Name: highly sensitive and rapid fluorescence detection with a portable fret analyzer
Uploaded: 2016-10-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer at JoVE.com

Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier-Projekt (2011-0031944) und der KRIBB Research Initiative Program.

1. Herstellung von Biosensor <ol><li> Konstruieren Sie das Plasmid pET21a (+) - GFP-MBP-YFP-His6 durch Befolgen des vorher festgelegten Protokoll 2. </li><li> Impfen 5 ml Luria - Brühe (LB) mit einer Einzelkolonie eines Stammes Escherichia coli DE3 und Inkubation bei 37 ° C für 16 Stunden unter Schütteln. </li><li> 1 ml des O / N - Kultur in einen 500-ml - Kolben , die 100 ml LB und bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator inkubieren , bis die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) 0,5 e...

<ol>
	<li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering.">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li><li>Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+highly+responsive+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors+for+detection+of+sugar+in+living+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).</li><li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca(2+)+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins.">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).</li><li>Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+glutamate+release+from+neurons+by+genetically+encoded+surface-displayed+FRET+nanosensors.">Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).</li><li>Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+detection+of+protein+interactions+in+surface-supported+bilayers.">Spectral F&#246;rster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers.</a> Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li><li>Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portable+FRET+analyzer+for+rapid+detection+of+sugar+content.">A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content.</a> Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).</li><li>Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+analyses+at+critical+temperatures+can+magnify+the+signal+intensity+of+FRET-based+sugar+sensors+with+periplasmic+binding+proteins.">Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins.</a> Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).</li><li>Hessels, A. M., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-encoded+FRET-based+sensors+for+monitoring+Zn2++in+living+cells.">Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells.</a> Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).</li><li>Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+sensor+for+intracellular+heme.">A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme.</a> ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).</li><li>. Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/">https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/</a> (2015)</li><li>Rajendran, R., Rayman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+blood+glucose+testing+for+diabetes+care+in+hospitalized+patients:+an+evidence-based+review.">Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).</li><li>Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+and+signal-transducer+binding+sites+of+the+Escherichia+coli+galactose+chemoreceptor+protein.">Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein.</a> Science. 242, 1290-1295 (1988).</li><li>Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., &#266;erimagi&#263;, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-containing+beverage+intake+in+toddlers+and+body+composition+up+to+age+6+years:+The+Generation+R+Study.">Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study.</a> Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).</li><li>Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+food,+fat+and+sugar+sweetened+beverage+items+are+related+to+children's+dietary+energy+density.">Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density.</a> FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).</li><li>Larsson, S. C., &#197;kesson, A., Wolk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sweetened+beverage+consumption+is+associated+with+increased+risk+of+stroke+in+women+and+men.">Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men.</a> J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).</li><li>Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+as+an+affinity+purification+tag.">Calmodulin as an affinity purification tag.</a> E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).</li></ol>

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und effiziente Quantifizierung des Zuckergehalts in Getränkeproben, eine maßgeschneiderte FRET - Analysator 7 bei einer optimalen Temperatur für FRET - Sensoren. Der Analysator wurde entwickelt mit einem kürzlich entwickelten, kostengünstigen 405-nm-Band Ultraviolett-LED als die Lichtquelle und zwei Photodetektoren mit einer Silizium-Photodiode. Diese Vorrichtung ist kostengünstiger als andere vergleichbare Fluorometer. Die Vorrichtung zeigte eine hohe Nachweis...

Förster - Resonanzenergietransfer (FRET) wurde als biometrischer Sensor zur Erkennung kleiner Moleküle wie Zucker, Calciumionen und Aminosäuren 1-4 verwendet. FRET Biosensoren enthalten fluoreszierende Proteine, cyan fluoreszierende Proteine ​​(CFPs) und Gelb fluoreszierendes Protein (YFPs), die an beiden Enden des periplasmatischen-bindenden Proteinen fusioniert sind (PBPs). Zucker binden an PBPs in der Mitte des FRET-Sensor befindet, strukturelle Änderungen an dem Sensor verursachen, die anschließend den Abstand und Übergangsdipolmomente Orientierung der beiden fluoreszierenden Proteinen an jedem Ende des PBP verändern. Diese Änderung ermöglicht die quantitative Analyse der Zuckergehalt, indem das Verhältnis der Emissionswellenlängen von EYFP (530 nm) und ECFP (480 nm) gemessen wird. Aufgrund der hohen Sensitivität, Spezifität, Echtzeit - Monitoring - Kapazitäten und eine schnelle Reaktionszeit von FRET Biosensoren sind diese Sensoren weit verbreitet in der Umwelt, Industrie und medizinische Anwendungen 5. Außerdem ratiometric Messung mittels FRET Biosensoren hat wichtige praktische Vorteile, da es verwendet werden kann, Komponenten in komplexen biologischen Proben zu messen, wo der Sensor-Konzentration nicht leicht gesteuert werden kann und die Hintergrundfluoreszenz ist immer vorhanden. Trotz dieser Vorteile von FRET-basierten Sensoren für quantitative Visualisierung, kleine strukturelle Veränderungen mit unvollständigen Domain Bewegungsübertragung auf die fluoreszierenden Proteine ​​produzieren von Natur aus schwach Signalintensität. Dieses schwache Signal begrenzt die Anwendung von FRET-basierten Sensoren für die in vitro oder in vivo - Analyse 6. Folglich meisten FRET Biosensoren die Verwendung von teuren und hochempfindliche Ausrüstung erfordern. Bisher haben wir eine kostengünstige und portable FRET - Analysator mit Funktionen ähnlich denen der bestehenden Fluoreszenz Analysatoren 7. Bei dieser Vorrichtung ist kostengünstig 405-nm-Band ultraviolettem Licht emittierende Diode (LED) als Lichtquelle verwendet Anregung th zu verursachene Fluoreszenzsignal, eine teure Lampe oder einem Laser zu ersetzen. Das Detektionssystem des Analysators fokussiert effizient das ableitende Fluoreszenzsignal auf zwei Photodetektoren mit einer Silizium-Photodiode. In einer neueren Studie wurde gezeigt, dass die Optimierung der Erfassungstemperatur bei 50 - 55 ° C signifikant die ratiometrisch FRET - Signal 8 vergrößern könnte. Diese Temperatur spezifische Signalverstärkung, zusammen mit dem maßgeschneiderten FRET-Analyzer, ermöglicht die Verwendung von FRET-Sensoren in allgemeinere diagnostische Anwendungen mit schnellen und hohen Empfindlichkeit. In diesem Protokoll haben wir gezeigt, die allgemeine Anwendbarkeit des FRET-Analysator unter optimalen FRET Temperaturbedingungen durch den Zuckergehalt von handelsüblichen Getränken zu quantifizieren. Dieses Protokoll stellt die Details des FRET Gerätebedienung sowie eine kurze Beschreibung der Sensor und die Probenvorbereitung. Wir gehen davon aus, dass dieser Bericht die Anwendung des tragbaren fördernAnalysator in kleinen Laborumgebungen und eine Grundlage für die weitere Entwicklung eines kostengünstigen Vor-Ort-Diagnosegerät mit FRET-basierten Biosensoren bieten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1297">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">LB</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#244620</td>
			<td style="width:760px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tri-HCl</td>
			<td style="width:191px;">Bioneer</td>
			<td style="width:119px;">C-9006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">PMSF</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">78830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">EDTA</td>
			<td style="width:191px;">Bioneer</td>
			<td style="width:119px;">C-9007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">DTT</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Junsei</td>
			<td style="width:119px;">19015-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">70011-044</td>
			<td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SOC</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Resource Q</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1177-01</td>
			<td>6 &#215; 30 mm anion-exchange chromatography column&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">HisTrap HP1</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">29-0510-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Quartz cuvette</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z802875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">AK&#196;KTAFPLC</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">18-1900-26</td>
			<td>a fast protein liquid chromatography (FPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cary Eclipse</td>
			<td>VarianInc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>a fluorescence spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">VICTOR&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">2030-0050</td>
			<td>a multilabel plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">E. coli JM109 (DE3)</td>
			<td style="width:191px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">A (Beverage)</td>
			<td style="width:191px;">Korea Yakult Co. (Korea)</td>
			<td style="width:119px;">Birak</td>
			<td>Fermented drinks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">B (Beverage)</td>
			<td style="width:191px;">Lotte Foods (Korea)</td>
			<td style="width:119px;">Epro</td>
			<td>Soft drink</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">C (Beverage)</td>
			<td style="width:191px;">Lotte Foods (Korea)</td>
			<td style="width:119px;">Getoray</td>
			<td>Sports drink</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and rapid fluorescence detection with a portable fret analyzer

Die jüngsten Verbesserungen in Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Sensoren haben ihre Verwendung aktiviert werden, damit verschiedene kleine Moleküle einschließlich Ionen und Aminosäuren erkennen. Allerdings ist die angeborene schwache Signalintensität von FRET-Sensoren eine große Herausforderung dar, die ihre Anwendung in verschiedenen Bereichen verhindert und die Verwendung von teuren High-End-Fluorometer notwendig. Bisher haben wir eine kostengünstige, High-Performance-FRET-Analyzer, der speziell das Verhältnis von zwei Emissionswellenlängenbändern zu messen (530 und 480 nm) hohe Nachweisempfindlichkeit zu erreichen. In jüngerer Zeit wurde entdeckt, dass FRET Sensoren mit bakteriellen periplasmatischen Bindungsproteinen Liganden mit einer maximalen Empfindlichkeit im kritischen Temperaturbereich von 50 erfassen - 55 ° C. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll Zuckergehalt in handelsüblichen Getränkeproben unter Verwendung unserer tragbaren FRET-Analysator mit einer temperaturspezifischen FRET-Sensor für die Beurteilung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die zusätzliche VorwärmungProzess des FRET-Sensor erhöht die FRET-Verhältnissignal, eine genauere Messung des Zuckergehalts zu ermöglichen. Maßgeschneiderte FRET-Analysator und Sensor wurden erfolgreich den Zuckergehalt in drei Arten von kommerziellen Getränke zu quantifizieren angewandt. Wir gehen davon aus, dass eine weitere Größenreduktion und Leistungssteigerung der Anlage wird die Verwendung von Hand Analysatoren in Umgebungen erleichtern, in denen High-End-Geräte nicht zur Verfügung steht.

Auszuführen quantitative Analyse der Zuckergehalt unter Verwendung des FRET-Analysator, ist es notwendig, eine angepasste Kurve Abschätzen der Zielzuckerkonzentration aus dem beobachteten FRET-Verhältnis aufzubauen. Es sei r das Verhältnis der Emissionsintensität von GFP bei 480 nm und die Emissionsintensität von YFP erzeugt bei 530 nm (Gl. 1) definieren. <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54144/54144e...

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Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Dieses Protokoll beschreibt die schnelle und hochempfindliche Quantifizierung von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Daten Sensor eine maßgeschneiderte portable FRET-Analyzer. Das Gerät wurde verwendet, Maltose innerhalb eines kritischen Temperaturbereich zu erkennen, die Detektionsempfindlichkeit maximiert, wodurch praktische und effiziente Beurteilung der Zuckergehalt.

Hochempfindliche und schnelle Fluoreszenzdetektion mit einem tragbaren FRET Analyzer

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Research

JoVE Journal

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