Name: fret imaging in three-dimensional hydrogels
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

Авторы признают финансовую поддержку школы зубоврачебной медицины в Университете Питтсбурга, Национальных институтов здравоохранения премии K01 AR062598 и грант P30 DE030740. Авторы также благодарят доктора Jin Zhang для плазмиды ICUE1, Уэйн Расбанд для разработки ImageJ и Майкл Cammer для макроса ImageJ.

The authors have no conflicts to declare.

Клеточная сигнализация является сложной и логически вытекающий для многочисленных областях, в том числе фармакологии, тканевой инженерии и регенеративной медицины. Полезные исследуемые инструменты необходимы для более глубокого понимания клеточной биологии и разработать оптимальные материалы для регенерации тканей. Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) визуализация является важным инструментом , позволяющим анализ активации рецептора, конформации молекул и супрамолекулярных взаимодействий (например., Белок / ДНК комплексообразования) в живых клетках. FRET представляет собой тип безызлучательной передачи энергии между флуорофоров 1. Он имеет КПД, обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором флуорофора флуорофора. Таким образом, он может предоставить информацию о пространственном расстоянии между двумя различными молекулами или между регионами одной молекулы в нанометровом масштабе (обычно 1 - 10 нм) 2. Донора и акцептора флуорофоров могут быть разными мolecule типы (гетеро-FRET), в которой донор имеет более высокую эмиссию энергии (более короткой длиной волны), или одного и того же типа (гомо-FRET). FRET изображений может выполняться на фиксированных или живых клеток, но в целом фиксированные клетки используются для визуализации молекулярных взаимодействий при высокой пространственной разрешающей способностью при высокой скорости конфокальной системы недоступны. Живые клетки используются для изучения взаимодействий и процессов, которые затрудняли или изменёнными фиксации, например, в режиме реального времени внутриклеточный ответ 3 сигнализации. исследования живых клеток, которые используют FRET Использовать формирования изображения двухмерных (2D) клеточных культур отчасти из-за простоты и нижнего фона (нет выбросов от из плоских клеток). Тем не менее, 2D культуры также изменяют многочисленные клеточные процессы по сравнению с физиологическом микросреды и трехмерной (3D) культуры 4,5. Например, родной клетки к клетке и клетки к внеклеточного матрикса взаимодействий резко изменили в 2D культуре приводит к ЭСПILY наблюдаются изменения в морфологии клеток и полярности 6. Мембранные микродомены (например., Кавеолах и липидные рафты) и передача сигналов рецептора сильно регулируемы средой культуры, отчасти потому , что они связывают цитоскелета компоненты 7.8 и форма элемента и цитоскелета структура сильно регулируемы пространственной культуры среды 9. Механотрансдукция не только под влиянием 3D - матрицы, но более сложных вторичных условий нагружения в порождены 3D средах по сравнению с 2D - культур 10. И, наконец, проницаемость 3D матриц меньше, чем в культуральную среду, в целом с уменьшением диффузии и увеличение связывания клеток сигнальных молекул по сравнению с 2D-культур. С помощью 3D-культур один способен создать и наблюдать микросреду более похожий на физиологическом отношении клея, химических и механических сигналов. Cell для взаимодействия клеток может способствовать и свойства клейкие можно контролировать весIth структура, состав и архитектура (структуризации) 3D - материала 11-13. Механические свойства материала также могут быть адаптированы по составу и структуре 14,15. Культивирование клеток в гидрогели поэтому допускает FRET исследования на первичные клетки , которые в противном случае ослабляющих Дифференцируйся или изменения в фенотип с использованием обычных методов, например., Клетки из суставного хряща. Таким образом, необходим способ для того, чтобы FRET анализы в живых 3D культур. Гидрогелевые каркасы идеально подходят для исследований, основанных 3D FRET, так как они могут быть сделаны оптически прозрачным и с учетом контроля микросреды и обеспечить клеточные сигналы. Гидрогели из натуральных полимеров , которые были использованы в клеточной культуре в течение многих десятилетий, в том числе желатин и фибрин 16. Более полный контроль над сотовой микроокружения может быть достигнуто при химической модификации этих полимеров и с применением синтетических полимеров 17,18. HydrOGEL механическую жесткость и проницаемость можно регулировать путем изменения их полимерной композиции , и размер ячеек (полимер и плотность сшивок) 19,20. Кроме того, гидрогели могут быть биологически активных путем включения факторов роста и клеточных лигандов. Из - за этих возможностей, развитие гидрогели для биодатчиков, доставки лекарств и тканевой инженерии является очень активной областью исследований 21. 3D печать гидрогели также находятся в стадии разработки для изготовления микро-тканей и -organs 15. Таким образом, лада визуализации клеток в гидрогели не только полезным в качестве средства для аппроксимируют физиологическую клеточного поведения, но и в качестве инструмента для изучения и оптимизации роста сконструированную ткани. Бинарные логометрических FRET зондов очень полезны при изучении клеточной сигнализации и может быть использовано в гидрогелевых культурах. Для частичного списка опубликованных флуоресцентной и FRET зондов, см Cell веб-сайт консорциума по миграции <sup&gt; 22. Наиболее распространенный тип зонда содержит два различных флуорофоров, которые связаны или связаны с элементом распознавания (ов) (аналит чувствительная область). Эти участки подвергаются конформационные изменения, ассоциации, или диссоциацию при обнаружении аналита (например., Связывание иона или молекулы, ферментативное расщепление области) , что приводит к изменению расстояния между флуорофоров и поэтому FRET величины (выше или ниже) 23. Менее распространенный, но полезная тип датчика основан на изменении чувствительного анализируемого вещества в спектральном перекрытия двух флуорофоров, что приводит к изменению величины FRET. &quot;Одноцепочечные&quot; логометрических зонды используют флуорофор пару, связанную с одной молекулой. &quot;Двойная цепь&quot; зонды используют флуорофором пар на отдельные молекулы, но их экспрессия может быть соединена под тем же экспрессионной кассеты 24. В отличие от исследований с выражением одного флуорофора (например., Флюоресцентные слитых белков), исследования с логометрическойFRET зонды не требуют двойного трансфекцию для контроля эффективности трансфекции или жизнеспособности клеток. Логометрический FRET зондов относительно нечувствительны к эффективности трансфекции при выраженной выше минимального порога (концентрации) нечувствительной 23,25. Они нечувствительны к колебаниям источника возбуждения и других факторов внутриклеточной среды (например., РН, ионов) так долго , как оба флуорофоры так же отзывчивыми. Кроме того, их реакция не подлежит транскрипционный задержки, в отличие от люминесцентных и биолюминесцентная промотор-репортер строит 26,27. Логометрический FRET зонды легко и часто используются в обычных системах микроскопа Widefield эпифлуоресцентной. Широкопольные микроскопов предпочтительнее линии сканирования конфокальной системы для получения изображений живых клеток из-за опасений по поводу стоимости системы, флуорофора отбеливания, а также захвата изменений сигнала с достаточным временным разрешением. Кроме того, единая анальное ячейкализ на большой популяции клеток можно с моторизованным стадии и изображения захвата над несколькими полями зрения. Widefield микроскопия требует интенсивности на основе анализа сигналов зондов гетеро-ладу. Хотя анализ интенсивности не требует сложного оборудования , как и другие методы FRET, больше работы после приобретения требуется для коррекции последствий флуорофором поведения и системы микроскопа / визуализации конфигураций 28. Захваченный интенсивность эмиссии флуорофора является функцией энергии возбуждения, флуорофором квантовый выход, и комбинированный фильтр и камера / детектор спектральной чувствительности и линейности 2. Они могут быть различны для донора и акцептора и требует калибровки для количественного анализа. Кроме того, визуализация эмиссии акцепторного влияют спектрального перекрытия флуорофоров (возбуждение акцептора донорского возбуждающим светом и протечек через изделие излучения донора в спектрах излучения акцептор) 2.4; Одноцепочечные &quot;зонды внутренне нормализуется , потому что их флуорофоры эквимолярная на наноуровне, в то время как флуорофоры&quot; двойной цепью &quot;зонды могут существовать на различных стехиометрии по всей клетке 25,28 Если флуорофоры из.&quot; Одноцепочечный &quot; зонды имеют одинаковую яркость (функция коэффициента экстинкции и квантового выхода), эффекты чувствительности нелинейного детектора невелики и только коррекция для фоновой флуоресценции и связанной квантовой чувствительности выход / детектор необходим 23. Таким образом , &quot;одноцепочечный&quot; ратиометрический FRET зонды наиболее легко реализованы в Widefield микроскопии 24. В данной статье описан простой метод для выполнения FRET изображений живых клеток в 3D культуры гидрогеля с использованием обычного Widefield эпифлуоресцентной микроскопа. Она может быть легко принят лабораториями, уже осуществляющих FRET эксперименты в 2D, а также лабораторий, заинтересованных в Интересотовой сигнализации в microtissues. Здесь мы демонстрируем метод с FRET на основе изображений измерения циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) уровней в живых хондроцитов в пределах фотосшивкой (PC-гель, полиэтиленгликоль диметакрилат) и thermoresponsive (TR-гель, Матригель) гидрогелей. Ратиометрический FRET зонд используется на основе EPAC1 (ICUE1) для определения уровней цАМФ в ответ на форсколин, химический агониста для аденилатциклазы, которая катализирует превращение АТФ в цАМФ. цАМФ является одним из главных вторичных мессенджеров, опосредующих G-белком рецептор сигнализации и активирует различные факторы, в том числе ниже по течению белков обмена непосредственно активированных цАМФ (EPACs). Флуорофоры раздвигают на цАМФ связывания с доменом ЕПАК, что приводит к уменьшению FRET. Описываемый здесь подготовка гидрогелевых материалов, трансфекции клеток с зондом ICUE1, и вложение клеток в 3D гидрогелей. Процедура эксперимента 3D FRET и анализа изображений необходимодля оценки активности зонда на клетку объясняются. Мы также обсудим недостатки, присущие анализа FRET в 2D и 3D с помощью микроскопии с широким полем зрения. Техника, представленная здесь является улучшением по сравнению с существующими методами 2D, поскольку он позволяет проводить анализ в более физиологическом контексте, и требует меньшего количества коррекции изображения и калибровки. Большой полезности заключается в том, что многие прозрачные материалы могут быть использованы в то время как клеточные и трансфекция предпочтения могут быть сохранены.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td>
			<td style="width:119px;">NC0162601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM)</td>
			<td style="width:71px;">Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95904</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6514</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">3-glycidoxypropyltrimethoxysilane</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">440167</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">149470-5g</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC244280100</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC149670010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC199871000</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">190764</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sigmacote (siliconizing reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">SL2</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Toluene&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC36441-0010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH3025601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11058-021</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cellstripper (cell dissociation solution)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-056-CI</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Forskolin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipette Tips (10,200,1000 &#956;l)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-149-863B</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">01-213-100</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Biopsy punch (3 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">3332</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544C</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precoated glass coverslips (epoxysilane)</td>
			<td style="width:71px;">Arrayit</td>
			<td style="width:119px;">CCSL</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass slide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12550D</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile vials (15 mL, 50 ml conical)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-70C, 14-959-49A</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish (6-well)</td>
			<td style="width:71px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351146</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Epifluorescent Microscope with motorized stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Adjustable Specimen Holder for XY Stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">77011393</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MRD01605</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source &#38; wheel, Lambda emission filter system)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Sutter Instrument reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77016231, 77016088</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">CYF/YFP filter set</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Chroma Technology Corp)</td>
			<td style="width:119px;">77014928</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:216px;">Camera (ORCA Flash 4.0 v1)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Hamamatsu reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77054076</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab-equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">NIS-Elements 40.20.02 microscope software)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MQS31100&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Prism (spreadsheet and graphing software)</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software, Inc</td>
			<td style="width:119px;">Version 6</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (&#955;=365 or 405)</td>
			<td style="width:71px;">OmniCure</td>
			<td style="width:119px;">S1000</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pipette Aid&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DP-100</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:71px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Reichert Bright-Line 1475</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vacuum desiccator chamber/degasser&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Chemical Fume Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Oven</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Spatula</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fret imaging in three-dimensional hydrogels

Визуализация Форстера резонансного переноса энергии (FRET) является мощным инструментом для изучения клеточной биологии в режиме реального времени. Исследования, использующие FRET обычно используют двумерные (2D) культуры, которая не имитирует трехмерную (3D) клеточный микросреду. Способ для выполнения гасили выбросов FRET изображений с использованием обычных Widefield эпифлуоресцентной микроскопии клеток в 3D-среде гидрогеля представлена. Вот метод анализа для логометрических FRET зондов, что дает линейные коэффициенты по диапазону активации датчика описан. Измерение внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) уровней проявляется в хондроцитах при форсколина стимуляции с использованием зонда для EPAC1 активации (ICUE1) и способность обнаруживать разницу в цАМФ сигнализации в зависимости от типа материала гидрогеля, описании термин фотосшивки гидрогеля (ПК-гель, полиэтиленгликоль-диметакрилат) и thermoresponsive гидрогель (ТР-гель). По сравнению с методами 2D FRET,этот метод требует немного дополнительной работы. Лаборатории уже использующие визуализацию FRET в 2D может легко принять этот метод для выполнения клеточных исследований в 3D микросреды. Кроме того, он может быть применен к высокопроизводительного скрининга лекарственных средств в сконструированных 3D microtissues. Кроме того, она совместима с другими формами визуализации FRET, таких как измерение анизотропии и времени жизни флуоресценции томографии (FLIM), а также с передовыми микроскопии платформ с помощью конфокальной, импульсный или модулированного освещения.

Все получали гидрогелевые предшественники, клетки, и литейные формы, как описано выше. В нагруженные растворы - предшественники клеток были отлиты в PDMS пресс - форм , а затем центрифугировать до гелеобразования / фотосшивающих для иммобилизации клеток вблизи покровного и облегчения ладу анализа изображений (рисунок 1). Гидрогели с прикрепленными покровные были размещены в подготовленных PDMS визуализации скважин для микроскопических изображений (рис 2). Оптические конфигурации и параметры захвата изображений были затем установить , как показано на фигуре 3А. Захват всех четырех связанных каналов FRET изображения для пар флуорофоров CFP-YFP демонстрируется (см в разделе &quot;Оптическая Conf.&quot; На рисунке 3), как это необходимо для небинарных зондов. Однако в этой работе только два изображения необходимы для одиночной цепи двоичного ICUE1 зонда, QE = &quot;CFP CFP&quot; и AEM = &quot;YFP YFP&quot; (эмиссионного возбуждения). Несколько ПЗ (позиция хус) были выбраны , в котором несколько топливных элементов проживали в гомогенной области освещения (рисунок 3б). По истечении времени приобретения покадровой, данные сигнала для зонда была экспортирована. Трансформирования для фоновой коррекции сигналов канала и для клеточного анализа были определены с использованием порогами изображений AEM с самого начала экспериментов (рисунок 4). Клетки были отобраны из пула клеток , как те , которые выражают достаточно (не слишком тусклым), но не слишком высока (слишком яркий) зонд (рис 4В). Коэффициенты QE и SE FRET на пиксель при каждом приобретении были рассчитаны с использованием плавающей точкой разделения фона вычитали каналов изображения. Среднее соотношение FRET на ячейку (т.е. за ROI) рассчитывали, нормированная к исходному сигналу перед стимуляцией (т.е. регрессия по базовой линии вычитали из всех временных точках), и наносили на график с погрешностями как стандартная ошибка означают (SEM). И QE и на основе CSE отношения FRET деTect повышение активности цАМФ в хондроцитах при стимуляции форсколин (100 нМ, рисунок 5). Отношение QE FRET был более чувствителен к коррекции фона, чем отношение CSE FRET, потому что сигнал QE был ниже, из-за низкого базального уровня цАМФ активности в хондроциты, заложенным в гидрогели. Оба типа гидрогеля (TR-гель и PC-гель) показали увеличение соотношения FRET с течением времени (рисунок 6), что указывает на повышенную реакцию передачи сигналов цАМФ добавлением форсколина. Как указывает соотношение QE FRET, хондроциты в ПК-гель гидрогелей показывают большее изменение цАМФ ( на рисунке) и более высокий базальный уровень цАМФ (Е QE = 0,19 в PC-гель против E QE = 0,09 в TR-гель, не показано на базовом вычитают рисунке). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> Рисунок 1: Распределение ячеек в фотоотвержденное гидрогеля (PC-гель) </сильный&gt; А: Предшественник клетка нагруженные гидрогель центрифугировали, чтобы максимально увеличить количество ячеек в фокальной плоскости вблизи покровного стекла. Б: Это увеличивает количество клеток в поле зрения, и сводит к минимуму фоновый сигнал от из плоских клеток. (Шкала бар = 200 мкм) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> Рисунок 2: Гидрогель в PDMS Блюдо Гидрогель был помещен высокий PDMS хорошо (10x объем гидрогеля) с покровным основанием для микроскопических изображений и аналита стимуляции. PC-гель гидрогели прозрачны и соединены с покровным так, чтобы они оставались на месте в течение всего теста. В PDMS хорошо может быть больше, чтобы содержать более 10x среду, чем объем гидрогеля с использованием более широкого трепанобиопсия в дополнение к вhicker PDMS лист. (Шкала бар = 2 мм) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> Рисунок 3: Конфигурация Приобретение для FRET изображений A: Приобретение было сконфигурировано для захвата изображения каждые 7 секунд в нескольких местах. Для расчета коэффициента QE FRET, только два канала изображения необходимы для зонда ICUE1 используется здесь (двоичный одноцепочечный зонд), QE = &quot;CFP CFP&quot; и AEM = &quot;YFP YFP&quot; (эмиссионного возбуждения) под &quot;Optical Conf.&quot; столбец в закладке Х программного обеспечения микроскопа. B: ( &quot;ПЗ&quot; XY позиции) были выбраны, в которых несколько ячеек проживали в пределах однородной области освещения. Участок под изображением показывает интенсивность освещения вдоль синей линии со стрелкамичто проходит через центр FOV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> Рисунок 4: Выбор трансформирования для анализа FRET изображений A: область интереса (ROI), свободной от клеток была выбрана для коррекции фонового сигнала на каждом канале. Изображение бесклеточной гидрогеля вместо этого может быть использован для вычитания фона, если плотность клеток или миграция высока, или если маска затенения не используется, когда клетки не лежат в однородном поле освещения. B: Клеточные трансформирования были выбраны с помощью пороговую изображения и бинарная маскирование канала AEM. Выбор ROI больше, чем клетки отрицательно скажется на вычисление среднего отношения FRET на клетку за счет включения внеклеточного коэффициентов, полученных от фонового пУАЗы. Расчет коэффициента клеточного FRET, используя среднее значение каждого канала в ячейке не рекомендуется, так как это занижает соотношение. (Шкала бар = 50 мкм) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> Рисунок 5: Сравнение коэффициентов FRET в Thermoresponsive гидрогеля (TR-гель) Оба QE и отношения FRET на основе SE обнаружить повышенную активность цАМФ в хондроцитах при форсколина стимуляции. Forskolin представляет собой аденилатциклазу агонист, который индуцирует продукцию цАМФ. FRET , уменьшается , когда зонд ICUE1 связывает цАМФ, и , таким образом , отношение QE FRET (Е QE = SQE / (SAEM х Qs)) возрастает. С другой стороны , отношение ГП FRET , уменьшается , и, таким образом , на графике как E SE = 1 - CSE / SAEM. В гидрогелевые встроен хондроцитов, то QE Fотношение RET является более чувствительным к коррекции фона, чем отношение SE FRET, поскольку QE сигнала низок из-за низкой активности цАМФ базального. Усы = SEM, п = 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> Рисунок 6: Сравнение FRET соотношение в различных гидрогелей Хондроциты в обоих типах гидрогелевых ответили на форсколин стимуляции с увеличением цАМФ активности, о чем свидетельствует увеличением коэффициента QE FRET в течение долгого времени. В типа гидрогель воздействует на клеточный ответ через несколько эффектов, в том числе различия в проницаемости по отношению к форсколина и в базальной активности клеточного циклического аденозинмонофосфата (Е QE = 0,19 в PC-гель против E QE = 0,09 в TR-гель, который не показан). Усы = SEM, п для TR-гель= 25, п для PC-гель = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) визуализация является мощным инструментом для реального времени исследований клеточной биологии. Вот метод для клеток визуализации FRET в физиологичных микросреды трехмерной (3D) гидрогеля с использованием обычного эпифлуоресцентной микроскопии представлена. Анализ для логометрических FRET зондов, что дает линейные коэффициенты в диапазоне активации описана.

FRET визуализации в трехмерных гидрогелей

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

Чип основе трехмерной клеточной культуре в перфузии Микро-биореакторы

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Микротехнологий из Чип размером Строительные леса для трехмерного клеточного культивирования

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Привет-C: метод изучения трехмерной архитектуры геномов.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Аналитический инструмент, который количественно клеточные изменения морфологии от трехмерного изображения флуоресценции

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Двух-и трехмерных изображений живых клеток ДНК, белков реакции на повреждения

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Мышь плода Всего кишка Культура Система для<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Манипуляция сигнальных путей и трехмерных живых изображений развития ворсинки

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

ADIPO ясно: Ткани, очистка метод для трехмерных изображений жировой ткани

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Одноклеточное разрешение Трехмерная визуализация нетронутых органоидов

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Протеолитически деградированных альгинат гидрогели и гидрофобных микробиореакторов для инкапсуляции порцина Ооцита

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Окрашивание и визуализация высокого разрешения трехмерных органоидных и сфероидных моделей

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...