Name: fret imaging in three-dimensional hydrogels
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

Yazarlar Pittsburgh, Sağlık ödülü K01 AR062598 National Institutes ve hibe P30 DE030740 Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi mali destek kabul. Yazarlar ayrıca ImageJ makro ImageJ ve Michael Cammer geliştirmek için ICUE1 plazmid Dr. Jin Zhang, Wayne Rasband teşekkür ederim.

The authors have no conflicts to declare.

Bu çalışma FRET görüntüleme 3D hidrojeller hücresel sinyalizasyon analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Önceki çalışmalar hidrojeller 38 ile hücre dışı etkileşim, hidrojel yüzeylerde 35-37 numaralı seribaşı hücrelerin FRET görüntüleme gösterdi ve hidrojeller 39-41 sıkışıp moleküllerin iken, bu içinde gömülü hücrelerin FRET görüntüleme bazlı hücre içi analiz tanımlamak için ilk yayındır 3D hidrojeller. 3D 2D FRET görüntüleme çeviri yaparken iş birkaç uygulama sorunları çözer. İlk olarak, yüksek sayısal açıklık hedefleri yeterli emisyon sinyalini toplamak için FRET görüntüleme için gerekli, ama onlar alan derinliği sınırlamak vardır. Burada hücreler biraz bunu telafi etmek için cam yakınındaki bir odak düzlemi hücre sayısını arttırmak için santrifüjleme ile yerleşmeye izin verilir. İkinci olarak, 3D hidrojel iskeleleri analizi komplike görüntüleme sırasında görüş alanı boyunca kayabilir. hidrojeller Burada CoV bağlandıklarıerslip bu deney boyunca sabit olarak kalacak şekilde. hidrojeller hücre görselleştirme engelleyebilir çünkü 3D FRET için uygun hidrojel bileşimlerinin Üçüncüsü, seçim esastır. PC-jel ve TR-jel burada şeffaf hidrojeller kullanılmaktadır. Bununla birlikte, lamel civarındaki bir odak düzlemine santrifüj ile hücreler toplama hidrojel diffraction.The seçimi hidrojeller 42 üzerinde bir inceleme bulunabilir simüle edilmelidir mikro-koşullara bağlıdır daha yüksek olan hidrojeller görüntü hücreleri için kullanılabilir . Dördüncü olarak, alternatif bir hesaplama tek zincirli ICUE1 prob FRET oranı (yani, D QE = QE / cAem) analiz için gerekli resim kanal sayısını en aza indirmek için ve böylelikle photobleaching en aza indirmek için kullanılır. Hücre başına ortalama FRET oranı gerçek FRET oranının küçümsenmesi en aza indirmek için bir hücre içinde piksel başına oranlarının ortalaması olarak hesaplanır. Son olarak, bir lineer oranlı metrik analiz ve araçlartek zincirli bir ikili probları aktif fraksiyonu hesaplamak için tarif edilmektedir. Widefield mikroskopi kullanılarak başarılı FRET deneyler yürüten birçok kritik yönleri vardır. donanım açısından, kamera yeni bilimsel CMOS kamera ve geleneksel CCD daha uygundur elektron çarparak CCD bırakarak, küçük sinyal değişiklikleri gidermek için yeterli duyarlı olmalıdır. en iyi FRET oranı mekansal dağılımını analiz etmek için, kamera en az iki kez objektif (Nyquist kriteri) noktası yayıldı fonksiyonu uzaysal çözünürlüğü sahip olması gerekir. Bu göreve çift görüntüleme sistemleri daha az uygun hale getirir. Daha önemli fluorophores photobleaching en aza indirecek şekilde verilen FRET çifti için uygun bir pozlama ve görüntü elde etme oranını seçmektir. Bir azalmış alım hızı deneme süresi arttıkça tavsiye edilir. Hızlı filtre çarklarını kullanılması edinme oranı ve analiz ederken kaçının için FOVs sayısını artırırÇift görünümü ve taret filtre küpleri ile görüntü kaydı sorunlarını ing. Homojen olmayan aydınlatma alanı örnek otofloresansı ve kamera sistemi gürültü doğar eşiğe için düzeltme zorlaştırmaktadır. Bazı hidrojeller özellikle kollajen proteinleri ihtiva eden 43,44 derece otofloresan bulunmaktadır. FRET oranları arka plan düzeltme olmadan ihmal edilir. Burada sık sık görüntü (Şekil 3B, Adım 7.2) merkezi üzerinde epi-floresan aydınlatma ile konfigüre edilebilir nispeten düz aydınlatma alanında dayanan basit bir arka plan düzeltme yöntemi kullanır. Bu yöntem, bu nedenle bu aydınlatma alanında kişilerce ilgi hücreleri kısıtlar. Burada anlatılan arka plan düzeltme ikili sonda okumak dalga boylarında hücresel otofloresans için hesaba katmaz. Böyle bir durumda, etiketlenmemiş hücreleri (prob transfeksiyon) çıkartılır, aynı koşullar ve arka plan altında görüntülü olmalıdır. A metiketlenmiş ve etiketlenmemiş hücrelerden IX kullanılabilir ve etiketlenmemiş hücreleri arka plan ROI için seçildi. tüm görüntü alanı üzerinde hücre analizi sağlamak Alternatif yöntemler hücreleri olmadan bir gölgeleme maskesi kullanımı, birden fazla arka plan ROI&#39;leri, ya da aynı örneklerini ve bir protokol istek üzerine mevcuttur. 3D FRET görüntülemeye özgü prob yanıt analit (Şekil 6) hidrojel geçirgenliği son derece duyarlıdır. Bu nedenle, aynı hidrojel bölgeleri tercihen geometrisi simetri noktasında Burada kullanılan şekilde iskele merkezi olarak, deneysel tedavi boyunca karşılaştırılır. Seçenek olarak ise, mikro-akışkan odalar / biyoreaktörler hızlı ve homojen bir analit çözelti 45 ile hidrojel perfüze edilmesi için kullanılabilir. Bir FRET sinyal hidrojelin otofloresans çok yüksek olduğunda (sinyal gürültü oranı çok düşük olduğu) tespit edilemeyebilir; Daha ince bir hidrojel veya farklı prob (farklı flüorofor) kullanılmalıdır.photocrosslinked hidrojellerin 3D FRET görüntüleme ile ilgili olarak, asgari ışınlama maruz kalma ve sonda fluorophores uyarma spektrumları dışında dalga boylarının kullanılması tavsiye edilir. LAP başka potansiyel hücresel hasara 31,46 en aza indirmek için 405 nm&#39;de bir görülebilir ışık kaynağı ile birlikte kullanılabilir. Bu sonda beyazlatma minimize Ancak, 365 nm radyasyon ile kullanarak LAP tavsiye edilir. zirve uyarma yatıyor nm 405 ise 365 nm, CFP donör uyarma spektrumunun kuyruk sonunda yatıyor. Seçenek olarak ise, prob sentezleme bir gün kurtarmak için izin verilebilir. İkili sondaların kullanılmasıyla ifade seviyeleri ve verici ve alıcı florofor moleküler difüzyon farklılık- larına karşı duyarlılığın sorunlarını en aza indirir. İkili-olmayan problar kullanılır, ancak SE yerine eksitasyon ve emisyon spektrumları spektral akmalarını için QE görüntüleme ve ek düzeltme ile (aşağı bakınız) olabilir. Ayrıca, düşük ticari kullanılabilirlik ve FRET probları tasarımı karmaşıklığıbir engel olabilir. Başarılı deneyler için en kritik faktör floresan sinyalleri doğru düzeltme ve analiz kalır. FRET oranı Alternatif bir hesaplama ışıkla ağartma minimize yanında birkaç ek nedenlerle kullanılır. Ikili tek zincirli probları için, sık bildirilen oran donör uyarma (söndürüldü emisyon, QE), yani altında donör emisyonuna donör uyarma (duyarlı emisyon, SE) altında alıcı emisyonu, oranı = SE / QE 25,47,48 FRET. SE / QE FRET verimliliği 21,22,47 değişikliklere doğrusal olmayan görecelidir. Yani oran probu (Ei) doğasında FRET verimliliği katlanarak doğrusal olmayan bir ilişki vardır (Donius, AE, Táboas, JM yayınlanmamış çalışma. (2015)), daha az yaklaşık% 15 oranında daha Ei oran en lineer. SE / QE da aktive sondalar (FAP, yani analit bağlayıcı prob fraksiyonu) fraksiyonu hafife. therefoyeniden, SE / QE analizi hantal bir denge doz tepkisi çalışması ve eğri fit gerektirir. Neyse ki, alıcı uyarma altında alıcı emisyon SE veya QE oranları (AEM) yani Ei ve FAP, açısından doğrusal, FRET oranları SE / AEM ve QE / AEM. SE / AEM genellikle ikili problar için kullanılan ve yalnızca (prob aktivitesi ve tam prob aktivitesi) uç nokta kalibrasyon gerektirir, ancak bazal hücresel sinyal bu zor yapar. Son nokta kalibrasyon ihtiyacını ortadan kaldırmak için, SE donör ve alıcı uyarma ve emisyon spektrumları spektral örtüşme (spektral boşaltma yoluyla) ve kombine prob fluorophores ve mikroskop kuantum verimi ve spektral duyarlılık (QS) için (CSE) düzeltilebilir görüntüleme sistemi. CSE dayalı düzeltilmiş SE FRET oranı, yani bir görüntü, E SE = CSE / AEM her pikselin içinde prob gözlenen FRET verimliliği tanımlar. Ticari ve özgür yazılım bu etkilerin SE düzeltmek için kullanılabilir veokuyucu yöntemleri 50 ayrıntılı bir açıklama için Chen ve Periasamy 2006 çalışmaları denir. Ancak, E SE hesaplanması zaman noktası (SE, QE, AEM) başına üç resim kanallarının yakalama gerektirir. Sadece iki görüntü kanallarının yakalama (QE ve AEM) gerektirir QE / cAem, - Bu nedenle, bu çalışmada biz de alternatif bir FRET oranı E QE = 1 kullanır. Bu kanallardan E QE hesaplanması sadece QS (cAem = AEM QS x) için AEM düzeltme gerektirir. QS = Dem / AEM kolayca Dem alıcı ağartılmış ile donör uyarma altında donör emisyonu bir kalibrasyon numunesi, iki görüntüleri kullanarak tahmin edilmektedir. Herhangi bir anda FAP prob Ei E SE veya E QE karşılaştırılarak hesaplanabilir. Sonuçta, FRET oranı seçimi (E QE = QE / cAem vs E SE = CSE / AEM) prob Çeşidi değerlendirilmesi ve en iyi sinyal ile kanallarda dayanmalıdır. İkisizamanla otofloresansı değişikliklerin hesaba yukarıda tarif edildiği gibi yaklaşırsa kare başına görüntü arka plan gürültü düzeltme bulunmaktadır. Bunlar genellikle tasarım ve mikroskop filtre yapılandırmasını soruşturma nedeniyle durum Dem uyarma spektrumu içine AEM uyarma ışık hiçbir örtüşme varsayalım. Tek zincirli probları birini kullanabilirsiniz ve seçim kamera gürültü en iyi sonda sinyali (parlaklık) ve SE ve QE kanallarda arka plan sinyali dayanır. ICUE1 prob ve burada kullanılan deneysel koşullar (hücre ve hidrojel tipleri) için, SE QE daha güçlü bir sinyal var. Çift zincirli Probes dolayı verici ve alıcı florofor arasında eşit olmayan moleküler dağılımına e se kullanımını gerektirir. Gibi ICUE1 olarak analit bağlanması üzerine FRET azalma biz E SE = 1, burada olduğu gibi verim analit bağlanması üzerine olumlu bir sinyal değişikliği sunmak &quot;ters&quot; olabilir FRET problar için - CSE / AEM veya E QE = QE / (AEM QS x). th analizie FAP FRET oranlarının uygun bir düzeltme ve Ei tahmin duyarlıdır. Bu QS için kullanılan aynı kalibrasyon numunesi ve geleneksel bir bitiş noktası ile FRET tahmin edilebilir Ei = 1- (QE görüntü alıcı photobleaching ve Dem görüntü ardından) 28, ama dikkat edilmelidir (/ Dem QE) en aza indirmek için verim deneyi verici kazara ağartma. QS arındırılmış AEM göre Dem tahmini, ikame edilmiş bir modifiye edilmiş versiyonu tarif yani Ei = 1 - (QE / (AEM) qS x). Alternatif olarak, Ei = CSE / AEM kullanılabilir. canlı hücrelerde Ei Tahmini tüm sondalar tam FRET tahrik olmasını gerektirir. Bu analit bağlanması üzerine FRET azalma gibi ICUE1 olarak problar için pratikte elde etmek zordur. Hücre lizatları ve saflaştırılmış analit ile Ei bir in vitro bazlı hesaplama iyi olmakla birlikte, bu işin kapsamı dışındadır. Burada hücrelerde cAMP azaltmak için 2 &#39;, 5&#39;-dideoksiadenozin kullanmanızı öneririz. Ancak, göreceli FAP b olabilirE sinyalizasyon taban seviyesinden türetilmiş bir Ei tahmini kullanılarak hesaplanmıştır. Bu nedenlerle, çalışmalar en sık agonist eklemeden önce sinyal temel sinyalini doyurur ikinci agonist ekledikten sonra alt sınır ve sinyal olan uç nokta kalibrasyon dayalı FRET oranını (burada yapıldığı gibi) ya da bir akraba FAP üst olduğunu rapor bağlı. Forskolin genellikle cAMP sinyali doyurulması için bir kontrol agonist olarak kullanılır. Alternatif olarak, cAMP analogu kullanılabilir örneğin 8-Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-siklik monofosfat olarak. deneysel tedaviler arasında sinyal yolundaki potansiyel değişiklikleri belirlemek için çalışmaların bitiminde kullanılan pozitif kontroller tavsiye edilir. hücre başına ortalama sinyal yanıtı hesaplanması çeşitli faktörlere göz önüne alınmasını gerektirir. İlk olarak, ortalama FRET oranı, bir hücre içinde, her pikselin oranlarının ortalaması olarak hesaplanmalıdır, yani, (Σ (QE/cAem)) / (piksel sayısı) yerine RABir hücrenin ortalama QE ve AEM, yani, (ΣQE) / (ΣcAem) arasında bölüm. arka plan gürültü düşük olduğu için ikinci dikkatli maskeleme gerektirmez rağmen, ciddi, gerçek ortalama FRET oranını göz ardı ediyor. Ancak, piksel oranları kayan nokta hesaplama ve İB&#39;leri tanımlamak ve hücre dışına arka plan gürültü üretilen sahte oranları dahil önlemek için hücre alanının dikkatli ikili maskeleme gerektirir. Tüm hücre alanı hücre şekline öngerilme sonuçları önlemek için ölçülebilir olmalıdır. maskeleme hücre şekli ve göç değişikliklere bağlı olarak zamanla yeniden gerekebilir. dışlama kriterleri QE ve hücresel seviyelerinin altına düşmesi ve yakın plan düzeyleri AEM sinyallerden piksel oranlarını kaldırmak için tanımlanan Alternatif olarak, hücrenin daha ROI büyük kullanılabilir. açıklanan analiz yöntemleri ayrıntılı özel yazılım / eklentileri olmadan FRET analizi için bu çalışmada kullanılan temel adımlar. Mikroskop üreticileri ve diğer satıcılar add-on modülü satmakOtomatik oranlı metrik destekleyen ve analiz FRET onların mikroskop yazılımı için s. Aynı şekilde, kamu malı ImageJ yazılım gibi RiFRET olarak parçacık ve FRET analizi için kullanılabilecek birkaç eklentileri vardır. Bir 2D görüntü kullanıldığı için İkincisi, piksel tabanlı ortalama FRET oranı 3D hücresel yapının gerçek ortalama oranını göz ardı ediyor. 2D sinyalleri temsil eden ve Z ekseni boyunca ortalama. Canlı hücrelerde FRET oranlarının 3D mekansal dağılımı hesaplanması yüksek hızlı 3D görüntüleme olmadan mümkün değildir (örn., Kullanarak disk konfokal mikroskopi iplik). Bu 2D ve 3D kültürleri hem de bir sorun, ancak uçağın dışında var olan hücresel yapının daha fazlası gibi 3D büyük bir etkiye sahiptir. Bu tür plazma zarı EPAC1 prob PM-ICUE gibi hücresel yapılar, lokalize problar için büyük bir endişe kaynağıdır. Spiering et al. 2013 önerileri oranı hesaplamaları 24 hücre kalınlığı etkileri düzeltmek için. AEM dağılımının analizi için kullanılabilirSonda ayarlanmış hücre ve görüntüleme uçağın bölgelerinde birikir algılamak. Bu aynı zamanda, FRET oranlarının dağılımını yorumlamak ve sahte sonuçlarını ortadan kaldırmak için yardımcı olacaktır, örneğin., (Düşük AEM bölge düşük prob konsantrasyonuna sahip olacak ve prob doygunluk ve yüksek FRET oranını gösterebilir yani) prob doygunluğu belirlenmesi. Üçüncü olarak, farklı bir FRET bazal seviyeleri, Transfeksiyon etkinliğindeki farklılık gösterir Deney grupları arasında ifade veya bazal sinyal prob olabilir. &quot;Bağıl Analizi&quot; (Adım 10.1.1) varsa zamanla FRET oranında sürüklenme temizlenmesine yardımcı olur. Bu örnekler arasındaki tepkilerin nispi büyüklük karşılaştırılmasını kolaylaştırır, ancak referans numunesi için tepki (kontrol arsa düz bir çizgidir) zaman-ders karşılaştırma engellemektedir. &quot;Mutlak Analizi&quot; (Adım 10.1.2) örneklerin arasında yanıtın oranı karşılaştırılmasını kolaylaştırır, ama her satırı bir dissim tarafından ölçekli çünkü yanıtın büyüklüğü karşılaştırılmasını engellemektedirIlar sabiti. Çalışmalar genellikle zaman içinde FRET oranında sürüklenme düzeltmek için başlangıçtaki bir lineer regresyon kullanın. tarif 3D FRET yöntemi imal ve diğer prob ve görüntüleme yöntemleri uygulanabilir hücre yüklü 3D hidrojeller, zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için yararlı ve pratik yoludur. yukarıda tartışıldığı gibi tek zincirli ikili sondalar yanında diğer FRET sistemi, yoğunluk tabanlı sinyallerin daha karmaşık düzeltme yapılması gerekir. Alternatif olarak, FRET (FLIM-FRET) floresans süresi görüntüleme sensörü verici emisyon ömrü bir değişiklik ile FRET verimliliği hesaplamak için kullanılabilir. Yoğunluk tabanlı FRET aksine, Flim-FRET arka plan gürültüsü, spektral kanaması-through, kuantum verimliliği ve dedektör spektral duyarlılık 2 duyarsız. Ancak, Flim sistemler, pahalı, karmaşık ve nadir olan ve tek üs çürüme ile fluorophores ve hiçbir Flim 49 run-off ile iyi çalışır. tarif edilen yöntem aynı zamanda mo ile kullanılabilecektirgelişmiş mikroskop platformları yeniden (örn., FRET TIRF, floresan anizotropi ve spektral korelasyon FRET). yüksek hızlı konfokal ve multiphoton mikroskobu ile 3D görüntüleme için bu yöntemi uygulamak sinyal yanıt alt hücresel dağılımı analizi kolaylaştırmak ve analiz sinyal doğruluğunu artıracaktır. Bu 3D FRET yöntemi simüle 3D hücresel mikroçevrelerde gelişmiş hücre biyolojisi çalışmaları sağlayacaktır. Bu nedenle, hali hazırda, farmakoloji ve hücreler arası sinyal okuyan ve lamine hidrojel bazlı microtissues ilaç tepkisi tarama içeren rejeneratif tıp ihtiyaçlarına uygulanabilir.

Hücresel sinyal karmaşık ve farmakoloji, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp gibi bir çok alana ilişkin netice hem de. Faydalı araştırma araçları hücre biyolojisi anlayışımızı ilerletmek için ve doku rejenerasyonu için optimal malzemeler geliştirmek için gereklidir. Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme reseptör aktivasyonu, moleküler yapısındaki ve canlı hücrelerde supramoleküler etkileşimler (örneğin., Protein / DNA kompleksi oluşması) analizi sağlayan önemli bir araçtır. FRET floroforlar 1 ila radyatif olmayan enerji transferi türüdür. Bir verici florofor ve alıcı florofor arasındaki mesafenin altıncı gücüne ters orantılı olan bir verimliliğe sahiptir. (- 10 nm tipik olarak 1) 2 Bu nedenle, nanometre ölçeğinde iki farklı moleküller arasındaki ya da bir molekülün bölgeler arasında mekansal mesafe hakkında bilgi verebilir. donör ve alıcı fluorophores farklı m olabilirolecule türleri donör yüksek enerji emisyonu (kısa dalga boyu) sahip olduğu (hetero-FRET), ya da aynı tip (homo-FRET). FRET Görüntüleme sabit veya canlı hücreler üzerinde yapılabilir, ancak yüksek hızlı konfokal sistemleri kullanılamaz olduğunda genel olarak sabit hücreler yüksek uzaysal çözünürlükte moleküler etkileşimlerin görüntüleme için kullanılır. Canlı hücreler tepki 3 sinyalizasyon gerçek zamanlı hücre içi olarak inhibe veya fiksasyon değişmiş etkileşimleri ve süreçleri incelemek için kullanılır. istihdam Canlı hücre çalışmaları nedeniyle sadelik ve alt arka plan (düzlem hücre dışına hiçbir emisyon) bir parçası görüntüleme kullanacağım iki boyutlu (2D) hücresel kültürleri FRET. Bununla birlikte, 2B kültürleri de fizyolojik mikro ve üç boyutlu (3D) kültür 4,5 kıyasla birçok hücresel prosesleri değiştirebilir. Örneğin, hücre dışı matris etkileşimlerine hücre ve hücre yerli hücre ölçüde EAS giden 2B kültür içinde değiştirilirily hücre morfolojisi ve polarite 6 değişiklikleri gözlemledi. Bu iskelet parçaları 7,8 ve hücre şekli ve hücre iskeleti yapısı güçlü mekansal kültür ortamında 9 düzenlenir bağlamak için membran mikro (örn., Kaveolanın ve lipid sallar) ve reseptör sinyal kuvvetli kısmen kültür ortamı tarafından düzenlenir. Mechanotransduction sadece 3D matriks tarafından etkilenmiş, ancak daha karmaşık ikincil yükleme koşulları 2D kültürleri 10 oranla 3D ortamlarda doğurduğu değildir. Son olarak, 3D matrislerin geçirgenliği difüzyon azalmış ve 2B kültürlerine kıyasla sinyal molekülleri hücrenin artan bağlama ile, genel olarak, kültür ortamı daha azdır. 3D kültürlerle bir yapıştırıcı, kimyasal ve mekanik ipuçları ile ilgili fizyolojik daha benzer bir mikro oluşturmak ve gözlemlemek mümkün değildir. Hücre etkileşimleri hücre teşvik edilebilir ve yapışkan özellikleri W kontrol edilebilir3D malzemenin 11-13 yapısı, kompozisyonu ve mimari (desenleme) i. Malzemenin mekanik özellikleri de aynı şekilde, bileşim ve yapı 14,15 ile ayarlanabilir. Hidrojeller hücreleri Kültürleme bu nedenle izin aksi de-ayırt etme olur birincil hücre veya konvansiyonel teknikler kullanılarak fenotip değişim, örneğin üzerine çalışmalar FRET., Eklem kıkırdağının hücreleri. Bu durumda, bir yöntem olup, canlı 3D kültürlerde FRET tahlilleri sağlamak için gereklidir. Onlar optik şeffaf ve mikro kontrol etmek ve hücresel ipuçları sağlamak için uygun olabilir çünkü hidrojel iskeleleri 3D FRET tabanlı çalışmalar için idealdir. Doğal polimerlerden yapılan Hidrojeller jelatin ve fibrin 16 de dahil olmak üzere on, hücre kültürü kullanılmıştır. Hücresel mikro üzerinde daha fazla kontrole Bu polimerlerin kimyasal değişiklik ile ve sentetik polimerler 17,18 kullanımı ile elde edilebilir. hydrMekanik sertliği Ögel ve geçirgenlik polimerik bileşiminin değiştirilmesi ile kontrol edilebilir ve boyut (polimer ve çapraz bağlama yoğunluğunu) 19,20 örgü. Bundan başka, hidrojeller, büyüme faktörleri ve hücre ligandlann eklenmesi vasıtasıyla biyoaktif yapılabilir. Çünkü bu olasılıklar, biosensörleme, ilaç dağıtım ve doku mühendisliği uygulamaları için hidrojellerin geliştirme araştırma 21 çok aktif bir alandır. Hidrojellerin 3D baskı da mikro-dokuların imalatı için geliştirme çalışmaları ve 15 -organs edilir. Bu nedenle, hidrojeller hücrelerin FRET görüntüleme fizyolojik hücre davranışını tahmin etmek için bir araç olarak yararlı, aynı zamanda çalışma ve mühendislik doku büyümesini optimize etmek için, bir araç olarak değil sadece. İkili rasyometrik FRET probları sinyal iletimine eğitim çok yararlıdır ve hidrojel kültürlerde kullanılabilir. yayınlanan floresan kısmi listesi ve sondalar FRET, Hücre Göç Consortium web sitesine bakın <sup&gt; 22. En yaygın prob tipi bir tanıma eleman (lar) (analit hassas bölge) ile ilişkili veya bağlantılı iki farklı flüorofor içerir. Bu bölgeler fluorophores ve bu nedenle FRET büyüklük (ya daha yüksek ya da daha düşük) arasındaki mesafeyi değiştirir (bir iyon veya molekül bölgenin enzimatik bölünme bağlanması, örn.) Analitin saptanması üzerine bir yapısal değişim, ilişkiyi, ve ayrılmayı geçmesi 23. Daha az yaygın ama kullanışlı prob tipi FRET büyüklüğünü değiştirir iki fluorophores spektral örtüşme, bir analit duyarlı değişim dayanır. &quot;Tek zincirli&quot; rasyometrik problar tek bir molekül üzerinde bağlanmış bir flüorofor çifti kullanmaktadır. &quot;Çift zincirli&quot; Problar farklı moleküller üzerinde florofor çiftleri kullanan, ancak sentezleme aynı ekspresyon kaseti 24&#39;e bağlanabilir. Tek fluorofor ifade ile çalışmalar (örn., Floresan füzyon proteinleri), çalışmalar oranlı metrik aksineFRET Probes transfeksiyon verimliliği ya da hücre canlılığında kontrol etmek için, çift transfeksiyon gerektirmez. Asgari eşik (hassas konsantrasyon) 23,25 üzerinde sentezlendiğinde oranlı metrik FRET probları transfeksiyon verimi nispeten duyarsızdır. Onlar uyarım kaynağı dalgalanmaları ve diğer hücre içi çevre faktörleri (örn., PH, iyonlar) çok uzun hem fluorophores benzer duyarlı olarak duyarsızdır. Floresan ve biyolüminesens promotör-muhabir 26,27 yapıları aksine ek olarak, tepki, transkripsiyonel gecikmeye tabi değildir. Oranlı metrik FRET probları kolay ve sık sık geleneksel widefield Epifloresans mikroskop sistemleri kullanılmaktadır. Widefield mikroskoplar çünkü sistem maliyeti, fluorofor ağartma ve yeterli zamansal çözünürlüğe sahip sinyal değişikliklerinin yakalanması ilişkin endişelerin canlı hücre görüntüleme için çizgi tarama konfokal sistemleri tercih edilir. Buna ek olarak, tek bir hücre Analhücrelerin büyük bir nüfus üzerinde Salman kararı görünümünün birden alanlar üzerinde bir motorlu sahne ve görüntü yakalama ile mümkündür. Widefield mikroskopi hetero-FRET prob sinyallerinin yoğunluğu bazlı analizini gerektirir. Yoğunluk analizi diğer FRET yöntemler gibi karmaşık donanım gerektirmez rağmen, daha alım sonrası çalışma fluorofor davranışları ve mikroskop / görüntüleme sistemi konfigürasyonları 28 etkilerini düzeltmek için gereklidir. Bir florofor yakalanan emisyon yoğunluğu uyarım enerji fonksiyonu floroforu kuantum verimi ve kombine filtre ve kamera / detektör spektral duyarlılık ve doğrusallık 2&#39;dir. Bu verici ve alıcı için farklı olabilir ve kantitatif analiz için kalibrasyon gerektirir. Buna ek olarak, alıcı emisyonu görüntüleme (donör ikaz ışığı ile alıcısı uyarma ve kanama-through donör emisyonunun akseptör emisyon spektrumları içine) fluorophores spektral örtüşme etkilenir 2.4 Tek zincirli çift zincirli &quot;prob bir hücre 25,28 boyunca farklı stoichiometries var olabilir ise flüoroforların.&quot; &quot;Probları flüoroforlar ise, kendi flüoroforlar nano ekimolar, çünkü iç normalleştirilir&quot; tek zincir &quot; problar içindeki parlaklık (ekstinksiyon katsayısı ve kuantum verimi fonksiyonu), doğrusal olmayan, detektörün hassasiyetindeki etkileri eşiğe ve 23 gereklidir bağlanmış kuantum verimi / detektör duyarlılığı için küçük ve sadece düzeltilmesidir vardır. Bu nedenle &quot;tek zincirli&quot; oranlı metrik FRET probları en kolay widefield mikroskopi 24 uygulanmaktadır. Bu kağıt, geleneksel geniş açılı epifluorescent mikroskop kullanarak 3D hidrojel kültürlerde canlı hücrelerin FRET görüntüleme gerçekleştirmek için basit bir yöntem açıklanır. Kolayca zaten 2D FRET deneyler, hem de Inter ile ilgilenen laboratuarlar yürüten laboratuarları tarafından kabul edilebilirmicrotissues hücresel sinyal. Burada siklik adenozin monofosfat (cAMP) foto-çapraz içinde canlı kondrositlerde seviyeleri (PC-jel, polietilen glikol dimetakrilat) ve thermoresponsive (TR-jel, Matrigel) hidrojellerinin arasında FRET görüntüleme göre ölçüm yöntemini göstermektedir. Bir rasyometrik FRET prob forskolin, cAMP ATP dönüşümünü katalize adenilat siklaz için bir kimyasal agonist yanıt olarak cAMP seviyelerini tespit etmek için EPAC1 (ICUE1) göre kullanılmaktadır. cAMP G-protein kenetli reseptör sinyalini aracılık başlıca ikinci haberciler biridir ve doğrudan cAMP (EPACs) tarafından aktive aşağı değişim proteinleri dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin, aktive eder. flüoroforlar cAMP FRET bir azalma ile sonuçlanan EPAC alanına bağlanması üzerine birbirinden ayrılır. 3D hidrojeller hücre hidrojel malzemelerin hazırlanması, ICUE1 probuyla birlikte hücre transfeksiyon ve gömme burada açıklanmıştır. 3D FRET Deney prosedürü ve gerekli görüntü analizihücre başına sonda etkinliği açıklanmıştır değerlendirmek. Biz de widefield mikroskopi kullanılarak 2D ve 3D FRET analizi doğasında sınırlamaları tartışmak. Bir daha fizyolojik bağlamda analiz sağlar ve daha az görüntü düzeltme ve kalibrasyon gerektirmeyen beri burada sunulan teknik mevcut 2D yöntemleri üzerinde bir gelişmedir. Büyük yardımcı hücresi ve transfeksiyon tercihleri ​​korunabilir ise birçok şeffaf malzemeler kullanılabilir gerçeğinde yatar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td>
			<td style="width:119px;">NC0162601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM)</td>
			<td style="width:71px;">Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95904</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6514</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">3-glycidoxypropyltrimethoxysilane</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">440167</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">149470-5g</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC244280100</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC149670010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC199871000</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">190764</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sigmacote (siliconizing reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">SL2</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Toluene&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC36441-0010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH3025601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11058-021</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cellstripper (cell dissociation solution)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-056-CI</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Forskolin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipette Tips (10,200,1000 &#956;l)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-149-863B</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">01-213-100</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Biopsy punch (3 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">3332</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544C</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precoated glass coverslips (epoxysilane)</td>
			<td style="width:71px;">Arrayit</td>
			<td style="width:119px;">CCSL</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass slide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12550D</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile vials (15 mL, 50 ml conical)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-70C, 14-959-49A</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish (6-well)</td>
			<td style="width:71px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351146</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Epifluorescent Microscope with motorized stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Adjustable Specimen Holder for XY Stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">77011393</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MRD01605</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source &#38; wheel, Lambda emission filter system)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Sutter Instrument reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77016231, 77016088</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">CYF/YFP filter set</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Chroma Technology Corp)</td>
			<td style="width:119px;">77014928</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:216px;">Camera (ORCA Flash 4.0 v1)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Hamamatsu reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77054076</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab-equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">NIS-Elements 40.20.02 microscope software)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MQS31100&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Prism (spreadsheet and graphing software)</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software, Inc</td>
			<td style="width:119px;">Version 6</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (&#955;=365 or 405)</td>
			<td style="width:71px;">OmniCure</td>
			<td style="width:119px;">S1000</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pipette Aid&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DP-100</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:71px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Reichert Bright-Line 1475</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vacuum desiccator chamber/degasser&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Chemical Fume Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Oven</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Spatula</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fret imaging in three-dimensional hydrogels

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücre biyolojisi incelemek için güçlü bir araçtır. FRET kullanan Çalışmalar genellikle üç boyutlu (3D) hücresel mikro taklit değil iki boyutlu (2D) kültür, istihdam. 3D hidrojel ortamında hücrelerin geleneksel widefield Epifloresans mikroskopi kullanılarak söndürüldü emisyon FRET görüntüleme gerçekleştirmek için bir yöntem sunulmuştur. Burada sonda aktivasyon aralığında lineer oranlarını verir rasyometrik FRET prob için bir analiz yöntemi tarif edilmektedir. intraselüler siklik adenosin monofosfat (cAMP) seviyesi ölçümü, EPAC1 aktivasyonu (ICUE1) ve hidrojel malzeme tipi, bu tarifnamede, bir foto-çapraz hidrojel (PC jel bağımlı sinyal cAMP farklılıkları tespit etme yeteneği için bir sonda kullanılarak forskolin stimülasyon altında kondrositlerde gösterilmiştir polietilen glikol dimetakrilat) ve thermoresponsive hidrojel (TR-jel). 2D FRET yöntemleri ile karşılaştırıldığında,Bu yöntem çok az ek çalışma gerektirir. Zaten 2D FRET görüntüleme kullanan laboratuvarlar kolayca 3D mikro-hücresel çalışmalar yapmak için bu yöntemi kabul edebilirsiniz. Bundan başka, işlenmiş 3D microtissues yüksek verimlilik gösteren ilaç tarama uygulanabilir. Buna ek olarak, bu tür anizotropi ölçümü ve floresans ömrü görüntüleme (FLIM) gibi ileri mikroskopi konfokal kullanarak platformlar, darbeli ya da modüle edilmiş aydınlatma ile FRET görüntülemenin diğer formları, uyumludur.

Tüm hidrojel ön hücreler, döküm kalıpları yukarıda tarif edildiği gibi hazırlandı. Hücre yüklü habercisi çözümleri PDMS kalıplara döküm ve sonra lamel yakın hücreleri hareketsiz ve üzülmek görüntüleme analizi (Şekil 1) kolaylaştırmak için foto-/ jelleşme önce santrifüj edildi. Ekli lamelleri ile hidrojellerin mikroskopik görüntüleme (Şekil 2) için hazırlanan PDMS görüntüleme kuyuları içinde yerleştirildi. Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi optik konfigürasyonlar ve görüntü elde parametreler belirlenmiştir. İkili-olmayan problar için gerekli olduğu gibi CFP YFP fluorofor çiftleri için dört FRET ilgili görüntü kanallarının Yakalama, altında (bakınız &quot;Optik Conf.&quot; Şekil 3&#39;te) gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu çalışmada sadece iki resim tek zincirli ikili ICUE1 prob, QE = &quot;CFP CFP&quot; ve AEM = &quot;YFP YFP&quot; (uyarma emisyon) için gereklidir. Çoklu FOVs (xy konumus) birçok hücre homojen aydınlatma alanı (Şekil 3B) içindeki ikamet ettiği seçilmiştir. zaman atlamalı kazanılmasından sonra, prob için sinyal veri ihraç edildi. ROI kanallı sinyallerin arka plan düzeltmesi ve hücre analizi için deney (Şekil 4) başlangıcından eşiklenir AEM görüntüleri kullanılarak tayin edildi. Hücreler ifade gibi hücre havuzu arasından seçildi yeterli (çok loş değil), ama çok yüksek değil (aşırı parlak) prob (Şekil 4B). Her edinilmesine piksel başına QE ve SE FRET oranları arka plan çıkarılır görüntü kanallarının floating-point bölümü kullanılarak hesaplandı. Hücre başına ortalama FRET oranı (yani, ROI başına) hesaplandı uyarım öncesinde bazal sinyaline normalize (yani, her zaman noktalarında çıkarılır bazal bir regresyon) ve standart hata olarak hata barları ile çizilen ortalama (SEM). QE ve CSE tabanlı FRET oranları de her ikisi deforskolin uyarılması (100 nM, Şekil 5) altındaki kondrositlerde artan cAMP aktivitesi korunmalıdır. QE sinyali nedeniyle hidrojellerin içinde gömülü kondrosit cAMP aktivitesi düşük bazal seviyeye düşük olduğundan QE FRET oranı CSE FRET oranından daha arka plan düzeltme daha duyarlı idi. Hem hidrojel türleri (TR-jel ve PC-jel) forskolin ilave bir artış, cAMP sinyal yanıtını gösteren zaman FRET oranında bir artış (Şekil 6), gösterdi. QE FRET oranı ile gösterildiği gibi, PC-jel hidrojeller kondrositlerin cAMP daha büyük bir değişiklik (gösterilmemiştir) ve cAMP (E QE daha yüksek bir taban seviyesini gösterir = E QE = TR-jel içinde 0.09 vs PC-jel içinde 0.19, ) temel çıkarılan resimde gösterildiği değil. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> Şekil 1: Photocrosslinked Hidrojel (PC-jel) Hücre Dağılımı </strong&gt; A: Hücre yüklü hidrojel habercisi lamel yakın bir odak düzleminde hücrelerin sayısını arttırmak için santrifüj edildi. B: Bu FOV hücrelerin sayısını artırır ve düzlem hücrelerin üzerinden arka plan sinyalinin en aza indirir. (Ölçek çubuğu = 200 mikron) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> Şekil 2: PDMS Bulaşık Hidrojel Hidrojel mikroskopik görüntülemesi ve analit uyarılması için bir lamel baz ile yüksek bir PDMS de (hidrojelin 10x hacim) içine yerleştirilmiştir. bu deneyde boyunca yerinde kalması için PC jel hidrojellerin şeffaf ve lamel bağlanmaktadır. PDMS ayrıca en ek olarak daha geniş bir biyopsi zımba kullanılarak hidrojel hacmi 10 kat daha fazla orta içeren daha büyük yapılabilmektedirhicker PDMS levha. (Ölçek çubuğu = 2 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> Şekil 3: FRET Görüntüleme için Edinme Yapılandırma A: iktisap birden çok yerde görüntü yakalamak için her 7 saniyede yapılandırıldı. QE FRET oranı hesaplamasına sadece iki görüntü kanalları altında burada kullanılan ICUE1 probu (ikili tek zincirli prob), QE = &quot;OBP OBP&quot; ve AEM = &quot;YFP YFP&quot; (uyarma emisyon) için gerekli olan &quot;Optik Conf.&quot; mikroskop yazılım λ sekmesinde sütun. B: FOVs ( &quot;XY&quot; pozisyonlar) birçok hücre homojen aydınlatma alanı içinde ikamet ettiği seçilmiştir. Resmin altındaki arsa mavi boyunca aydınlatma yoğunluğu hattını oklu gösterirBu FOV merkezi aracılığıyla erişir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> Şekil 4: FRET Görüntüleme Analizi ROI Seçimi A: Hücrelerin serbest faiz (ROI) bir bölge her kanalda arka plan sinyali düzeltmek için seçildi. hücresiz hidrojel yerine bir resim hücre yoğunluğu veya geçiş yüksekse, ya da hücrelerin homojen bir aydınlatma alanı içinde yer olmadığında gölgelendirme maskesi kullanılmazsa geri çıkarma için de kullanılabilir. B: Hücre ROI görüntü eşikleme ve AEM kanalının ikili maskeleme kullanılarak seçildi. nedeniyle arka plan n üretilen hücre dışı oranlarının eklenmesi nedeniyle olumsuz hücre başına ortalama FRET oranının hesaplanmasını etkileyecek hücrelerden daha büyük bir ROI seçmeoise. Bu oran hafife olarak, hücre başına her kanalın ortalama kullanarak selüler FRET oranının hesaplanması önerilmemektedir. (Ölçek çubuğu = 50 um) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> Şekil 5: Thermoresponsive Hidrojel (TR-jel) içinde FRET Oranlarının Karşılaştırılması QE ve SE tabanlı FRET oranları Hem forskolin stimülasyon altında kondrositte artan cAMP aktivitesini algılar. Forskolin cAMP üretimini indükleyen bir adenil siklaz agonistidir. ICUE1 prob cAMP&#39;yi bağlandığında FRET azalır ve böylece QE FRET oranı (E QE = SQE / (SAEM QS x)) artar. Tersine, SE FRET oranı azalır ve böylece E SE = 1 olarak çizilir - CSE / SAEM. hidrojel gömülü kondrositlerde, QE FRET oranı düşüklüğü nedeniyle bazal cAMP etkinliği SE FRET oranından daha arka plan düzeltme QE sinyali düşük olduğundan daha duyarlıdır. Hata çubukları = SEM, n = 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> Şekil 6: Farklı Hidrojeller içinde FRET Oranının Karşılaştırılması Her iki hidrojel tipler kondrositler zaman içinde artış QE FRET oranı gösterdiği gibi, cAMP aktivitesi bir artış ile forskolin uyarılmaya yanıt verdi. Hidrojel tipi etkiler forskolin ve bazal hücre cAMP aktivitesi geçirgenlik farklılıkları dahil olmak üzere çeşitli etkileri vasıtasıyla hücresel yanıtı (E QE = E QE vs PC-jel içinde 0.19 = 0.09, TR-jel içinde, gösterilmemiştir). Hata çubukları = SEM, n TR-jel= 25, n PC-jel = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı hücre biyolojisi çalışmaları için güçlü bir araçtır. Burada alışılmış epifloresans mikroskopi kullanılarak fizyolojik üç boyutlu (3D) bir hidrojel mikro çevrelerinde FRET görüntüleme hücreleri için bir yöntem sunulmaktadır. Aktivasyon aralığında doğrusal oranlarını verir oranlı metrik FRET probları için bir analiz anlatılmıştır.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Üç boyutlu Hücre ekimi için Chip-ölçekli Yapı iskeleleri mikroimalat

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

Proteolytically Bozulmuş Aljinat Hidrojeller ve Porcine Oosit Kapsülleme için Hidrofobik Mikrobiyoreaktörler

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Üç Boyutlu Organoid ve Küresel Modellerin Boyama ve Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...