Name: fret imaging in three-dimensional hydrogels
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

Forfatterne erkjenner økonomisk støtte fra School of Dental Medicine ved University of Pittsburgh, National Institutes of Health award K01 AR062598, og tilskuddet P30 DE030740. Forfatterne takker også Dr. Jin Zhang for ICUE1 plasmid, Wayne Rasband for å utvikle ImageJ og Michael Cammer for ImageJ makro.

The authors have no conflicts to declare.

Dette arbeidet viser hvordan FRET bildebehandling kan brukes til å analysere cellesignalisering i 3D hydrogeler. Mens tidligere studier har vist FRET avbildning av celler sådd på hydrogel substrater 35-37, av ekstracellulære interaksjoner med hydrogeler 38, og av molekyler fanget i hydrogeler 39-41, er dette den første publikasjonen til å beskrive FRET avbildning basert intracellulære analyse av celler innebygd i 3D-hydrogeler. Arbeidet løser flere implementering problemer når sette FRET avbildning fra 2D til 3D. Først blir høy numerisk apertur mål som er nødvendig for FRET avbildning for å samle tilstrekkelig utslipp signal, men de begrenser dybdeskarpheten. Cellene her får lov til lett avgjøre via sentrifugering for å øke antall celler i et fokalplan i nærheten av glass for å kompensere for dette. For det andre kan 3D-hydrogel stillaser svev over synsfeltet under bildebehandling som kompliserer analysen. Hydrogelene her, er bundet til coverslip slik at de ligger fast gjennom hele eksperimentet. For det tredje, valg av passende hydrogel sammensetninger for 3D-FRET er viktig fordi hydrogeler kan hindre visualiseringen av cellene. Her gjennomsiktige hydrogeler av PC-gel og TR-gel brukes. Men samle cellene med sentrifugering til et fokusplanet nær dekkglass kan brukes til bildet celler i hydrogeler med høyere diffraction.The valg av hydrogel avhenger av mikromiljøet vilkår som må være simulert, som kan finnes i en gjennomgang på hydrogeler 42 . For det fjerde er en alternativ beregnings anvendes her for FRET forholdet mellom enkeltkjede ICUE1 probe (dvs. E = QE QE / cAem) for å minimalisere antallet bilde kanaler som er nødvendige for analyse og derved minimalisere fotobleking. Den gjennomsnittlige FRET-forholdet per celle blir beregnet som gjennomsnittet av forholdene per piksel i en celle for å minimalisere en underestimering av selve FRET-forhold. Til slutt, en lineær ratiometrisk analyse og midlerå beregne den aktiverte fraksjon av enkeltkjede binære prober er beskrevet. Det er flere viktige aspekter ved å gjennomføre vellykkede FRET eksperimenter ved hjelp av Widefield mikroskopi. Med hensyn til maskinvare, må kameraet være følsom nok til å løse små signalendringer, forlater nyere vitenskapelige CMOS-kameraer og elektron multiplisere CCD bedre egnet enn konvensjonelle CCD. For best å analysere den romlige fordeling av FRET-forholdet, må kameraet minimum eie to ganger den romlige oppløsning av punktspredefunksjonen til objektivet (Nyquist-kriteriet). Dette gjør dual-view-systemer mindre egnet til oppgaven. Mer avgjørende er å velge en passende eksponering og bildeopptak rate for gitt FRET pair for å minimere fotobleking av fluorophores. En redusert oppkjøpsprisen er anbefalt som eksperiment varighet øker. Bruken av raske filterhjul øker oppkjøpet hastighet og antall FOVs for analyse mens unngåing bilderegistrerings problemer med dual-view og turret filter kuber. Den inhomogene belysning feltet kompliserer korreksjon for bakgrunns fluorescens som oppstår fra prøve autofluorescence og kamera system støy. Noen hydrogeler, spesielt de som inneholder kollagenholdige proteiner er høyt autofluorescent 43,44. Gnage forhold blir undervurdert uten bakgrunnskorreksjon. Her benytter vi en enkel bakgrunn korreksjonsmetode som er avhengig av den relativt flat belysning felt som ofte kan konfigureres med epi-fluorescens belysning over midten av bildet (figur 3B, trinn 7.2). Denne metoden begrenser derfor celler av interesse for dem i denne belysning feltet. Bakgrunnen korreksjonen beskrevet her ikke står for mobilnettet autofluorescence i bølgelengdene lese for den binære sonde. I et slikt tilfelle, bør umerkede celler (ingen sonde transfeksjon) avbildes på samme vilkår og bakgrunn trekkes. En mix av merkede og umerkede celler kan benyttes og de umerkede celler valgt for bakgrunnen ROI. Alternative metoder som sørger for celle analyse over hele bildefeltet inkluderer bruk av en skyggemaske, flere bakgrunns Rois, eller identiske prøver uten celler og en protokoll er tilgjengelig på forespørsel. Spesifikt til 3D FRET avbildning, er sonden reaksjon svært følsom for hydrogelen permeabiliteten til analytten (figur 6). Derfor er de samme hydrogel-regionene blir sammenlignet på tvers av eksperimentell behandling, fortrinnsvis ved et punkt av geometri symmetri eksempel i nærheten av stillaset sentrum som anvendt her. Alternativt microfluidic kamre / bioreaktorer kan anvendes for hurtig og jevnt perfuse hydrogelen med analytt-oppløsning 45. En FRET signal kan ikke bli oppdaget (signal til støyforhold er for lavt) når hydrogel er autofluorescence er for høy; en tynnere hydrogel eller en annen probe (forskjellige fluoroforer) skal brukes.Med hensyn til 3D FRET bildebehandling i photocrosslinked hydrogeler, anbefales det å bruke minimum bestråling eksponering og bølgelengder utenfor eksitasjonsspektre av sonden fluorophores. LAP kan anvendes sammen med en synlig lyskilde ved 405 nm for ytterligere å minimalisere potensiell cellulær skade 31,46. Men bruker LAP med 365 nm bestråling anbefales fordi dette reduserer probe bleking. 365 nm ligger på tampen av CFP donor eksitasjon spektrum, mens 405 nm ligger på toppen eksitasjon. Alternativt kan proben uttrykket få lov til å komme seg etter en dag. Bruk av binære sonder minimerer spørsmål om følsomhet for forskjeller i uttrykk nivåer og i molekylær diffusjon av donor og akseptor fluorophores. Ikke-binære prober kan bli anvendt, men med SE istedenfor QE avbildning og ytterligere korreksjon for spektral avblødning ved eksitasjon og emisjonsspektra (se nedenfor). Videre lav kommersiell tilgjengelighet og kompleksiteten i å utforme FRET sonderkan være en hindring. Den mest kritiske faktoren for vellykkede forsøkene forblir riktig korrigering og analyse av fluorescens-signaler. En alternativ beregning av FRET-forholdet benyttes til flere andre grunner i tillegg til minimalisering av fotobleking. For binære enkeltkjede sonder, er den hyppigst rapporterte forholdet akseptor utslipp i henhold donor eksitasjon (sensibilisert utslipp, SE) til donor utslipp i henhold donor eksitasjon (slukket utslipp, QE), det vil si, gnage ratio = SE / QE 25,47,48. SE / QE er ikke-lineær i forhold til endringer i effektivitet FRET 21,22,47. Nemlig, har forholdet mellom en eksponentielt ikke-lineært forhold til iboende FRET effektivitet av sonden (Ei) (Donius, AE, Táboas, JM upubliserte arbeider. (2015)), idet forholdet mellom de lineære for Ei mindre enn omtrent 15%. SE / QE vil også undervurdere brøkdel av aktiverte prober (FAP, dvs. brøkdel av sonder bindende analytt). therefore, analyse av SE / QE krever en tungvint likevekt dose responsstudie og kurve. Heldigvis prosenter av SE eller QE til akseptor utslipp i henhold akseptor eksitasjon (AEM) er lineær med hensyn til Ei og FAP, dvs. gnage forholdstall SE / AEM og QE / AEM. SE / AEM er ofte brukt for binære prober og bare krever end-punkts kalibrering (uten probe aktivitet og full sonde aktivitet), men basal cellesignalering gjør dette vanskelig. For å eliminere behovet for endepunktet kalibrering, kan SE korrigeres (CSE) for spektral overlapping av donor og akseptor eksitasjons- og emisjonsspektrene (spectral avblødning gjennom) og for kvanteutbytte og spektralfølsomhet (QS) av de kombinerte sonde fluoroforene og mikroskop imaging system. Den korrigerte SE FRET ratio basert på CSE definerer observert FRET effektiviteten av sondene innen hver piksel i et bilde, dvs. E SE = CSE / AEM. Kommersiell og fri programvare er tilgjengelig for å korrigere SE for disse effektene oghenvises det til arbeidet med Chen og Periasamy 2006 for en detaljert forklaring av metodene 50. Men beregning E SE krever fangst av tre bilde kanaler per time-punkt (SE, QE, AEM). Derfor, i dette arbeidet også ansetter vi en alternativ FRET ratio E QE = 1 - QE / cAem, som krever fangst av bare to bilde kanaler (QE og AEM). Beregning E QE fra disse kanalene krever bare korrigere AEM for QS (cAem = AEM x QS). QS = Dem / AEM er lett beregnes ved hjelp av to bilder fra en kalibreringsprøve, hvor Dem er donor utslipp i henhold donor eksitasjon med akseptor bleket. FAP på ethvert øyeblikk kan beregnes ved å sammenligne E SE E eller QE til den Ei av sonden. Til syvende og sist bør FRET ratio utvalg (E SE = CSE / AEM vs. E QE = QE / cAem) være basert på en vurdering av sonden type og kanalene med beste signalet. både enpproaches omfatter bakgrunnsstøy korrigering av bilder per bilde som beskrevet ovenfor for å konto for endringer i autofluorescens over tid. De forutsetter ingen overlapping av AEM eksitasjonslys inn i Dem magnetisering spekteret, noe som ofte er tilfellet på grunn av probe utforming og mikroskop filterkonfigurasjonen. Single-kjeden prober kan enten bruke og valg er basert på beste sonde signal (lysstyrke) til kamera støy og bakgrunnssignal på SE og QE-kanaler. For ICUE1 sonde og eksperimentelle forhold som brukes her (celle- og hydrogel typer), har SE et sterkere signal enn QE. Dual-kjeden prober krever bruk av E SE grunn av ikke-ekvimolar distribusjon av donor og akseptor fluoroforer. For sonder som forringes FRET ved binding analytten som ICUE1, gnage effektivitet kan &quot;omvendt&quot; for å presentere en positiv signalendring ved binding analytten som vi gjør her, med E SE = 1 - CSE / AEM eller E QE = QE / (AEM x QS). Analyse av the FAP er følsom for riktig korreksjon av FRET forholdstall og til estimatet av Ei. Det kan estimeres med de samme kalibreringsprøven som brukes for QS og en konvensjonell endepunkt FRET effektivitet Analyse Ei = 1- (QE / Dem) (QE bilde fulgt av akseptor fotobleking og en Dem bilde) 28, men forsiktighet må utvises for å minimalisere utilsiktet bleking av donor. Vi beskriver en modifisert versjon hvor estimat av Dem basert på AEM justert for QS erstattes, dvs. Ei = 1 - (QE / (AEM x QS)). Alternativt kan Ei = CSE / AEM brukes. Beregning av Ei i levende celler krever at alle sonder bli kjørt til full gnage. Dette er vanskelig å oppnå i praksis for sonder, slik som ICUE1 som forringes FRET ved binding av analytten. En in vitro basert beregning av Ei hjelp av cellelysater og renset analytt er best, men utenfor rammen av dette arbeidet. Her anbefaler vi å bruke 2 &#39;, 5&#39;-dedeoksyadenosin å redusere cAMP i cellene. Imidlertid kan en relativ FAP be beregnet ved hjelp av et anslag Ei avledet fra basalnivået av signalering. Av disse grunner studier rapporterer oftest FRET-forholdet (som gjøres her) eller en relativ FAP basert på endepunkt kalibrering, hvor signaleringslinjen før tilsetning av agonist er den nedre grensen, og signalet etter at et andre agonist som metter signale den øvre bundet. Forskolin er ofte brukt som en kontroll agonist for å mette cAMP signal. Alternativt kan en cAMP analog benyttes slik som 8-Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-cyklisk monofosfat. Positive kontroller som benyttes ved gjennomføring av undersøkelser for å identifisere potensielle endringer i signalveien mellom eksperimentelle behandlinger er anbefalt. Beregning av den gjennomsnittlige signalresponsen per celle krever vurdering av flere faktorer. Først bør den gjennomsnittlige FRET-forholdet beregnes som gjennomsnittet av forholdene ved hvert bildeelement innenfor en celle, dvs. (Σ (QE/cAem)) / (antall piksler), i stedet for ratio av den gjennomsnittlige QE og aem i en celle, dvs. (ΣQE) / (ΣcAem). Selv om sistnevnte ikke krever forsiktig maskering som bakgrunnsstøy er lav, det er alvorlig undervurderer den sanne gjennomsnittlige FRET ratio. Imidlertid bildeelementforhold krever flytberegning og forsiktig binært maskering av celleområdet for å definere ROIs og unngå inklusjon av uønskede forholdene er generert fra bakgrunnsstøy utenfor cellen. Hele celleområdet må tallfestes for å unngå spenn resultater på cellen form. Maskeringen må kanskje omdefineres over tid, avhengig av endringer i cellen form og migrasjon. Alternativt kan Rois større enn cellen brukes hvis eksklusjonskriteriene er definert til å fjerne pikselforhold fra QE og AEM signaler som faller godt under cellulære nivåer og er nær bakgrunnsnivå. Den beskrevne analysemetoder detalj de grunnleggende trinnene som brukes i dette arbeidet for FRET analyse uten spesialisert programvare / plugins. Mikroskop produsenter og andre leverandører selger tilleggsmodulens for deres mikroskop programvare som støtter automatisert proporsjonal og FRET analyse. Likeledes har det offentlige ImageJ programvare flere plugins tilgjengelig for partikkel og FRET analyse, for eksempel RiFRET. For det andre undervurderer pikselbasert gjennomsnittet FRET ratio den sanne gjennomsnittlige forholdet mellom 3D cellestruktur fordi et 2D-bilde blir brukt. 2D signalene representerer gjennomsnitt og langs z-aksen. Beregning av 3D romlig fordeling av FRET-forhold i levende celler er ikke mulig uten høy hastighet 3D avbildning (f.eks., Ved hjelp av spinne disk konfokal mikroskopi). Dette er et problem for både 2D og 3D-kulturer, men har en større effekt i 3D som mer av den cellulære strukturen eksisterer ut av flyet. Dette er av stor bekymring for sonder som lokaliserer til cellulære strukturer, slik som plasmamembranen EPAC1 probe PM-ICUE. Se Spiering et al. 2013 om forslag til rette for celle tykkelse effekter på forholdet beregninger 24. Analyse av fordelingen av AEM kan brukes til åoppdage om sonden samler seg i områder av cellen og avbildningsplanet justeres. Dette vil også bidra til å tolke den romlige fordelingen av FRET forhold og for å eliminere falske resultater, f.eks., Identifisere probe metning (dvs. at en lav AEM regionen har lav sonden konsentrasjon og kan fremvise sonde metning og høy FRET ratio). Tredje, ulike FRET baseline nivå kan indikere en forskjell i transfeksjon effektivitet, sondere uttrykk, eller basal signale mellom eksperimentelle grupper. &quot;Relativ Analysis&quot; (trinn 10.1.1) bidrar til å fjerne drift i FRET forholdet over tid hvis det finnes. Den muliggjør sammenligning av den relative størrelse av reaksjoner mellom prøver, men hindrer sammenlignet med tidsforløpet av respons for referanseprøven (kontroll plottet er en flat linje). &quot;Absolutt Analysis&quot; (trinn 10.1.2) muliggjør sammenligning av graden av reaksjon på tvers av prøvene, men hemmer sammenligning av størrelsen av responsen fordi hver linje blir skalert med en dissimvis lik konstant. Studier ofte bruke en lineær regresjon på grunnlinjen for å korrigere for drift i FRET forholdet over tid. Den beskrevne 3D FRET metoden er en nyttig og praktisk måte å dikte og utføre time-lapse avbildning av celle laden 3D hydrogeler, som kan brukes til andre sonder og bildediagnostikk. Andre FRET system i tillegg til enkeltkjede binære prober vil kreve mer komplisert korrigering av intensitetsbaserte signaler, som diskutert ovenfor. Alternativt kan fluorescens levetid avbildning av FRET (FLIM-FRET) brukes for å beregne FRET effektivitet via en endring i utslipps levetiden av sonden donor. I motsetning intensitet basert slite, er FLIM-FRET ufølsom for bakgrunnsstøy, spectral blø-through, quantum effektivitet, og detektor spektral følsomhet to. Men FLIM systemer er dyrt, komplisert, og uvanlig, og fungerer best med fluorophores med én eksponent forfall og ingen FLIM avrenning 49. Den beskrevne fremgangsmåte kan også anvendes sammen med more avanserte mikroskop plattformer (f.eks., gnage-TIRF, fluorescens anisotropi, og spektral korrelasjon FRET). Bruk av denne metoden til 3D avbildning med høy hastighet konfokal mikroskopi og multiphoton vil lette analyse av sub-cellulære fordeling av signale respons og øke nøyaktigheten av signaleringsanalyse. Denne 3D FRET metoden vil gjøre avanserte cellebiologi studier i simulert 3D cellulære microenvironments. Som sådan, kan det lett anvendes på farmakologi og regenerativ medisin behov, inkludert å studere intercellular signalisering og screening av legemiddelrespons i konstruerte hydrogeldannende basert microtissues.

Cellular signalering er både komplisert og følgeskader for en rekke felt, inkludert farmakologi, tissue engineering, og regenerativ medisin. Nyttige investigational verktøy er nødvendig for å videreutvikle vår forståelse av cellebiologi og å utvikle optimale materialer for vev gjenfødelse. Förster resonans energi overføring (FRET) bildebehandling er et viktig verktøy som muliggjør analyse av reseptor aktivering, molekylær konformasjon, og supramolekylære interaksjoner (f.eks., Protein / DNA kompleks) i levende celler. FRET er en type ikke-strålingsenergioverføring mellom fluoroforer 1. Den har en effektivitet som er omvendt proporsjonal med den sjette potens av avstanden mellom en donor og akseptor fluorofor fluorofor. Dermed kan det gi informasjon om den romlige avstanden mellom to forskjellige molekyler eller på tvers av regioner i ett molekyl på nanometer skala (vanligvis 1 - 10 nm) 2. Donor og akseptor fluoroforene kan være forskjellig molecule typer (hetero-FRET), hvor giveren har høyere energi utslipp (kortere bølgelengde), eller av den samme type (homo-FRET). FRET avbildning kan utføres på faste eller levende celler, men generelt fikserte celler blir brukt til avbildning av molekylære interaksjoner med høy romlig oppløsning ved høy hastighet konfokale systemer er utilgjengelige. Levende celler blir brukt til å studere interaksjoner og prosesser som er hemmet eller endret ved fiksering, slik som sanntids intracellulære signalrespons 3. Levende celle-studier som anvender FRET avbildning bruk to-dimensjonale (2D) cellekulturer delvis på grunn av enkelhet og lavere bakgrunn (ingen emisjon fra ut av plane celler). Imidlertid 2D kulturer også endre en rekke cellulære prosesser i forhold til den fysiologiske mikromiljøet og tre-dimensjonale (3D) kultur 4,5. For eksempel er innfødt celle til celle og celle til ekstracellulære matriks-interaksjoner drastisk forandret i 2D kultur fører til easily observerte endringer i celle morfologi og polaritet 6. Membranmikroområder (f.eks., Caveolae og lipid flåter) og reseptorsignalisering er sterkt regulert av kulturmiljøet, blant annet fordi de binder cytoskeletal komponenter 7,8 og celleformen og cytoskeletal struktur er sterkt regulert av romlig kulturen miljø 9. Mechanotransduction er ikke bare påvirket av 3D matrix, men av de mer komplekse sekundære belastningsforhold skapt i 3D-miljøer i forhold til 2D kulturer 10. Til slutt, permeabiliteten av 3D-matriser er mindre enn kulturmediet, generelt med redusert diffusjon og økt binding av cellesignalmolekyler sammenliknet med 2D-kulturer. Med 3D-kulturer er man i stand til å skape og observere en mikromiljøet mer lik den fysiologiske forhold til lim, kjemiske og mekaniske signaler. Celle til celle interaksjoner kan fremmes og klebeegenskaper kan styres with struktur, sammensetning og arkitektur (mønster) av 3D-materiale 11-13. De mekaniske egenskapene til materialet kan likeledes tilpasses etter sammensetningen og strukturen 14,15. Dyrkning av celler i hydrogeler derfor tillater FRET studier på primærceller som ellers ville de-differensiering eller endring i fenotype ved bruk av konvensjonelle teknikker, f.eks., Celler fra leddbrusk. Det er således behov for en fremgangsmåte for å muliggjøre FRET forsøk i levende 3D-kulturer. Hydrogel stillaser er ideelle for 3D FRET baserte studier fordi de kan gjøres optisk transparent og skreddersydd for å kontrollere mikromiljøet og for å gi cellulære signaler. Hydrogeler fremstilt fra naturlige polymerer har vært brukt i cellekultur i flere tiår, inkludert gelatin og fibrin 16. Større kontroll over den cellulære mikromiljø kan oppnås ved kjemisk modifikasjon av disse polymerer og med bruk av syntetiske polymerer 17,18. hydrogel mekanisk stivhet og permeabilitet kan kontrolleres ved å endre deres polymermaterialet og maskestørrelse (polymer og tverrbindingsdensitet) 19,20. Videre kan hydrogeler gjøres bioaktivt gjennom inkorporering av vekstfaktorer og cellulære ligander. På grunn av disse mulighetene, er utviklingen av hydrogeler for biosensing, levering av legemidler, og tissue engineering applikasjoner et meget aktivt forskningsområde 21. 3D printing av hydrogeler er også under utvikling for fabrikasjon av mikro vev og -organs 15. Således er FRET avbildning av celler i hydrogeler ikke bare nyttig som et middel for å tilnærme fysiologiske celle oppførsel, men også som et verktøy for å studere og optimalisere konstruert vevsvekst. Binære Proporsjonal FRET-prober er svært nyttige i å studere cellesignalisering og kan anvendes i hydrogel-kulturer. For en ufullstendig liste over publiserte fluorescerende og FRET sonder, se Cell Migration Consortium hjemmeside <sup&gt; 22. Den vanligste sondetype inneholder to forskjellige fluoroforer som er tilknyttet eller forbundet med en gjenkjenningselement (er) (analytt sensitiv region). Disse regionene gjennomgå en konformasjonsendring, forening, eller dissosiasjon ved påvisning av analytten (f.eks., Binding av et ion eller molekyl, enzymatisk spalting av region) som endrer avstanden mellom fluorophores og derfor gnage magnitude (enten høyere eller lavere) 23. En mindre vanlig, men nyttig sondetypen er avhengig av en analytt følsomt forandring i spektrale overlapping av de to fluoroforer, som endrer FRET størrelsesorden. &quot;Single-kjede&quot; Proporsjonal sonder utnytte en fluorophore par koblet på et enkelt molekyl. &quot;Dual-kjede&quot; prober utnytte fluoroforen parvis på separate molekyler, men deres ekspresjon kan koples under samme ekspresjonskassetten 24. I motsetning til studier med enkelt fluorophore uttrykk (f.eks., Fluorescerende fusion proteiner), studier med ratiometriskFRET prober krever ikke dual-transfeksjon for å kontrollere for transfeksjonseffektivitet eller celle-levedyktighet. Proporsjonal FRET prober er relativt ufølsom for transfeksjon effektivitet når uttrykt ovenfor et minimum terskel (konsentrasjon insensitive) 23,25. De er ufølsomme for eksitasjon kilde svingninger og andre intracellulære faktorer (f.eks., PH, ioner) så lenge begge fluoroforer er like forståelsesfull. I tillegg er deres respons ikke gjenstand for transkripsjonen forsinkelse, i motsetning til fluorescerende og bioluminescent promoter-reporter-konstruksjonene 26,27. Proporsjonal FRET sonder er lett og ofte ansatt i konvensjonelle vidfelt epifluorescence mikroskop systemer. Widefield mikroskoper er foretrukket over linjen skanning confocal systemer for levende celle bildebehandling på grunn av bekymringer over systemkostnadene, fluorophore bleking, og fangst av signalendringer med tilstrekkelig tidsoppløsning. I tillegg er enkelt celle analysis over en stor populasjon av celler er mulig med en motorisert scene og bildeopptak over flere synsfelt. Widefield mikroskopi krever intensitet basert analyse av de hetero FRET sondesignaler. Selv om intensiteten analyse ikke krever komplisert maskinvare som andre FRET metoder, er mer etter oppkjøpet arbeid som er nødvendig for å korrigere for effekten av fluoroforen atferd og mikroskop / bildesystemkonfigurasjoner 28. Den fangede utslippsintensiteten av en fluorofor er en funksjon av eksitasjonsenergien, fluoroforen kvanteutbytte, og det kombinerte filteret og kamera / detektor spektralfølsomhet og linearitet 2. Disse kan være ulik for donor og akseptor og vil kreve kalibrering for kvantitativ analyse. I tillegg er avbildning av akseptor utslipps påvirket av den spektrale overlapping av fluoroforene (eksitasjon av akseptor av donor eksitatorisk lys og luft-gjennomstrømning av donor utslipp til akseptor emisjonsspektra) 2.4, enkelt-kjede &quot;prober er internt normalisert fordi deres fluoroforer er ekvimolar i nanoskala, mens fluoroforene av&quot; dobbel-kjede &quot;prober kan eksistere i forskjellige støkiometrier gjennom en celle 25,28 Dersom fluoroforer i.&quot; Single-chain &quot; prober er av samme lysstyrke (funksjon av ekstinksjonskoeffisient og kvantumutbyttet), effekten av ikke-lineær detektorfølsomhet er små og bare korrigert for bakgrunnsfluorescens og det koblede kvanteutbytte / detektorfølsomhet er nødvendig 23. Således &quot;single-chain&quot; proporsjonal FRET sonder lettest implementert i vidfelt mikros 24. Dette notatet beskriver en enkel teknikk for å utføre FRET avbildning av levende celler i 3D hydrogel kulturer ved hjelp av en konvensjonell vidfelt epifluorescent mikroskop. Det kan lett vedtatt av laboratorier allerede utfører FRET eksperimenter i 2D, samt laboratorier som er interessert i intercellesignalisering i microtissues. Her viser vi metoden med FRET bildebasert måling av syklisk adenosin monofosfat (cAMP) nivåer i levende chondrocytes innen fototverr (PC-gel, polyetylenglykol dimetakrylat) og thermoresponsive (TR-gel, Matrigel) hydrogeler. En ratiometrisk FRET-probe blir anvendt basert på EPAC1 (ICUE1) for å detektere cAMP-nivåer i respons til forskolin, en kjemisk agonist for adenylat cyclase som katalyserer omdanning av ATP til cAMP. cAMP er en av de viktigste andre budbringere som formidler G protein-koblet reseptor signalisering og den aktiverer ulike faktorer, inkludert nedstrøms utveksle proteiner direkte aktivert av cAMP (EPACs). Fluoroforene beveger seg fra hverandre ved cAMP-binding til EPAC domene resulterer i en reduksjon i FRET. Beskrevet her er fremstilling av hydrogel materiale, celle transfeksjon med ICUE1 probe, og innstøping av cellene i 3D-hydrogeler. 3D-FRET eksperiment fremgangsmåte og bildeanalyse nødvendigeå evaluere sonde aktivitet per celle blir forklart. Vi diskuterer også de iboende begrensningene i FRET analyse i 2D og 3D ved hjelp vidfelt mikroskopi. Den teknikk som presenteres her er en forbedring i forhold til de eksisterende metoder 2D siden det muliggjør analyse i en mer fysiologisk sammenheng, og krever mindre bildekorreksjon og kalibrering. Stor nytte ligger i det faktum at mange transparente materialer kan brukes mens kan opprettholdes celle og transfeksjon preferanser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td>
			<td style="width:119px;">NC0162601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM)</td>
			<td style="width:71px;">Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95904</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6514</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">3-glycidoxypropyltrimethoxysilane</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">440167</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">149470-5g</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC244280100</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC149670010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC199871000</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">190764</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sigmacote (siliconizing reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">SL2</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Toluene&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC36441-0010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH3025601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11058-021</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cellstripper (cell dissociation solution)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-056-CI</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Forskolin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipette Tips (10,200,1000 &#956;l)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-149-863B</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">01-213-100</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Biopsy punch (3 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">3332</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544C</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precoated glass coverslips (epoxysilane)</td>
			<td style="width:71px;">Arrayit</td>
			<td style="width:119px;">CCSL</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass slide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12550D</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile vials (15 mL, 50 ml conical)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-70C, 14-959-49A</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish (6-well)</td>
			<td style="width:71px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351146</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Epifluorescent Microscope with motorized stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Adjustable Specimen Holder for XY Stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">77011393</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MRD01605</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source &#38; wheel, Lambda emission filter system)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Sutter Instrument reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77016231, 77016088</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">CYF/YFP filter set</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Chroma Technology Corp)</td>
			<td style="width:119px;">77014928</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:216px;">Camera (ORCA Flash 4.0 v1)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Hamamatsu reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77054076</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab-equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">NIS-Elements 40.20.02 microscope software)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MQS31100&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Prism (spreadsheet and graphing software)</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software, Inc</td>
			<td style="width:119px;">Version 6</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (&#955;=365 or 405)</td>
			<td style="width:71px;">OmniCure</td>
			<td style="width:119px;">S1000</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pipette Aid&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DP-100</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:71px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Reichert Bright-Line 1475</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vacuum desiccator chamber/degasser&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Chemical Fume Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Oven</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Spatula</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fret imaging in three-dimensional hydrogels

Imaging av Förster resonans energi overføring (FRET) er et kraftig verktøy for å undersøke cellebiologi i sanntid. Studier som anvender FRET vanligvis anvende to-dimensjonale (2D) kultur, som ikke etterligner den tredimensjonale (3D) cellulære mikromiljø. En fremgangsmåte for å utføre undertrykket emisjon FRET avbildning ved bruk av konvensjonelt vidfelt epifluorescens mikroskopi av cellene innenfor et 3D-hydrogel miljø presenteres. Her en analysemetode for ratiometrisk FRET prober som gir lineære forhold mellom over sonden aktiveringsområde, er beskrevet. Måling av intracellulær cyklisk adenosin monofosfat (cAMP) nivåene er demonstrert i kondrocytter i henhold til forskolin stimulering ved hjelp av en sonde for EPAC1 aktivering (ICUE1) og evnen til å detektere forskjeller i cAMP-signalisering avhengig av hydrogel materialtypen, her en fototverrbindingen hydrogel (PC-gel, polyetylen-glykol-dimetakrylat) og en thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Sammenlignet med 2D FRET metoder,Denne metoden krever lite ekstra arbeid. Laboratories allerede utnytte FRET avbildning i 2D kan enkelt ta i bruk denne metoden for å utføre mobiltelefon studier i en 3D-mikromiljøet. Den kan videre anvendes for high throughput screening medikament i konstruerte 3D microtissues. I tillegg er den kompatibel med andre former for FRET bildebehandling, slik som anisotropi måling og fluorescens levetid imaging (FLIM), og med avanserte mikros plattformer ved hjelp av konfokal, pulset eller modulert lys.

Alle hydrogel-forløpere, celler og støpeformer ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Cellen laden forløper løsninger ble støpt i PDMS muggsopp og deretter sentrifugert før gele / fototverr å immobilisere celler nær dekkglass og lette FRET bildeanalyse (figur 1). De hydrogeler med vedlagte dekk ble plassert i preparerte PDMS bilde brønner for mikroskopisk bildebehandling (figur 2). De optiske konfigurasjoner og bilde-innhentingsparametre ble så satt, som vist i figur 3A. Fangst av alle fire FRET relatert bilde kanaler for CFP-YFP fluoroforen parene er vist (se under &quot;Optical Conf.&quot; I figur 3), som er nødvendig for ikke-binære prober. Men i dette arbeidet bare to bilder er nødvendig for den ene kjeden binære ICUE1 sonde, QE = &quot;CFP CFP&quot; og AEM = &quot;YFP YFP&quot; (eksitasjon utslipp). Flere FOVs (xy stillinge) ble utvalgt hvor flere celler som bodde innenfor det homogen belysning området (figur 3B). Etter tid lapse oppkjøpet ble signaldata for sonden eksporteres. ROIs for bakgrunnskorrigering av kanalsignalene og for celleanalyse ble betegnet ved hjelp av terskel AEM bilder fra starten av forsøkene (figur 4). Celler ble valgt ut blant cellen bassenget som de som uttrykker tilstrekkelig (ikke altfor svak), men ikke altfor høy (overdrevet sterke) probe (Figur 4B). De QE og SE FRET forholdstall per piksel på hvert kjøp ble beregnet ved hjelp av flytende-punkt delingen av bakgrunnen trekkes bilde kanaler. Den gjennomsnittlige FRET-forholdet per celle (dvs, pr ROI) ble beregnet, normalisert til referansesignalet før stimulering (dvs. en regresjon på grunnlinjen subtrahert fra alle tidspunkter), og plottet med feilfelt som standardfeilen for den mener (SEM). Både QE og CSE basert FRET forholdstall deTECT den økte cAMP-aktivitet i henhold til kondrocytter forskolin stimulering (100 nM, figur 5). QE FRET-forholdet var mer følsom for bakgrunnskorrigering enn CSE FRET-forholdet fordi QE-signalet var lavere på grunn av den lave basalnivået av cAMP-aktivitet i kondrocytter innebygd i hydrogeler. Begge typer hydrogel (TR-gel og PC-gel) viste en økning i FRET-forhold over tid (figur 6), noe som indikerer en økt cAMP signale respons på tilsetningen av Forskolin. Som det fremgår av QE FRET forholdet, chondrocytes i PC-gel hydrogeler viser en større endring i cAMP (vist) og en høyere basal nivå av cAMP (E QE = 0,19 i PC-gel vs. E QE = 0,09 i TR-gel, ikke vist i baseline trukket figur). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> Figur 1: Cell Distribution i Photocrosslinked hydrogel (PC-gel) </strong&gt; A: Celleholdig hydrogel-forløperen ble sentrifugert for å maksimere antallet celler ved et fokalplan nær dekkglass. B: Dette øker antallet av celler i FOV og reduserer bakgrunnssignalet fra ut av plane celler. (Scale bar = 200 mikrometer) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> Figur 2: Hydrogel i PDMS Dish Den hydrogel ble plassert inne i en høy PDMS godt (10x volum av hydrogel) med en dekk base for mikroskopisk bildebehandling og analytten stimulering. PC-gel hydrogeler er transparente og bundet til dekkglass, slik at de forblir på plass gjennom hele analysen. De PDMS vel kan gjøres større for å inneholde 10x mer medium enn hydrogelen volum ved hjelp av en bredere biopsi slag i tillegg til atHicker PDMS ark. (Scale bar = 2 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> Figur 3: Anskaffelses konfigurasjon for FRET Imaging A: Oppkjøpet ble konfigurert for bildeopptak hver 7 sek på flere steder. For QE FRET forholdet beregningen, er bare to bilde kanaler nødvendig for ICUE1 probe brukes her (binær enkelt kjede probe), QE = &quot;CFP CFP&quot; og AEM = &quot;YFP YFP&quot; (eksitasjon utslipp) under &quot;Optisk Conf.&quot; kolonne i fliken λ av mikroskopet programvare. B: FOVs ( &quot;XY&quot; stillinger) ble valgt som flere celler bodde i homogen belysning området. Tomten under bildet viser lysintensiteten langs den blå Pillinjensom går gjennom gjennom midten av FOV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> Figur 4: Valg av ROIs for FRET Imaging Analysis A: en region av interesse (ROI) fri av celler ble valgt for å korrigere for bakgrunnssignal på hver kanal. Et bilde av et cellefritt hydrogel kan i stedet anvendes for bakgrunns subtraksjon hvis celletetthet eller migrasjon er høy, eller hvis en skyggemaske ikke brukes når cellene ikke ligger innenfor en homogen belysning felt. B: Celle ROIs ble valgt ved hjelp av image terskling og binære maskering av AEM kanal. Velge en avkastning større enn cellene vil påvirke beregningen av gjennomsnittlig FRET ratio per celle på grunn av inkludering av ekstracellulære forholdstall generert fra bakgrunnen nOise. Beregning av den cellulære FRET forhold med gjennomsnittet av hver kanal per celle anbefales ikke da dette undervurderer forholdet. (Scale bar = 50 mikrometer) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> Figur 5: Sammenligning av FRET prosenter i Thermoresponsive hydrogel (TR-gel) Både QE og SE basert FRET forholdstall påvise økt cAMP aktivitet i chondrocytes henhold forskolin stimulering. Forskolin er en adenylcyklase agonist som induserer cAMP produksjon. FRET avtar når ICUE1 proben binder cAMP, og dermed QE FRET forholdet (E QE = SQE / (saem x QS)) øker. Motsatt, reduserer SE FRET grad og er dermed plottet som E SE = 1 - CSE / saem. I hydrogel innebygd chondrocytes, QE FRET forholdet er mer sensitive for bakgrunnskorreksjon enn SE FRET forholdet fordi QE signalet er lav på grunn av den lave basal cAMP aktivitet. Feilfelt = SEM, n = 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> Figur 6: Sammenligning av FRET Ratio i forskjellige Hydrogeler Kondrocyttene i begge hydrogel typer svarte på forskolin stimulering med en økning i cAMP-aktivitet som demonstrert ved økt QE FRET-forhold over tid. Den hydrogel typen påvirker cellulære respons gjennom flere effekter, inkludert forskjeller i permeabiliteten til forskolin og i basale cellulære cAMP-aktivitet (E QE = 0,19 i PC-gelen sammenlignet med E QE = 0,09 i TR-gel, som ikke er vist). Feilfelt = SEM, n for TR-gel= 25, n for PC-gel = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Förster resonans energi overføring (FRET) bildebehandling er et kraftig verktøy for sanntidscellebiologi studier. Her en fremgangsmåte for å FRET avbildnings cellene i fysiologiske tre-dimensjonale (3D) hydrogel microenvironments ved hjelp av konvensjonelle epifluorescens mikroskopi er presentert. En analyse for Proporsjonellekspansjon FRET prober som gir lineære forholdstall enn aktiveringsområdet er beskrevet.

FRET Imaging i Tredimensjonal Hydrogeler

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Et analytisk verktøy som kvantifiserer Cellular Morfologi Endringer fra Tredimensjonal fluorescens bilder

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

To-og tre-dimensjonale Live-Cell Imaging av DNA Damage Response Proteiner

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mus Fetal Hele tarmen Kultur System for<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulering av signalveier og tredimensjonale Levende Imaging av Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vev fjerne metoden for tredimensjonale Imaging av fettvev

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Encellede oppløsning tredimensjonal avbildning av intakte organoider

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Proteolytisk degradert alginat hydrogeler og hydrofobe mikrobioreaktorer for svin oocyte innkapsling

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Farging og høyoppløselig avbildning av tredimensjonale organoid- og sfæroidmodeller

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...