Name: highly sensitive and rapid fluorescence detection with a portable fret analyzer
Uploaded: 2016-10-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами от Intelligent синтетической биологии Центра глобального проекта Frontier (2011-0031944) и Программы KRIBB исследовательской инициативы.

1. Приготовление биосенсора <ol><li> Построить плазмиду pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 следуя ранее установленным протоколом 2. </li><li> Инокулируйте 5 мл бульона Луриа (LB) с одной колонии штамма кишечной палочки DE3 и инкубировать при 37 ° С в течение 16 часов при встряхивании. </li><li> Передача 1 мл / N O к...

<ol>
	<li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering.">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li><li>Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+highly+responsive+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors+for+detection+of+sugar+in+living+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).</li><li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca(2+)+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins.">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).</li><li>Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+glutamate+release+from+neurons+by+genetically+encoded+surface-displayed+FRET+nanosensors.">Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).</li><li>Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+detection+of+protein+interactions+in+surface-supported+bilayers.">Spectral F&#246;rster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers.</a> Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li><li>Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portable+FRET+analyzer+for+rapid+detection+of+sugar+content.">A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content.</a> Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).</li><li>Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+analyses+at+critical+temperatures+can+magnify+the+signal+intensity+of+FRET-based+sugar+sensors+with+periplasmic+binding+proteins.">Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins.</a> Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).</li><li>Hessels, A. M., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-encoded+FRET-based+sensors+for+monitoring+Zn2++in+living+cells.">Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells.</a> Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).</li><li>Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+sensor+for+intracellular+heme.">A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme.</a> ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).</li><li>. Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/">https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/</a> (2015)</li><li>Rajendran, R., Rayman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+blood+glucose+testing+for+diabetes+care+in+hospitalized+patients:+an+evidence-based+review.">Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).</li><li>Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+and+signal-transducer+binding+sites+of+the+Escherichia+coli+galactose+chemoreceptor+protein.">Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein.</a> Science. 242, 1290-1295 (1988).</li><li>Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., &#266;erimagi&#263;, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-containing+beverage+intake+in+toddlers+and+body+composition+up+to+age+6+years:+The+Generation+R+Study.">Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study.</a> Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).</li><li>Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+food,+fat+and+sugar+sweetened+beverage+items+are+related+to+children's+dietary+energy+density.">Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density.</a> FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).</li><li>Larsson, S. C., &#197;kesson, A., Wolk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sweetened+beverage+consumption+is+associated+with+increased+risk+of+stroke+in+women+and+men.">Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men.</a> J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).</li><li>Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+as+an+affinity+purification+tag.">Calmodulin as an affinity purification tag.</a> E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).</li></ol>

Этот протокол позволяет быстро и эффективно количественно оценить содержание сахара в образцах напитков, с использованием заказных FRET анализатор 7 при оптимальной температуре для датчиков ладу. Анализатор был разработан с недавно развитой, недорогой 405-нм полоса ультрафиолетов...

Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) широко используется в качестве биометрический датчик для обнаружения малых молекул , таких как сахара, ионов кальция и аминокислот 1-4. FRET биосенсоры содержат флуоресцентные белки, голубому флуоресцентные белки (СЛТ) и желтый флуоресцентные белки (YFPs), которые сливают с обоих концов периплазматических-связывающего протеина (ПСП). Сугарс связываются с ПСБ, расположенных в середине датчика FRET, вызывая структурные изменения в датчике, который впоследствии варьировал расстояние и дипольным ориентация двух флуоресцирующих белков в любом конце РВР. Это изменение позволяет количественного анализа содержания сахара путем измерения отношения длин волн излучения EYFP (530 нм) и ECFP (480 нм). Благодаря высокой чувствительности, специфичности, возможности мониторинга в режиме реального времени, а также быстрое время отклика FRET биосенсоров, эти датчики широко используются в экологических, промышленных и медицинских применений 5. Кроме того, ratiomИзмерение etric с использованием FRET биосенсоров имеет важные практические преимущества, так как он может быть использован для измерения компонентов в сложных биологических образцах, где концентрация датчик не может легко контролировать и фоновой флуоресценции всегда присутствует. Несмотря на эти преимущества датчиков на основе FRET для количественной визуализации, небольшие структурные изменения с неполным домена движения-передачи к флуоресцентных белков производят интенсивность по своей сути слабый сигнал. Этот слабый сигнал ограничивает применение датчиков FRET основе для в пробирке или в естественных условиях анализа 6. Следовательно, большинство FRET биосенсоры требуют применения дорогостоящих и высокочувствительного оборудования. Ранее мы разработали недорогой и портативный анализатор ладу возможностями , аналогичными существующих флуоресцентных анализаторов 7. В этом устройстве, недорогой 405-нм диапазона ультрафиолетового света на светоизлучающих диодах (СИД), был использован в качестве источника света, чтобы вызвать возбуждение госигнал флуоресценции е, заменяя дорогую лампу или лазер. Система обнаружения анализатора эффективно фокусирует сигнал флуоресценции рассеивая на двух фотоприемников с кремниевым фотодиодом. В более позднем исследовании мы показали , что оптимизация температуры обнаружения при 50 - 55 ° С может существенно увеличить радиометрический сигнал FRET 8. Это усиление сигнала температуры конкретных, наряду с заказного анализатором FRET, позволяет использовать датчики FRET в более общих диагностических применений с быстрой и высокой чувствительностью. В этом протоколе мы продемонстрировали общую применимость анализатора FRET при оптимальных температурных условиях FRET путем количественного определения содержания сахара в коммерчески доступных напитков. Этот протокол обеспечивает детали операции FRET устройства, а также краткое описание датчика и подготовки проб. Мы ожидаем, что этот доклад будет способствовать потенциальное применение портативногоАнализатор в небольших лабораторных условиях и обеспечивают основу для дальнейшего развития недорогого на месте диагностического устройства с биосенсоров FRET основе.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1297">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">LB</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#244620</td>
			<td style="width:760px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">isopropyl &#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tri-HCl</td>
			<td style="width:191px;">Bioneer</td>
			<td style="width:119px;">C-9006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">PMSF</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">78830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">EDTA</td>
			<td style="width:191px;">Bioneer</td>
			<td style="width:119px;">C-9007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">DTT</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Junsei</td>
			<td style="width:119px;">19015-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">70011-044</td>
			<td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SOC</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Resource Q</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1177-01</td>
			<td>6 &#215; 30 mm anion-exchange chromatography column&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">HisTrap HP1</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">29-0510-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Quartz cuvette</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z802875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">AK&#196;KTAFPLC</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">18-1900-26</td>
			<td>a fast protein liquid chromatography (FPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cary Eclipse</td>
			<td>VarianInc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>a fluorescence spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">VICTOR&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">2030-0050</td>
			<td>a multilabel plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">E. coli JM109 (DE3)</td>
			<td style="width:191px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">A (Beverage)</td>
			<td style="width:191px;">Korea Yakult Co. (Korea)</td>
			<td style="width:119px;">Birak</td>
			<td>Fermented drinks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">B (Beverage)</td>
			<td style="width:191px;">Lotte Foods (Korea)</td>
			<td style="width:119px;">Epro</td>
			<td>Soft drink</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">C (Beverage)</td>
			<td style="width:191px;">Lotte Foods (Korea)</td>
			<td style="width:119px;">Getoray</td>
			<td>Sports drink</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive and rapid fluorescence detection with a portable fret analyzer

Последние достижения в области Форстера резонансного переноса энергии (FRET) датчики позволили использовать их для обнаружения различных малых молекул, в том числе ионов и аминокислот. Однако врожденная слабая интенсивность сигнала датчиков FRET является серьезной проблемой, которая препятствует их применению в различных областях и делает использование дорогих, высокого класса флуорометры необходимо. Ранее мы создали экономически эффективное, высокопроизводительное FRET анализатор, который может конкретно измерить отношение двух эмиссионных диапазонах длин волн (530 и 480 нм) для достижения высокой чувствительности обнаружения. Совсем недавно было обнаружено, что FRET датчики с бактериальным периплазматических белков, связывающих обнаружить лиганды с максимальной чувствительностью в критическом интервале температур от 50 - 55 ° C. Этот отчет описывает протокол для оценки содержания сахара в коммерчески доступных образцов напитков с использованием нашего портативного анализатора FRET с датчиком температуры FRET конкретного. Наши результаты показали, что дополнительный предварительный нагревПроцесс датчика FRET значительно увеличивает отношение сигнал FRET, чтобы обеспечить более точное измерение содержания сахара. На заказ FRET анализатор и датчик были успешно применены для количественного определения содержания сахара в трех типах коммерческих напитков. Мы ожидаем, что дальнейшее уменьшение размера и производительности улучшение оборудования будет способствовать использованию ручных анализаторов в средах, где высококачественное оборудование не доступно.

Для проведения количественного анализа содержания сахара с использованием анализатора FRET, необходимо построить кривую подогнанную оценки концентрации целевого сахара из наблюдаемого соотношения FRET. Пусть г определить отношение интенсивности излучения УНЧ пр...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer at JoVE.com

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Этот протокол описывает быструю и высокочувствительную квантификацию Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) данных датчиков с использованием заказных портативного анализатора ладу. Устройство было использовано для обнаружения мальтозу в пределах диапазона критических температур, что обеспечивает максимальную чувствительность обнаружения, что позволяет практическую и эффективную оценку содержания сахара.

Высокочувствительных и быстрое обнаружение флуоресценция с помощью портативного анализатора FRET

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Регенерация выстроились золото микроэлектродов, оборудованных для анализатора в реальном времени ячейки

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Весьма деликатного и количественного обнаружения белков и их изоформы методом капиллярной изоэлектрической упором

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Обнаружение моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранные белки

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Обнаружение малых ГТФазы Prenylation и GTP привязки с помощью мембраны фракционирования и ГТФазы-Assay иммуносорбента

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Быстрое на основе флуоресценции характеристика одной внеклеточного везикулы в крови человека с анализом наночастиц отслеживание

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Обнаружение мест убиквитирования белка путем обогащения пептида и масс-спектрометрии

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Изучение метаболизма шести системных инсектицидов в недавно созданной культуре подвески клеток, полученных из чая(Камелия Sinensis L.) Листья

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Чрезвычайно быстрая и специфическая метаболическая маркировка РНК in Vivo с 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...