Name: highly sensitive and rapid fluorescence detection with a portable fret analyzer
Uploaded: 2016-10-01T13:00:00
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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal Centro Intelligent biologia sintetica del progetto Frontier globale (2011-0.031.944) e il programma di iniziativa KRIBB Research.

1. Preparazione del biosensore <ol><li> Costruire il plasmide pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 seguendo il protocollo precedentemente stabilito 2. </li><li> Seminare 5 ml di Luria Broth (LB) con una singola colonia di un ceppo di Escherichia coli DE3 e incubare a 37 ° C per 16 ore con agitazione. </li><li> Trasferire 1 ml della / culture O N in un pallone da 500 ml contenente 100 ml LB ed incubare a 37 ° C in un incubatore agitando fino alla densità ottica a 600 nm (OD 600) raggiunge 0,5...

<ol>
	<li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering.">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li><li>Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+highly+responsive+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors+for+detection+of+sugar+in+living+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).</li><li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca(2+)+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins.">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).</li><li>Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+glutamate+release+from+neurons+by+genetically+encoded+surface-displayed+FRET+nanosensors.">Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).</li><li>Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+detection+of+protein+interactions+in+surface-supported+bilayers.">Spectral F&#246;rster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers.</a> Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li><li>Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portable+FRET+analyzer+for+rapid+detection+of+sugar+content.">A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content.</a> Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).</li><li>Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+analyses+at+critical+temperatures+can+magnify+the+signal+intensity+of+FRET-based+sugar+sensors+with+periplasmic+binding+proteins.">Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins.</a> Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).</li><li>Hessels, A. M., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-encoded+FRET-based+sensors+for+monitoring+Zn2++in+living+cells.">Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells.</a> Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).</li><li>Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+sensor+for+intracellular+heme.">A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme.</a> ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).</li><li>. Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/">https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/</a> (2015)</li><li>Rajendran, R., Rayman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+blood+glucose+testing+for+diabetes+care+in+hospitalized+patients:+an+evidence-based+review.">Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).</li><li>Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+and+signal-transducer+binding+sites+of+the+Escherichia+coli+galactose+chemoreceptor+protein.">Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein.</a> Science. 242, 1290-1295 (1988).</li><li>Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., &#266;erimagi&#263;, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-containing+beverage+intake+in+toddlers+and+body+composition+up+to+age+6+years:+The+Generation+R+Study.">Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study.</a> Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).</li><li>Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+food,+fat+and+sugar+sweetened+beverage+items+are+related+to+children's+dietary+energy+density.">Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density.</a> FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).</li><li>Larsson, S. C., &#197;kesson, A., Wolk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sweetened+beverage+consumption+is+associated+with+increased+risk+of+stroke+in+women+and+men.">Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men.</a> J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).</li><li>Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+as+an+affinity+purification+tag.">Calmodulin as an affinity purification tag.</a> E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).</li></ol>

Questo protocollo permette quantificazione rapida ed efficiente del tenore di zucchero nei campioni bevande, utilizzando un analizzatore di FRET misura 7 ad una temperatura ottimale per sensori FRET. L&#39;analizzatore è stato progettato con un recentemente sviluppato, poco costoso banda 405-nm ultravioletta-LED come fonte di luce e due fotorivelatori con un fotodiodo al silicio. Questo dispositivo è più conveniente rispetto ad altri Fluorimetro comparabili. Il dispositivo ha mostrato alta sensibilità di ...

Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) è stato ampiamente utilizzato come un sensore biometrico per rilevare piccole molecole quali zuccheri, ioni calcio e aminoacidi 1-4. biosensori FRET contengono proteine ​​fluorescenti, proteine ​​fluorescenti ciano (CFP), e le proteine ​​fluorescenti gialli (YFPs), che si fondono ad entrambe le estremità delle proteine ​​periplasmatiche-binding (PBP). Zuccheri legano ai PBP situati al centro del sensore FRET, provocando cambiamenti strutturali al sensore che successivamente alterare l&#39;orientamento distanza e la transizione dipolo delle due proteine ​​fluorescenti alle estremità del PBP. Questa modifica permette analisi quantitativa del contenuto di zucchero misurando il rapporto tra le lunghezze d&#39;onda di emissione di EYFP (530 nm) e ECFP (480 nm). A causa della elevata sensibilità, specificità, capacità di monitoraggio in tempo reale, e il tempo di risposta di biosensori FRET, questi sensori sono ampiamente utilizzati in applicazioni ambientali, industriali e medicali 5. Inoltre, RaziomMisurazione etrica usando biosensori FRET ha importanti vantaggi pratici, in quanto può essere utilizzato per misurare componenti in campioni biologici complessi dove la concentrazione sensore non può essere facilmente controllata e fluorescenza di fondo è sempre presente. Nonostante questi vantaggi dei sensori FRET-based per la visualizzazione quantitativa, piccoli cambiamenti strutturali con dominio incompleto movimento trasferimento alle proteine ​​fluorescenti producono intensità del segnale intrinsecamente debole. Questo segnale debole limita l&#39;applicazione di sensori FRET-based per in vitro o in vivo analisi 6. Di conseguenza, la maggior parte FRET biosensori richiedono l&#39;uso di apparecchiature costose e altamente sensibile. In precedenza, abbiamo sviluppato un analizzatore FRET poco costoso e portatile con caratteristiche simili a quelle degli analizzatori fluorescenza esistenti 7. In questo dispositivo, economico 405 nm banda ultravioletta diodi emettitori di luce (LED) è stato utilizzato come sorgente di luce per provocare l&#39;eccitazione del thsegnale di fluorescenza e, sostituendo una lampada costosa o laser. Il sistema di rilevamento dell&#39;analizzatore concentra efficacemente il segnale di fluorescenza dissipazione su due fotorivelatori con un fotodiodo al silicio. In uno studio più recente, abbiamo dimostrato che l&#39;ottimizzazione della temperatura di rilevamento a 50 - 55 ° C potrebbe amplificare in modo significativo il segnale raziometrico FRET 8. Questo miglioramento segnale specifico temperatura, insieme con l&#39;analizzatore FRET misura, consente l&#39;utilizzo di sensori FRET in applicazioni diagnostiche più generali con sensibilità rapida ed elevata. In questo protocollo, abbiamo dimostrato l&#39;applicabilità generale dell&#39;analizzatore FRET in condizioni ottimali di temperatura FRET quantificando il contenuto di zucchero delle bevande disponibili in commercio. Questo protocollo fornisce i dettagli del funzionamento del dispositivo FRET, nonché una breve descrizione del sensore e preparazione del campione. Prevediamo che questa relazione promuoverà la potenziale applicazione del portatileAnalizzatore in ambienti di laboratorio su piccola scala e fornire una base per un ulteriore sviluppo di un dispositivo economico in loco diagnostica con biosensori FRET-based.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1297">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">LB</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#244620</td>
			<td style="width:760px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tri-HCl</td>
			<td style="width:191px;">Bioneer</td>
			<td style="width:119px;">C-9006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">PMSF</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">78830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">EDTA</td>
			<td style="width:191px;">Bioneer</td>
			<td style="width:119px;">C-9007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">DTT</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Junsei</td>
			<td style="width:119px;">19015-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">70011-044</td>
			<td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SOC</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Resource Q</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1177-01</td>
			<td>6 &#215; 30 mm anion-exchange chromatography column&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">HisTrap HP1</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">29-0510-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Quartz cuvette</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z802875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">AK&#196;KTAFPLC</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">18-1900-26</td>
			<td>a fast protein liquid chromatography (FPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cary Eclipse</td>
			<td>VarianInc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>a fluorescence spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">VICTOR&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">2030-0050</td>
			<td>a multilabel plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">E. coli JM109 (DE3)</td>
			<td style="width:191px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">A (Beverage)</td>
			<td style="width:191px;">Korea Yakult Co. (Korea)</td>
			<td style="width:119px;">Birak</td>
			<td>Fermented drinks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">B (Beverage)</td>
			<td style="width:191px;">Lotte Foods (Korea)</td>
			<td style="width:119px;">Epro</td>
			<td>Soft drink</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">C (Beverage)</td>
			<td style="width:191px;">Lotte Foods (Korea)</td>
			<td style="width:119px;">Getoray</td>
			<td>Sports drink</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and rapid fluorescence detection with a portable fret analyzer

Recenti miglioramenti nella Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) sensori hanno consentito il loro uso per rilevare varie piccole molecole tra ioni e aminoacidi. Tuttavia, l&#39;intensità innata debole segnale di sensori FRET è una sfida importante che impedisce loro applicazione in vari campi e rende l&#39;uso di costosi, di fascia alta Fluorimetro necessario. In precedenza, abbiamo costruito un analizzatore FRET ad alte prestazioni conveniente che possono specificatamente misurare il rapporto di due bande di lunghezza d&#39;onda di emissione (530 e 480 nm) per ottenere un&#39;elevata sensibilità di rilevamento. Più recentemente, si è scoperto che i sensori FRET con periplasmatiche batterica proteine ​​leganti rilevano ligandi con la massima sensibilità nel range di temperatura critica di 50 - 55 ° C. Questo rapporto descrive un protocollo per la valutazione zucchero contenuto nei campioni di bevande disponibili in commercio utilizzando il nostro analizzatore FRET portatile con un sensore FRET specifica temperatura. I nostri risultati hanno dimostrato che la scaldaprocesso del sensore FRET aumenta significativamente il segnale di rapporto FRET, per consentire la misura più accurata del contenuto di zucchero. L&#39;analizzatore e sensore FRET su misura sono state applicate con successo per quantificare il contenuto di zucchero in tre tipi di bevande commerciali. Prevediamo che un&#39;ulteriore riduzione dimensioni e prestazioni valorizzazione delle apparecchiature faciliterà l&#39;utilizzo di analizzatori portatili in ambienti in cui le apparecchiature high-end non è disponibile.

Per eseguire l&#39;analisi quantitativa del contenuto di zucchero usando l&#39;analizzatore FRET, è necessario costruire una curva adattata stimare la concentrazione di zucchero destinazione dal rapporto FRET osservato. Sia r definisce il rapporto tra l&#39;intensità di emissione di PCP a 480 nm e l&#39;intensità di emissione di YFP generato a 530 nm (Eq. 1). <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54144/54144...

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Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Questo protocollo descrive la quantificazione rapida e altamente sensibile di Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) i dati dei sensori utilizzando un analizzatore portatile FRET su misura. Il dispositivo è stato utilizzato per rilevare maltosio in un intervallo di temperatura critica che massimizza sensibilità di rilevamento, consentendo valutazione pratica ed efficiente del contenuto di zucchero.

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