Name: electrophysiological method for recording intracellular voltage responses of drosophila photoreceptors and interneurons to light stimuli in vivo
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo at JoVE.com

The authors thank Mick Swann, Chris Askham and Martin Gautrey for their important contributions in designing and building many electrical and mechanical components of the rigs. MJ's current research is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC Grant: BB/M009564/1), the State Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning open research fund (China), High-End Foreign Expert Grant (China), Jane and Aatos Erkko Foundation Fellowship (Finland), and the Leverhulme Trust grant (RPG-2012-567).

The authors have nothing to disclose

We have presented the basic key steps of how to use sharp conventional microelectrodes to record intracellular responses of R1-R6 photoreceptors and LMCs in intact fly eyes. This method has been optimized, together with bespoke hardware and software tools, over the last 18 years to provide high-quality long-lasting recordings to answer a wide range of experimental questions. By investing time and resources to construct robust and precise experimental set-ups, and to produce microelectrodes with favorable electrical properties, high-quality recordings can become the norm in any laboratory working on Drosophila visual neurophysiology. Whilst well-designed recording and light stimulation systems are important for swift execution of different experimental paradigms, there are three procedural steps that are even more critical to achieving successful recordings: (i) to make the fly preparation with minimal eye damage, (ii) to pull microelectrodes with the right electrical properties, and (iii) to drive the recording electrode into the eye without breaking its tip. Ultimately, to record meaningful data, the investigator has to understand the physical basis of electrophysiology and how to fabricate suitable microelectrodes for the targeted cell-types.
Therefore, the limitations of this technique are primarily set by the patience, experience and technical ability of the investigator. Because this technique can take a long time to master for small Drosophila cells, it is advisable for trainee electrophysiologists to first practice with larger insect eyes, such as the blowfly36 or locust35, using the same rig. Once performing high-quality intracellular recordings from the larger photoreceptors and interneurons becomes routine, it is time to move on to the Drosophila eye. Another limitation of the technique concerns cellular identification. Penetrated Drosophila cells can be loaded electrophoretically with dyes, including Lucifer yellow or neurobiotin. However, because of the small tip size of the microelectrodes, electrophoresis works less efficiently than with lower resistance electrodes, such as patch-electrodes. Furthermore, the dye-filled microelectrodes characteristically have less favorable electrical properties, making it much harder to record high-quality responses with them from Drosophila photoreceptors and LMCs.
A technical problem that occurs sometimes is unstable input signal, or a complete lack of it. This is often associated with the voltage signal being either constantly drifting or higher/lower than the amplifier's recording range. On most occasions, this behavior is caused by the recording electrode being blocked (or its tip being too fine - having too high a resistance or intramural capacitance - to properly conduct fast signal changes). Although one can try to unblock the tip by buzzing the electrode capacitance, which sometimes works, often the situation is best resolved by simply changing the recording electrode. This may further require parameter adjustments in the microelectrode puller instrument to lower the tip resistance of the new electrodes. The electrode tip can also become blocked in preparations, for which it took too much time to cover the corneal hole by petroleum jelly. Prolonged air-contact can dry up the freshly exposed retinal tissue, turning its surface layer into a glue-like substance. If this is the case, the investigator typically sees a red blob of tissue stuck on the recording electrode when pulling it out of the eye. The only solution here is to make a new preparation. Petroleum jelly may provide many benefits for electrophysiological recordings: (i) it prevents the coagulation of the hemolymph that could break the electrode tip; (ii) it coats the electrode tip reducing its intramural capacitance, which lowers the electrode's time constant, and thus has the potential to improve the temporal resolution of the recorded neural signals40,41; (iii) it keeps the electrode tip clean, facilitating penetrations; and after penetration, (iv) it may even help to seal the electrode tip to the cell membrane42. 
The signal can further be unstable or lost when the silver-chloride wire of the electrode-holder is broken or dechloridized; in which case just replace or rechloridize the old wire. The missing signal can also result from one (or both) of the electrode-holders not being securely connected to their jacks. However, it is extremely unusual that a piece of equipment would be malfunctioning. If signal is undetectable and all other possibilities have been exhausted, test that each part of the recording apparatus, including the headstage, amplifier, low-pass filters and AD/DA-converters, are connected properly and functioning normally. One way to achieve this is to replace each instrument with another from a rig that is known to operate normally. Alternatively, use a signal generator to check the performance of the electronic components one by one.
But perhaps the most common technical problem facing the electrophysiologist is that of recording noise. Broadly, recording noise is the observed electrical activity other than the direct neuronal response to a given stimulus. Because the fly preparation, when properly done, is very stable, the observed noise (beyond the natural variably of the responses) most often results from ground-loops in the recording equipment, or is picked up from nearby electrical devices. Such noise is typically 50/60 Hz mains hum and its harmonics; but sometimes composed of more complex waveforms. To work out the origin of the noise, remove the fly preparation holder from the set-up, connect the recording and reference electrodes through a drop of fly Ringer (or place them in a small Ringer's solution bath; see step 1.2.6) and record the signal in CC- or bridge-mode. If noise is observable on the recorded signal, this likely means that the noise is external to the fly preparation.
Another good test for identifying the origin of noise is to replace the electrode-holders with an electric cell model connected to the amplifier. In an ideally configured and grounded set-up, the recorded signal should now be practically noise-free, showing only stochastic bit-noise from the AD-converter (in the best case not even that!). If noise is still present, then recheck that all rig equipment is properly grounded. A convenient approach to detect ground-loops is to: (i) disconnect all the grounding wires from all the parts within the rig; (ii) ensure that, after doing this, every single part is actually isolated from ground, by means of an ohm-meter; (iii) connect the parts, one by one, to the central ground directly, not through any other part of the rig. Try also changing the equipment configurations. For example, sometimes moving the computer and monitor further away from the rig can reduce noise; yet at other times, moving the computer inside the equipment rack reduces noise. It is also worth unplugging nearby equipment to see if noise is reduced, or shield additional components. Furthermore, try unplugging or replacing different components of the recording equipment, especially BNC cables (which can have faulty ground connections). If only bit-noise is observed when using the cell model, the initial noise source is either the electrodes or the fly preparation itself. For example, it could be that the reference electrode is inadvertently touching a motor nerve or active muscle fibers inside the head capsule (or disturbing flight muscles in the thorax - if placed there). It is usually simplest to prepare a new fly for recording, taking care to minimize damage to the fly. But if the noise persists and is broadband, it is likely that the electrodes are suboptimal for the experiments; too sharp/fine (hence too noisy) or just wrong for the purpose; we have even seen quartz-electrodes acting as antennas - picking up faint broadcasting signals! Although iteration of the puller-instrument parameter settings to generate the just right microelectrodes for consistent high-quality recordings from specific cell-types can take a lot of effort, it is worth it. Once the recording electrodes are well-tailored for the experiments, they can provide long-lasting recordings of outstanding quality.
Sharp microelectrode recording techniques can be similarly applied to study neural information processing in multitude of preparations, including different processing layers in the insect eyes and brain43,44. Because the microelectrode tips can be made very fine, these typically damage the studied cells less than most patch-clamp applications. Importantly, the modern sample-and-hold microelectrode amplifiers enable good control of the tips' electrical properties40,45-47. Thus, when correctly applied, this technique can provide reliable data from both in vivo3,5,7-10,44 or in vitro48 preparations with high signal-to-noise ratio at sub-millisecond resolution. Such precision would be impossible with today's optical imaging techniques, which are noisier and slower. Moreover, the method can be used to characterize small cells' electrical membrane properties both in current- and voltage-clamp configurations5,29,33,36,40-42,49, providing valuable data for biophysical and empirical modeling approaches7,8,11,33,49-54 that link experiments to theory.

De fruitvlieg (Drosophila melanogaster) facetoog is een geweldig model systeem om de functionele organisatie van fotoreceptoren en interneuron arrays voor neurale beeld bemonstering en verwerking te onderzoeken, en voor dierlijke visie. Het systeem heeft de volledigste bedradingsschema 1,2 en vriendelijk genetische manipulaties en nauwkeurige neurale activity monitoring (hoge signaal-ruisverhouding en tijdsresolutie) 3-10. De Drosophila oog is modulair, met ~ 750 ogenschijnlijk gewone lens bedekte structuren, genaamd ommatidia, die samen zorgen voor de een panoramisch gezichtsveld dat bijna elke richting rond haar hoofd bedekt vliegen. Primaire informatie van het oog bemonstering units zijn de rhabdomeric fotoreceptoren 7,8,11. Elke ommatidium bevat acht fotoreceptorcellen (R1-R8), die dezelfde facet lens delen maar zijn afgestemd op de zeven verschillende richtingen. Terwijl de buitenste fotoreceptoren R1-R6 are meest gevoelig voor blauw-groen licht, spectrale gevoeligheden van de binnenste cellen R7 en R8, die op de top van elkaar en wijzen in dezelfde richting liggen, vertonen drie verschillende subtypes: licht, geel en dorsale randgebied (DRA) 12- 15. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" /> Figuur 1. functionele organisatie van de Drosophila Eye. (A) De twee eerste optische ganglia, retina en lamina, worden grijs gemarkeerd in de vlieg oog. Retina R1-R6 fotoreceptoren en lamina Grote Monopolair Cells (LMCS: L1-L3) zijn gemakkelijk toegankelijk in vivo conventionele scherpe micro-elektrode opnames. Het schema elektrode wijst op de normale weg te nemen van R1-R6 in het netvlies. Één pad opnemen LMCS in de lamina te verschuiven gelijktijdig de elektrode naar links. (B) Lamina is een matrix van retinotopically orgelized patronen, die elk verpakt met neuronen die informatie verwerkt van een bepaald klein gebied in de visuele ruimte. Als gevolg van neurale superpositie, zes fotoreceptoren uit verschillende naburige ommatidia sturen hun axonen (R1-R6) naar dezelfde lamina cartridge, de vorming van histaminerge uitgang synapsen aan L1-L3 en een amacrine cel (Am). (C) De verspreiding van neurale informatie tussen R1-R6 axon terminals en de visuele interneuronen (inclusief L4, L5, Lawf, C2, C3 en T1), in een lamina cartridge complex. (D) R1-R6 fotoreceptor axonen ontvangen synaptische feedback van L2 en L4 monopolaire cellen. (B) en (C) gewijzigd ten opzichte van Rivera-alba et al 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> De Drosophila oog is van de neurale superpositie soort 16. Dit betekent tpet de neurale signalen van acht fotoreceptoren die tot zeven naburige ommatidia, die gericht zijn op hetzelfde punt in de ruimte, worden samengevoegd in een neurale cartridge in de komende twee neuropils: de lamina en merg. Terwijl de zes buitenste fotoreceptoren R1-R6 project hun axon terminals neurale kolommen in de plaat (figuur 1), R7 en R8 cellen omzeilen deze laag en maakt synaptische contacten met hun overeenkomstige medulla kolom 17-19. Deze exacte bedradingen produceren neurale substraat voor het in kaart brengen van retinotopische vlieg vroege gezichtsvermogen, waarna elke plaat (Figuren 1A-C) en medulla kolom (patroon) een enkel punt in de ruimte. In de lamina 1,2,20 en amacrine Cell (Am): directe input van R1-R6 fotoreceptoren worden ontvangen door de grote monopolaire cellen (L1, L2 en L3 LMCS). Uit deze, L1 en L2 zijn de grootste cellen, bemiddelen belangrijke informatie trajecten (figuur 1D), whilech reageren op on- en off-bewegende randen, en vormen de rekenkundige basis van de bewegingsmelder 21,22. Gedragsexperimenten stelt op tussenliggende contrast, de twee wegen waarneming van beweging van tegengestelde richtingen te vergemakkelijken: back-to-front in L1 en front-to-back in T2 cellen 23,24. Connectiviteit impliceert verder dat L4 neuronen cruciale rol kunnen spelen in de laterale communicatie tussen naburige cartridges 25,26. Wederzijdse synapsen gevonden tussen L2 en L4 cellen in hetzelfde en twee aangrenzende patronen. Stroomafwaarts elke cel L2 en L4 drie geassocieerde cellen hun axonen projecteren van een gemeenschappelijke doelstelling, de Tm2 neuron in de medulla, waarbij ingangen van naburige patronen worden verondersteld te integreren voor de verwerking van voor naar bewegende 27. Hoewel L1 neuronen ontvangen input van dezelfde cartridge L2S via zowel gap kruispunten en synapsen, zijn ze niet direct verbonden met L4S en dus aangrenzende lamina cartridges. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Synaptic geven aan R1-R6 fotoreceptor axonen alleen worden verleend door neuronen die behoren tot de L2 / L4 circuits, maar niet de L1 pathway 1,2 (figuur 1D). Terwijl hetzelfde patroon verbindingen selectief van L2 R1 en R2 en van L4 tot R5, alle R1-R6 fotoreceptoren ontvangen synaptische reacties van L4 van beide of beide naburige patronen. Verder zijn er sterke synaptische verbindingen van Am R1, R2, R4 en R5 en gliacellen ook synaptisch verbonden met het netwerk en kan dus deelnemen neurale beeldverwerking 6. Tenslotte axonale gap-junctions, koppelen aangrenzende R1-R6 en tussen R6 en R7 / R8 fotoreceptoren in de lamina, bijdragen tot de asymmetrische informatieweergave en verwerking in elke patroon 14,20,28. Intracellulaire spanning opnames van individuele fotoreceptoren en visuele interneuronen in bijna intact Drosophila bieden een hoge signaal-ruis ratie gegevens op sub-milliseconde resolutie 3,5,7-10,29, die nodig zijn voor het begrijpen van de snelle neurale berekeningen tussen de aangesloten neuronen is. Dit niveau van nauwkeurigheid is onmogelijk door de huidige optische beeldvormende technieken, die aanzienlijk luidruchtiger zijn en typisch werken op 10-100 msec resolutie. Bovendien omdat de elektroden erg klein en scherpe punten, de werkwijze is niet beperkt tot cellichamen, maar kan direct opnamen van kleine actieve neurale structuren; zoals dendritische bomen de LMCS of fotoreceptor axonen, die niet toegankelijk is voor veel grotere uiteinden van patch-clamp elektroden. Belangrijk is dat de methode is ook structureel minder invasief en schadelijk dan de meeste patch-clamp-toepassingen, en dus bij minder de bestudeerde cellen intracellulaire milieu en informatie over bemonstering. Zo zijn conventionele scherpe micro-elektrode technieken bijgedragen, en blijven bijdragen, fundamentele ontdekkingen en originele inzicht in de neurale informatie verwerking op het juiste moment schaal; het verbeteren van onze mechanistische begrip van de visie 3-10. Dit artikel wordt uitgelegd hoe in vivo intracellulaire opnamen van Drosophila R1-R6 fotoreceptoren en LMCS worden uitgevoerd in de Juusola laboratorium. Dit protocol beschrijft hoe een geschikte elektrofysiologie rig te bouwen, de voorbereiding van de vlieg, en het uitvoeren van de opnames. Sommige representatieve gegevens worden gepresenteerd, en een aantal veelvoorkomende problemen en mogelijke oplossingen besproken die zich kunnen voordoen bij het gebruik van deze methode.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereo Zoom Microscope for making the fly preparation</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN30x-H/22</td>
			<td>Capable of ~150X magnification with long working distance; bespoke heavy steel table mount stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Stereomicroscope in the intracellular set-up</td>
			<td>&#183;&#160; Olympus</td>
			<td>Olympus SZX7; eyepieces: WHN30x-H/22</td>
			<td rowspan="2">30x eyepieces are needed for seeing the electrode tip reflections well when driving it through the small corneal hole into the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#183;&#160; Nikon</td>
			<td>Nikon SMZ645; eyepieces: C-W30x/7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Anti-vibration Table</td>
			<td>&#183;&#160; Melles Griot</td>
			<td rowspan="2">With metric M6 holes on the breadboard</td>
			<td rowspan="2">Our bespoke rigs have a large hole drilled through the thick breadboard that lets in the fly preparation platform pole (houses a copper heatsink with electronics) from below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#183;&#160; Newport</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Micromanipulators</td>
			<td>&#183;&#160; Narishige</td>
			<td>&#183;&#160; Narishige NMN-21</td>
			<td rowspan="4">In our intracellular set-ups, different micromanipulator systems are used for driving the shap recording electrodes into the fly eye. All the listed manipulators are succesfully providing long-lasting stable recordings from Drosophila photoreceptors and LMCs.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#183;&#160; Huxley Bertram</td>
			<td>&#183;&#160; Huxley xyz-axis with fine manual control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#183;&#160; Sensapex</td>
			<td>&#183;&#160; Sensapex triple axis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#183;&#160; M&#228;rzh&#228;user</td>
			<td>&#183;&#160; M&#228;rzh&#228;user DC-3K with additional x-axis piezo stepper and MS 314 controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stands</td>
			<td>Any magnetic base with on/off switch will do</td>
			<td></td>
			<td>For example, to manage cables inside the Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holders</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>ESP/W-F10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Wire</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>AGW1510</td>
			<td>0.3-0.5 mm diameter; needs to be chloridized for the electrode holders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Many different, including Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Fiber Optic Bundles</td>
			<td>&#183;&#160; UltraFine Technology</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">To deliver the LED light stimulus to the Cardan arm system. We use both liquid and quartz light guides (range from UV to IR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#183;&#160; Thorn Labs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Cathing Tube</td>
			<td></td>
			<td>P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Pack of 100 Pcs</td>
			<td>Cut the conical bottom off from 50 ml Plastic Centrifuge Tube and glue a 1 ml pipette tip on it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Acquisition System</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-electrode current/voltage-clamp microelectrode amplifier</td>
			<td>npi SEC-10LX</td>
			<td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td>
			<td>Outstanding performer!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-stage</td>
			<td>Standard (+/- 150 nA)</td>
			<td>For npi SEC-10LX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">LED light sources and drivers</td>
			<td>&#183;&#160; 2-channel OptoLED (Cairn Research Ltd., UK)</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Many of our stimulus systems are in-house built&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#183;&#160; Self-designed and constructed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition and Analyses Software</td>
			<td>Many companies to choose from</td>
			<td></td>
			<td>Biosyst; custom written Matlab-based system for experimental and theoretical work in the Juusola laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal Computer or Mac</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ensure that PC or Mac is compatible with data acquisition system and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardan arm system&#160;</td>
			<td>Self-designed and constructed</td>
			<td></td>
			<td>Providing accurate x,y,z-positioning of the light stimuli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature control system&#160;</td>
			<td>Self-designed and constructed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Self-constructed</td>
			<td></td>
			<td>Electromagnetic noise shielding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Filamented Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>Outer diameter: 1 mm</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inner diameter: 0.5-0.7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Filamented Quartz Glass Capillaries</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>Outer diameter: 1 mm</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inner diameter: 0.5-0.7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-2000 laser Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>For borosilicate reference electrodes, use the preset program #11 (patch electrodes): Heat = 350; Filament = 4; Velocity 36; Delay = 200).1.2.1). For borosilicate recording electrodes, use the preset program #12 (this typically pulls good conventional sharps&#160; for photoreceptor recordings): Heat = 355; Filament = 4; Velocity 50; Delay = 225; Pull = 150. For LMC recordings, which require electrodes with finer tips, these values need to be adjusted. For pulling quartz capillaries, P-2000 manual suggests programs for fine tipped microelectrodes. These programs&#8217; preset parameters serve as useful starting points for systematic modifications to generate electrodes with good penetration success and low recording noise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular Ringer Solution for the reference electrode</td>
			<td>Chemicals from Fisher Scientific</td>
			<td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sucrose</td>
			<td>See the recipe in the protocol section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution for filling the filamented recording microelectrode</td>
			<td>Salts from Fisher Scientific</td>
			<td>10010310, KCl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Vaselin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-stainless steel razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade holder/breaker</td>
			<td>Fine Science Tools By Dumont</td>
			<td>10053-09</td>
			<td>9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blu-tack</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td>Alternatively, use molding clay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools By Dumont</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>#5SF (super-fine tips)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological method for recording intracellular voltage responses of drosophila photoreceptors and interneurons to light stimuli in vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

De scherpe micro-elektrode opnamemethode, zoals hier ingericht voor het Drosophila oog, kan worden gebruikt om op betrouwbare wijze te kwantificeren neurale informatie en -verwerking in de retina en lamina cellen en onderlinge communicatie 4,5,7,8,10,33. Door het gebruik van het aan codering in verschillende wild-type aandelen, mutanten of genetisch gemanipuleerde vlieg stammen te bestuderen, heeft de methode zijn waarde bewezen; niet alleen in het kwantificeren van de effecten van een mutatie, temperatuur, voeding of gekozen expressievector 3,4,6,9,10,14,30,34, maar ook in het openbaren mechanische redenen veranderde visuele gedrag 14,34. De methode is ook goed toepasbaar op andere insecten voorbereidingen 35,36, empowerment neuroethological visie studies. Volgende presenteren we een paar voorbeelden van zijn succesvolle toepassingen. <img alt="figuur 7" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" /> Figuur 7. VoltageReacties van een Fruitvlieg R1-R6 fotoreceptorcellen een lichtpuls bij 20 en 25 ° C. Door de scherpe micro-elektrode doorvoeringen vaak zeer stabiel, is het mogelijk om spanning reacties van dezelfde R1-R6 fotoreceptor opnemen op een bepaalde lichtstimulus bij verschillende omgevingstemperaturen door opwarmen of afkoelen van de vlieg. In onze set-ups, is de fly-houder geplaatst op een close-loop Peltier-element op basis van temperatuur-control-systeem. Dit stelt ons in staat om het hoofd temperatuur van de vlieg in enkele seconden te veranderen. Hogere temperaturen versnelt de spanning reacties en karakteristiek verlaagt de rustpotentiaal van R1-R6 fotoreceptoren (zoals aangegeven door rode pijlen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Het bestuderen van het effect van temperatuur op fotoreceptorcellen Output <p class="jove_content" fo:kEEP-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Met een goed ontworpen en trillingen geïsoleerd opname-systeem, kan de werkwijze worden gebruikt voor het meten van het effect van de temperatuur op de neurale uitvoer van een individuele cel door verwarmen of koelen van de vlieg. Het gegeven voorbeeld toont spanning responsies op een heldere 10 msec lange puls, welke over een zelfde R1-R6 fotoreceptor bij 20 en 25 ° C (Figuur 7). Zoals gekwantificeerd voor 4,9, van de aarde verlaagt een fotoreceptor&#39;s rustpotentiaal in het donker, en versnelt de spanning reacties. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" /> Figuur 8. Signalering optreden een Fruit Fly R1-R6 fotoreceptorcellen Verbetert met Light Intensity (A) fotoreceptorcellen output naar (onder) gedimd en helder. (Boven; 10.000 keer helderder licht) herhaalde naturalistische lichtintensiteit tijdreeksen opgenomen door dezelfde micro-elektrodein dezelfde cel bij 20 oC Reacties op de lichte prikkel zijn groter, omdat ze meer samples, elementaire reacties (hobbels) tot enkele fotonen 4,5,7,8 integreren. (B) 20 opeenvolgende één-seconde-lange voltage reacties worden gelegd. Individuele reacties (lichtgrijs) werden genomen na de adaptieve trends (pijl in A) had teruggetrokken (gestippelde vakje in A). De overeenkomstige reactie middelen (signalen) zijn de donkere sporen. Het verschil tussen het signaal en de individuele reacties is het lawaai. (C) De cellen &#39;signalering prestatie werd gekwantificeerd door de opnames&#39; signaal-ruisverhouding (SNR) met behulp van de standaardmethoden 4,5,7,8. Fotoreceptor uitgang heeft ongeveer 64 Hz breder scala van betrouwbare signalen naar de heldere stimulatie (SNR &#39;Bright ≥1, tot 84 Hz) dan aan de dim (SNR&#39; Dim ≥1, tot 20 Hz), met signal-ruisverhouding sterk verbeteren; van SNR Dim MAX = 87 tot SNR Bright MAX = 1868. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Studeren Adaptation and Neural Encoding door Repetitive Stimulation De noninvasiveness van de werkwijze, waardoor relatief weinig schade aan het netvlies en lamina structuren, maakt het ideaal voor het bestuderen van signalering functioneren van individuele cellen aan verschillende lichte stimuli in hun natuurlijke omgeving fysiologische toestand in vivo. Figuur 8 toont een spanning reacties van R1 R6 afdrukband naar een donker en helder herhaald naturalistische lichtintensiteit tijdreeksen stimulus bij 20 o C, terwijl figuur 9 </strong&gt; toont responsen van een R1-R6 fotoreceptor en LMC een andere naturalistische prikkel bij 25 oC De pre- en postsynaptische opnamen werden afzonderlijk uitgevoerd vanuit twee verschillende vliegen omdat gelijktijdige intracellulaire opnamen van twee scherpe micro-elektroden in dezelfde vlieg, een in de retina en de andere in de lamina, te moeilijk haalbaar 30 zijn. <img alt="figuur 9" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" /> Figuur 9. Voltage Reacties van een Fruitvlieg R1-R6 fotoreceptorcellen en LMC herhaalde Naturalistic Stimulatie bij 25 o C. (A) R1-R6 (grijs) en LMC (zwart) uitgangen opgenomen door verschillende micro-elektroden van verschillende vliegen. (B) volledig licht aangepaste 20 opeenvolgende pre- (boven) en postsynaptische (hieronder) reacties op dezelfde stimulus naturalistische patroon met individuele reacties, weergegeven in een lichtgrijsd de bijbehorende reactie middelen (de signalen) als de donkere sporen. Het verschil tussen het signaal en de individuele reacties is het lawaai. (C) De cellen &#39;signalering prestatie werd gekwantificeerd door de opnames&#39; signaal-ruisverhouding (SNR). LMC-uitgang heeft ongeveer 10 Hz breder scala van betrouwbare signalen (SNR &#39;LMC ≥1, tot 104 Hz) dan R1-R6-uitgang (SNR&#39; R ≥1, tot 94 Hz). Beide signal-to-noise ratio&#39;s zijn hoog (SNR LMC MAX = 142, SNR R MAX = 752), en als de opname geluid was laag, hun verschillen weerspiegelen echte encoding verschillen tussen de cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.</a> Nadat de stimulus onset, de opnames typischely tonen snelle aanpassing van trends die grotendeels binnen 5-6 sec verdwijnen. Vanaf dat moment, de cellen produceren zeer consistente antwoorden op elke 1 sec lang stimulus presentatie (elke gestippelde doos omsluit 20 van deze). De herhaalbaarheid van de antwoorden wordt duidelijk wanneer deze worden gelegd (figuur 8B en figuur 9B). Individuele reacties zijn de dunne grijze sporen, en hun betekenen de dikkere donkerder spoor. De gemiddelde respons wordt beschouwd als de neurale signaal, terwijl de neurale geluid is het verschil tussen de gemiddelde en elke individuele respons 4,5,9,37,38. De respectieve signaal-ruisverhouding in frequentiedomein (figuur 8C en figuur 9C) werden verkregen door Fourier-transformatie van het signaal en geluidsgegevens brokken in vermogensspectra en verdelen van het gemiddelde signaalvermogen spectrum met de overeenkomstige gemiddelde ruisvermogen spectrum 4, 5,9,37,38. Kenmerkend is het maximale signaal-ruisverhoudingen of de opgenomen neurale uitgangen naturalistische stimulatie hoog (100 - 1000), en in de meest stabiele preparaten zeer lage opname ruis kan waarden bereiken &gt;&gt; 1000 (bijvoorbeeld, figuur 8C.). Merk ook op dat de opwarming breidt de cellen &#39;bandbreedte van betrouwbare signalering 4 (SNR&#39; Bright ≥ 1); bijvoorbeeld het relatieve verschil tussen de twee R1-R6s in figuren 8 en 9, respectievelijk 10 Hz (84 bij 20 ° C en 94 Hz bij 25 o C). Men kan verder schatten snelheid van informatieoverdracht van de signaal-ruisverhouding elke cel met de Shannon formule 32, of door berekening van het verschil tussen de antwoorden &quot;entropie en lawaai entropie tarieven via triple extrapolatie methode 39. Meer details over de informatie die de theoretische analyses, en het gebruik ervan en de beperkings specifiek met deze methode worden gegeven in de vorige publicaties 7,8,39. <img alt="figuur 10" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" /> Figuur 10. Spanning Reacties van een Killer Fly R1-R6 fotoreceptorcellen en LMC herhaalde Naturalistic Stimulatie bij 19 o C. (A) R1-R6 (grijs) en LMC (zwart) uitgangen opgenomen door dezelfde micro-elektrode van dezelfde vlieg; Eerst postsynaptisch en later presynaptisch, de elektrode gevorderd in het oog. (B) 20 opeenvolgende pre- (boven) en postsynaptische (hieronder) reacties (lichtgrijs sporen) dezelfde naturalistische stimuluspatroon werden gevangen na initiële aanpassing (gestippelde box aan A). Overbrengingsmiddelen zijn de signalen (de donkere sporen geplaatst), terwijl de respectieve verschillen de individuele reacties geven het geluid. (C) De overeenkomstige Signal-ruisverhouding (SNR) werden berekend zoals in de figuren 8C en 9C. LMC-uitgang heeft ongeveer 100 Hz breder scala van betrouwbare signalen (SNR &#39;LMC MAX ≥1, tot 234 Hz) dan R1-R6-uitgang (SNR&#39; R MAX ≥1, tot 134 Hz). Beide signaal-ruisverhouding hoog (SNR LMC MAX = 137, SNR R MAX = 627), en als dezelfde micro-elektrode werd gebruikt in de opnames, hun verschillen weerspiegelen werkelijke verschillen in pre- en postsynaptische neurale uitgangen. Deze resultaten impliceren dat het opnamesysteem had lage ruis, en de invloed daarvan op de analyses was marginaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Neuroethological Vision Studies </p&gt; De werkwijze kan ook worden gebruikt voor pre- en postsynaptische voltage reacties opnemen van de verbinding ogen van verschillende insectensoorten 7,8,35,36 (figuur 10), waardoor vergelijkende studies neuroethological visuele informatieverwerking. Voor de gepresenteerde opnamesysteem, de enige vereiste aanpassing is nieuw preparaat houders, elk met een voldoende omvang opening voor de onderzocht. Deze voorbeeldige opnames uit van een vrouwelijke moordenaar vliegen (Coenosia attenuata). Ze tonen spanning intracellulaire responsen van een R1-R6 fotoreceptor en LMC identieke repetitieve lichtstimulatie, als voor de Drosophila tegenhangers in figuur 9, maar bij 19 oC In dit geval van de pre- en postsynaptische gegevens werden geregistreerd van dezelfde vlieg; na elkaar, met dezelfde registratie-elektrode (gevuld met 3 M KCl) eerst het doorlopen van de laterale lamina voor invoerening de frontale netvlies. In vergelijking met de Drosophila gegevens bij 25 ° C, de Coenosia data - zelfs in het koelere temperatuur - toont antwoorden met snellere dynamiek; uitbreiding van het bereik van betrouwbare signalen (signaal-ruisverhouding &gt;&gt; 1) over een breder frequentiegebied. Dergelijke functionele aanpassingen in neurale codering van naturalistische stimuli zijn consistent met Coenosia &#39;s roofzuchtige levensstijl 36, die hoge precisie spatiotemporele informatie nodig hebben om snel vanuit de lucht jagen gedrag te bereiken.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo at JoVE.com

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo (Video) | JoVE

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrofysiologische Methode voor opname intracellulaire Voltage Reacties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptoren en Interneurons naar Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish (Video) | JoVE

Opname Behavioral Responses to Reflectie in Rivierkreeftjes

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices (Video) | JoVE

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish (Video) | JoVE

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons (Video) | JoVE

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes (Video) | JoVE

Een methode voor het systematisch Elektrochemische en elektrofysiologische evaluatie van neurale registrerende elektroden

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla (Video) | JoVE

Elektrofysiologische Opnemen vanaf<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Proef sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons (Video) | JoVE

Een gids voor<em&gt; In vivo</em&gt; Single-unit Opnemen van Optogenetically Identified Cortical Remmende Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light (Video) | JoVE

Het analyseren van Synaptic Modulatie van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors (Video) | JoVE

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility (Video) | JoVE

Elektrofysiologische opname van<em&gt; Drosophila</em&gt; Trichoid Sensilla in reactie op geurstoffen met lage volatiliteit

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...