはリンクされている2つの異なる蛍光体が含まれています。これらの領域は、（ 例えば 、イオンまたは分子の結合、地域の酵素的切断）を分析対象物の検出時にコンホメーション変化、協会、または解離を受ける蛍光団、したがって、FRETの大きさとの間の距離を変化させること（より高いまたはより低いのいずれか） 23。あまり一般的ではまだ有用なプローブ・タイプは、FRETの大きさを変化させる2つのフルオロフォアのスペクトルの重複、中の検体敏感な変化に依存しています。 「単鎖」レシオメトリックプローブは、単一分子に連結された蛍光団のペアを利用します。 「デュアルチェーン」プローブは、別々の分子上のフルオロフォアのペアを利用するが、それらの発現は、同じ発現カセット24の下に結合することができます。単一の蛍光体の式を用いた研究（ 例えば 、蛍光融合タンパク質）、研究レシオメトリックとは異なりFRETプローブは、トランスフェクション効率や細胞生存率を制御するために、二重トランスフェクションを必要としません。最小閾値（濃度小文字を区別しない）23,25上に発現した場合レシオメトリックFRETプローブは、トランスフェクション効率に比較的鈍感です。彼らは、励起源の変動および他の細胞内環境因子（ 例えば 、pHは、イオン）であれば、両方の蛍光団が同様に応答するように鈍感です。蛍光および生物発光プロモーター-レポーターは26,27を構築するとは異なり加えて、それらの応答は、転写遅延の対象ではありません。 レシオメトリックFRETプローブは、容易にかつ頻繁に、従来の広視野落射蛍光顕微鏡システムで使用されます。広視野顕微鏡はため、システムコスト、フルオロフォアの漂白、および十分な時間分解能で信号変化の捕獲に対する懸念の生細胞イメージングのためのライン走査型共焦点システムよりも好ましいです。また、単一細胞肛門細胞の大集団を超えるysisは、複数の視野を超える電動ステージと画像キャプチャで可能です。広視野顕微鏡は、ヘテロFRETプローブ信号の強度に基づいた分析が必要です。強度解析は、他のFRETの方法のような複雑なハードウェアを必要としませんが、より多くの取得後の作業は、フルオロフォアの行動や顕微鏡/イメージング・システム構成28の影響を補正するために必要とされます。フルオロフォアの捕捉発光強度は、励起エネルギー、フルオロフォア、量子収率、および合成フィルタ及びカメラ/検出器スペクトル感度と直線2の関数です。これらは、ドナーとアクセプターのために異なることがあり、定量的な分析のためのキャリブレーションを必要とします。また、アクセプター発光の画像化は蛍光体のスペクトルの重複によって影響される（ドナー励起光によって受容体の励起およびアクセプターの発光スペクトルにドナー発光のスルーブリード）2。4;単鎖二重鎖」プローブセル25,28を通じて異なる化学量論で存在してもよい場合の蛍光団。 &quot;&quot;プローブは、フルオロフォアは、一方で、それらの蛍光団がナノスケールで等モルであるため、内部的に正規化されている「単鎖」プローブは、同様の明るさ（吸光係数および量子収量の機能）、非線形検出器感度の効果は、バックグラウンド蛍光と23を必要とされる結合量子収量/検出器感度のために小さいだけ補正されているのである。従って、「単鎖」レシオメトリックFRETプローブは、最も容易に広視野顕微鏡24に実装されています。 本稿では、従来の広視野落射蛍光顕微鏡を使用して3Dハイドロゲル培養における生細胞のFRETイメージングを実行するための簡単​​な技術が記載されています。これは、簡単に相互に興味がよく研究室のように、すでに2DでFRET実験を行う研究室によって採用することができます微細組織における細胞シグナリング。ここでは、環状アデノシン一リン酸（cAMP）光架橋内生軟骨細胞におけるレベル（PC-ゲル、ポリエチレングリコールジメタクリレート）および熱応答性（TR-ゲル、マトリゲル）ヒドロゲルのFRETイメージングベースの測定と方法を示しています。レシオメトリックFRETプローブは、フォルスコリンに応答したcAMPへのATPの変換を触媒するアデニル酸シクラーゼのための化学的アゴニストcAMPレベルを検出するためのEPAC1（ICUE1）に基づいて利用されています。 cAMPは、Gタンパク質共役受容体のシグナル伝達を媒介する主要なセカンドメッセンジャーの一つであり、それは、直接のcAMP（EPACs）によって活性化される下流の交換タンパク質を含む種々の因子を活性化します。フルオロフォアは、cAMPは、FRETが低下EPACドメインに結合すると離れて移動します。ここに記載のヒドロゲル材料の製造、ICUE1プローブを用いた細胞のトランスフェクション、および3Dヒドロゲル中の細胞の埋め込みです。 3D FRET実験手順および必要な画像解析細胞あたりのプローブの活性を評価するために説明されています。また、広視野顕微鏡を用いて、2Dと3DでのFRET分析の固有の限界を議論します。それは、より生理的な文脈で分析を可能にし、より少ない画像補正および較正を必要とするので、ここで提示された技術は、既存の2次元方法に対する改善です。大きな有用性は、細胞トランスフェクションの好みを維持することができるが、多くの透明な材料を使用することができるという事実にあります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td>
			<td style="width:119px;">NC0162601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM)</td>
			<td style="width:71px;">Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95904</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6514</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">3-glycidoxypropyltrimethoxysilane</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">440167</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">149470-5g</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC244280100</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC149670010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC199871000</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">190764</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sigmacote (siliconizing reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">SL2</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Toluene&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC36441-0010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH3025601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11058-021</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cellstripper (cell dissociation solution)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-056-CI</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Forskolin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipette Tips (10,200,1000 &#956;l)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-149-863B</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">01-213-100</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Biopsy punch (3 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">3332</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544C</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precoated glass coverslips (epoxysilane)</td>
			<td style="width:71px;">Arrayit</td>
			<td style="width:119px;">CCSL</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass slide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12550D</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile vials (15 mL, 50 ml conical)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-70C, 14-959-49A</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish (6-well)</td>
			<td style="width:71px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351146</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Epifluorescent Microscope with motorized stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Adjustable Specimen Holder for XY Stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">77011393</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MRD01605</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source &#38; wheel, Lambda emission filter system)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Sutter Instrument reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77016231, 77016088</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">CYF/YFP filter set</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Chroma Technology Corp)</td>
			<td style="width:119px;">77014928</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:216px;">Camera (ORCA Flash 4.0 v1)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Hamamatsu reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77054076</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab-equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">NIS-Elements 40.20.02 microscope software)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MQS31100&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Prism (spreadsheet and graphing software)</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software, Inc</td>
			<td style="width:119px;">Version 6</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (&#955;=365 or 405)</td>
			<td style="width:71px;">OmniCure</td>
			<td style="width:119px;">S1000</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pipette Aid&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DP-100</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:71px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Reichert Bright-Line 1475</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vacuum desiccator chamber/degasser&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Chemical Fume Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Oven</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Spatula</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fret imaging in three-dimensional hydrogels

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の画像化は、リアルタイムで細胞生物学を調査するための強力なツールです。 FRETを利用した研究は、一般的に、三次元（3D）細胞の微小環境を模倣していない二次元（2D）培養物を用います。 3Dヒドロゲル環境内のセルの従来の広視野落射蛍光顕微鏡を用いてクエンチ発光FRETイメージングを実行するための方法が提供されます。ここで、プローブの活性化範囲にわたって線形比率をもたらすレシオメトリックFRETプローブの分析方法について説明します。細胞内の環状アデノシン一リン酸（cAMP）のレベルの測定は、EPAC1活性化（ICUE1）及びヒドロゲル材料の種類は、本明細書に光架橋ヒドロゲル（PC-ゲル依存シグナリングcAMPの相違を検出する能力のためにプローブを使用して、フォルスコリン刺激下の軟骨細胞で実証されていますポリエチレングリコールジメタクリレート）および熱応答性ハイドロゲル（TR-ゲル）。 2D FRET法と比較して、この方法は少し追加の作業が必要です。すでに2DでFRETイメージングを利用した研究所は、簡単に3D微小環境における細胞の研究を実行するには、この方法を採用することができます。さらに、操作された3D微細組織における高スループット薬物スクリーニングに適用することができます。さらに、このような異方性の測定と蛍光寿命イメージング（FLIM）としてFRETイメージングの他の形態では、共焦点、パルス、または変調された照明を使用して、高度な顕微鏡プラットフォームと互換性があります。

すべてのヒドロゲル前駆体細胞、及び鋳型は、上記のように調製しました。セルを含んだ前駆体溶液は、PDMSの型にキャストした後、カバーガラスの近くに細胞を固定化し、FRETイメージング解析（ 図1）を容易にするために、ゲル化/光架橋前に遠心分離しました。添付のカバーガラスを有するヒドロゲルは、（ 図2）顕微鏡イメージングのために準備されたPDMS撮像ウェル内に置きました。 図3Aに示すように、光学的構成及び画像取得パラメータは、設定されました。非バイナリのプローブのために必要とされるようにCFP-YFPの蛍光団のペアのための4つのすべてのFRET関連画像チャネルのキャプチャは、（下参照「光学研究会。「 図3に）示されています。しかし、この作品で唯一の2つの画像が一本鎖バイナリICUE1プローブ、QE = &quot;CFP CFP」とAEM =&quot; YFP YFP」（励起発光）のために必要とされます。複数のFOV（XY位置単数または複数）は、いくつかのセルが均一照明領域（ 図3B）内に居住する選択しました。時間経過の取得後、プローブ用の信号データはエクスポートされました。チャネル信号のバックグラウンド補正のために、細胞分析のためのROIは、実験の開始（ 図4）から閾値処理AEM画像を用いて命名しました。細胞は、（あまりにも暗くない）十分ではなく、高すぎる（明るすぎる）プローブ（ 図4B）を発現するもののような細胞プールの中から選択しました。各取得の画素ごとのQEとSE FRET比は、背景減算画像チャネルの浮動小数点除算を用いて計算しました。セル当たりの平均FRET比（ すなわち、ROIあたり）、算出した刺激の前にベースライン信号に正規化（ すなわち、すべての時点から減算ベースライン上の回帰）、および標準エラーとしてエラーバーでプロット（SEM）を意味します。 QEとCSEベースのFRET比ドの両方フォルスコリン刺激（100 nMで、 図5）の下で軟骨細胞における増加したcAMP活性をTECT。 QE信号が原因でハイドロゲル内に埋め込まれた軟骨細胞におけるcAMP活性の低い基底レベルに低下したため、QE FRET比は、CSE FRET比よりもバックグラウンド補正に敏感でした。どちらのハイドロゲルタイプ（TR-ゲルおよびPC-ゲル）フォルスコリンの添加に増加したcAMPシグナル伝達応答を示す経時FRET比の増加（ 図6）を示しました。 QE FRET比で示すように、PC-ゲル、ヒドロゲル中の軟骨細胞は、cAMPの大きな変化（図示）およびcAMP（E QEの高い基礎レベルを示し= E QE = TR-ゲルで0.09 対 PC-ゲルで0.19、 ）は、ベースラインを差し引い図には示されていません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> 図1： 光架橋ヒドロゲル内のセル・ディストリビューション（PC-ゲル） </強いです&gt; A：細胞を含んだヒドロゲル前駆体は、カバースリップ周辺焦点面での細胞の数を最大にするために遠心分離しました。 B：これは、FOV内の細胞の数を増加させ、平面セルのうちからバックグラウンド信号を最小限に抑えることができます。 （スケールバー= 200μm）は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> 図2：PDMS皿にヒドロゲル ヒドロゲルは、顕微鏡イメージングと検体刺激のためのカバーガラスをベースとよく背の高いPDMS（ヒドロゲルの10倍容量）の内側に配置しました。それらは、アッセイを通して所定の位置に残るようにPCゲルヒドロゲルは透明でカバースリップに接着されています。 PDMSは十分にに加えて、より広い生検パンチを使用して、ヒドロゲルの体積よりも10倍多くの媒体を含むように大きくすることができますhicker PDMSシート。 （スケールバー= 2ミリメートル） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> 図3：FRET イメージングのための取得の設定 ：買収は、複数の場所での画像取り込みごとに7秒を設定しました。 QE FRET比計算のために、2つだけの画像チャネルは、QE = &quot;CFP CFP」とAEM =&quot; YFP YFP」（励起発光は）の下で、ここで使用ICUE1プローブ（バイナリ単鎖プローブ）のために必要とされる「光学研究会。 &quot;顕微鏡ソフトウェアのλ]タブ内の列。 B：のFOV（「XY」の位置）は、いくつかの細胞が均一照明領域内に居住する選択しました。画像の下のプロットは青色に沿って照明強度がラインを矢印付き示していますそれは、FOVの中心を通って横断する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> 図4：FRETイメージング解析のためのROIの選択 A：細胞を含まない関心領域（ROI）は、各チャネルのバックグラウンド信号を補正するために選択しました。細胞密度または遊走が高い場合、または細胞が均一な照明フィールド内にないときに遮光マスクを使用しない場合、無細胞ヒドロゲルの画像ではなく、バックグラウンド減算のために使用することができます。 B：細胞のROIを画像しきい値とAEMチャネルのバイナリマスクを用いて選択しました。バックグラウンドnから生成された細胞外の比率の包含に悪影響セルあたりの平均FRET比の算出に影響を与える細胞よりも大きなROIを選択オワーズ。この比率を過小評価として細胞あたりの各チャンネルの平均を用いた携帯FRET比の算出は推奨されません。 （スケールバー= 50μm）は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> 図5：熱応答性ハイドロゲル（TR-ゲル）でFRET比の比較 QEとSEベースのFRET比の両方が、フォルスコリン刺激下の軟骨細胞で増加しcAMP活性を検出します。フォルスコリンは、cAMPの産生を誘導するアデニルシクラーゼアゴニストです。 ICUE1プローブがキャンプを結合する場合にFRETが減少し、したがって、QE FRET比（E QE = SQE /（SAEM X QS））が増加します。 CSE / SAEM -逆に、SE FRET比が減少し、従って= 1 E SEとしてプロットされています。ヒドロゲル埋め込まれた軟骨細胞では、QE FRET比率が低い基礎cAMP活性にSE FRET比よりもバックグラウンド補正QE信号が低いために、より敏感です。エラーバー= SEM、N = 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> 図6： 異なるヒドロゲルでFRET比の比較 両方のハイドロゲルタイプで軟骨細胞を経時的に増加QE FRET比によって示されるように、cAMP活性の増加に伴って、フォルスコリン刺激に応答しました。ヒドロゲル型の影響フォルスコリンに、基底細胞cAMP活性の透過性の違いなど、いくつかの効果を介して、細胞応答（E QE = E QE 対 PC-ゲル中0.19 = 0.09 TR-ゲルで、図示していません）。エラーバー= SEM、nはTR-ゲル用= 25、nはPC-ゲル= 15のため<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）画像化は、リアルタイム細胞生物学研究のための強力なツールです。ここで、従来の落射蛍光顕微鏡を用いて生理学的3次元（3D）ヒドロゲル微小環境におけるFRETイメージング細胞のための方法が提示されます。活性範囲にわたって線形比率をもたらすレシオメトリックFRETプローブの分析が記載されています。

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