Name: a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors
Uploaded: 2016-10-30T13:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors at JoVE.com

This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).

<ol>
	<li>Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incompletely+base-paired+flip-flop+terminal+loops+link+the+two+DNA+strands+of+the+vaccinia+virus+genome+into+one+uninterrupted+polynucleotide+chain.">Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain.</a> Cell. 28, 315-324 (1982).</li><li>Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brock biology of microorganisms, 9th edn. , (2000).</li><li>Cooney, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+and+immunological+response+to+a+recombinant+vaccinia+virus+vaccine+expressing+HIV+envelope+glycoprotein.">Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein.</a> Lancet. 337, 567-572 (1991).</li><li>Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+recombinants:+expression+of+VSV+genes+and+protective+immunization+of+mice+and+cattle.">Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle.</a> Science. 227, 433-435 (1985).</li><li>Legrand, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+potent+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+by+attenuated+vaccinia+virus+vectors+with+deleted+serpin+genes.">Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes.</a> J Virol. 78, 2770-2779 (2004).</li><li>Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+live+vaccines+by+using+genetically+engineered+poxviruses:+biological+activity+of+recombinant+vaccinia+virus+expressing+influenza+virus+hemagglutinin.">Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin.</a> Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).</li><li>Wiktor, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+rabies+by+a+vaccinia+virus+recombinant+containing+the+rabies+virus+glycoprotein+gene.">Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene.</a> Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).</li><li>Gallucci, S., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danger+signals:+SOS+to+the+immune+system.">Danger signals: SOS to the immune system.</a> Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).</li><li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+danger+model:+a+renewed+sense+of+self.">The danger model: a renewed sense of self.</a> Science. 296, 301-305 (2002).</li><li>Guo, Z. S., Bartlett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+as+a+vector+for+gene+delivery.">Vaccinia as a vector for gene delivery.</a> Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).</li><li>Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+as+vectors+for+cancer+immunotherapy.">Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy.</a> Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).</li><li>Tysome, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lister+strain+of+vaccinia+virus+armed+with+endostatin-angiostatin+fusion+gene+as+a+novel+therapeutic+agent+for+human+pancreatic+cancer.">Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer.</a> Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).</li><li>Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+poxvirus+oncolytic+effects+through+increased+spread+and+immune+evasion.">Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion.</a> Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).</li><li>Park, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus,+JX-594,+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer:+a+phase+I+trial.">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li><li>Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+poxviruses+as+cloning+vectors:+insertion+of+the+thymidine+kinase+gene+from+herpes+simplex+virus+into+the+DNA+of+infectious+vaccinia+virus.">Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus.</a> Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).</li><li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA.">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> J Virol. 61, 1788-1795 (1987).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).</li><li>Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+that+are+associated+with+DNA+repeats+in+prokaryotes.">Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.</a> Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li><li>van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adaptive+and+heritable+immunity+in+prokaryotes.">CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes.</a> Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+Cas9+endonucleases+reveal+RNA-mediated+conformational+activation.">Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation.</a> Science. 343, 1247997 (2014).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Bi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+targeted+editing+of+large+viral+genomes+by+RNA-guided+nucleases.">High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases.</a> PLoS Pathog. 10, 1004090 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+scarless+human+stem+cell+genome+editing.">Optimization of scarless human stem cell genome editing.</a> Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-modified+cynomolgus+monkey+via+Cas9/RNA-mediated+gene+targeting+in+one-cell+embryos.">Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.</a> Cell. 156, 836-843 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+rats+with+conditional+alleles+using+CRISPR/Cas9.">Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.</a> Cell Res. 24, 122-125 (2014).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+editing+the+vaccinia+virus+genome+by+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system.</a> J Virol. 89, 5176-5179 (2015).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker-free+system+for+highly+efficient+construction+of+vaccinia+virus+vectors+using+CRISPR+Cas9.">A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).</li><li>Merchlinsky, M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+foreign+DNA+into+the+vaccinia+virus+genome+by+in+vitro+ligation:+recombination-independent+selectable+cloning+vectors.">Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors.</a> Virology. 190, 522-526 (1992).</li><li>Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+recombinant+vaccinia+viruses+using+PUV-inactivated+virus+as+a+helper.">Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper.</a> Biotechniques. 31, 534-540 (2001).</li><li>Johnson, R. D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand-break-induced+homologous+recombination+in+mammalian+cells.">Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells.</a> Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).</li></ol>

Authors have no competing financial interests.

Есть две основные цели, касающиеся модификации VV в терапевтических целях. Одним из них является, чтобы удалить конкретный ген, такой как ген тимидинкиназы (ТК) для ослабления вируса для противоопухолевого терапевтического применения. Другой вооружить VV с желаемого терапевтического гена (например, GM-CSF) или маркерный ген (например, ген люциферазы). Достижение любого из них включает в себя удаление целевого региона / гена. Способ лигирования прямой ДНК 35 и в пробирке методом 36 упаковки использовались ранее для создания мутантных вирусов осповакцины с изменениями гена TK. Тем не менее, эти способы имеют ограниченное применение в отношении мутации других областей в геноме из-за отсутствия уникальных сайтов рестрикции по всему геному. В настоящее время подход к созданию мутантный В.В. включает трансфекцию челнока (донор) вектора с маркером селекции (RFP или GFP) в CV-1 клеток через два часа после заражения VV для индукции гомологичной рекомбинации incorporatiнг на маркер селекции в целевом регионе. Выбор маркера положительных бляшек следуют их очистки 24 ч после трансфекции. Процесс очистки зубного налета может занять до 10 раундов, последние 3-4 недели и часто приводит к нежелательным рекомбинантных вирусов с маркерами селекции, вставленных в офф-целевых регионах. ДНК двухцепочечной разрывы могут эффективно индуцировать гомологичной рекомбинации в клетках млекопитающих 37, а также путем использования этого механизма, эффективность генерации мутантного VV может быть значительно улучшена. GRNA наведением система cas9 успешно применяется при редактировании генома и повышает эффективность гомологичной рекомбинации в эукариотических организмах 22, 25. В последнее время в клетках - хозяевах геномы аденовируса и типа I вируса простого герпеса , отредактированные с помощью gRNA-управляемой cas9 система 24. Недавно было показано, что система CRISPR cas9 является мощным инструментом для эффективного редактирования VV генома и конструирования вектора В. В. для выраженияконкретный ген. Оба n1l gRNA наведением cas9 и метод традиционной гомологичной рекомбинации (HR) привело к успешных HR-событий на одном целевом сайте n1l. Интересно, однако gRNA наведением cas9 индуцированный HR на более высоких уровнях эффективности, чем традиционный метод управления персоналом. Таким образом, использование gRNA-управляемой cas9 устраняет необходимость очистить как можно больше бляшек для получения мутантных VVS. В этой работе, мы значительно повысили эффективность и временные рамки для генерации мутантного VV с использованием gRNA-управляемой системы cas9 33. Следует отметить, что один важный шаг для достижения высокой эффективности гомологичной рекомбинации для трансфекции клеток CV-1 с помощью плазмид, экспрессирующих cas9 и gRNA в течение 24 ч перед выполнением обычной гомологичной рекомбинации. Интервал 24 ч позволяет cas9 и gRNA быть выражены на приемлемом уровне. Кроме того, последовательность gRNA ориентации конкретного гена может должны быть оптимизированы, как мы обнаружили, что различные gRNA последовательности тГен argeting n1l варьировалась в их эффективности 33, 34. Ограничение для CRISPR / cas9 при редактировании VV является низкая скорость RFP-положительных бляшек в первом раунде рекомбинации. Для того, чтобы получить достаточное количество RFP-положительных бляшек, содержащих рекомбинантный вирус, как правило, по меньшей мере, десять 6-луночные планшеты необходимы, что делает первый круглый скрининг утомительным. Следовательно, по-прежнему существует потребность в оптимизации протокола, чтобы преодолеть это ограничение. Небольшой размер RFP-положительных бляшек является еще одной потенциальной проблемой, что связано с большим объемом лизата, используемого для заражения 6-луночного планшета с. Чтобы преодолеть эту проблему, меньший объем лизата должен быть использован для заражения 6-луночный планшет для получения больший размер RFP-положительные бл шки. Используя меньший объем лизата также позволит для лучшего разделения RFP-положительных бляшек из ППК-отрицательных. Следовательно, меньшее количество раундов очистки бляшек необходимы для получения чистых RFP-положительных бляшек. <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; Off-мишени эффекты всегда нежелательная проблема в редактировании гена. CRISPR-cas9 показал вне целевых эффектов. Тем не менее, при тщательном проектировании gRNA, вне цели эффектов можно избежать при редактировании В. В. геномов 33, 34. Это особое преимущество использования gRNA-управляемой системы cas9 для редактирования генома VV. Учитывая обещания В.В., используя систему / cas9 CRISPR ускорит развитие мутантных VVS для биомедицинских исследований, так и в трансляционной медицине. Кроме того, такая система будет также ускорить открытия в области клеточной биологии, таких как рассечение сигнальных путей, используемых для VV его актина на основе моторики.

Вирус коровьей оспы (VV) представляет собой оболочечный ДНК-вирус, принадлежащий к семейству поксвирусной и играет решающую роль в одном из самых больших достижений в медицине ликвидации оспы. В после ликвидации оспы, В.В. был разработан в качестве вектора для доставки генов для вакцин против ВИЧ и других инфекционных заболеваний , 1-7, вставляя гены от различных патогенов в векторы VV. В.В. также широко используют в качестве вектора для иммунотерапии рака 8-14 особенно для развития онколитической вируса коровьей оспы с опухолью целевой репликации. Для того, чтобы создать эффективную вакцинного вектора с улучшенной селективностью в отношении раковых клеток, модификации в пределах вирусного генома необходимы, в том числе генов, делеции или введение терапевтических генов. С развитием технологии ДНК и лучшего понимания молекулярной биологии и вирусологии, вставки чужеродной ДНК в ВВ был первоначально достиженияd с использованием гомологичной рекомбинации (HR) в 1980 - е годы 15. Этот метод до сих пор широко используется для построения векторов VV. Введение генетической модификации достигается за счет использования шатл-вектор для HR, который рекомбинирует с В.В. геном в предварительно инфицированных клетках. Тем не менее, этот метод оказался весьма неэффективным (менее 1% эффективности гомологичной рекомбинации 16) , и часто приводит к случайной вставки маркера селекции в нецелевых областей и / или потери маркера при расширении вируса. Эффективность ДНК гомологичной рекомбинации для вставки экзогенной ДНК в геномных локусов может быть значительно повышена в присутствии двунитевых разрывов (DSBs) 17. Таким образом, технология, которая может вызвать DSBs на мишени локусов имеет большой потенциал для генной инженерии ВВ. Недавно разработанная система CRISPR-cas9 показывает посыл для запуска DSBs в любой области гена В.В.. CRISPR-cas9 является РНК-руководствуясь нуклеазы участвует в адаптивного иммунитета против вторгшихся фагов и других зарубежных генетических материалов 18-20. Есть три CRISPR-Cas системы в диапазоне видов микроорганизмов 21. Система CRISPR-Cas типа II широко используется для редактирования генома эукариотических клеток и крупных вирусов. Он состоит из РНК - наведением cas9 эндонуклеазы (из Streptococcus Пирролидонилпептидаза), один направляющий РНК (sgRNA) и транс-активирующих crRNA (tracrRNA) 22-24. Комплекс cas9 / sgRNA распознает комплементарную 20-нуклеотидную последовательность геномной предшествующую последовательность 5&#39;-NGG-3 &#39;Protospacer смежный мотив (ПАМ) в клетках млекопитающих 22, 23. Она была успешно использована для эффективной генерации генетически модифицированных клеток, вирусов и животные модели 22-32. Система CRISPR-cas9 оказалась эффективным инструментом для генома таргетирования в сочетании с гомологичной рекомбинации в цитоплазме инфицированных VV CV-1 клеткиs для создания мутантных вирусов осповакцины 33, 34. Для того чтобы расширить потенциальное применение этого метода, мы приводим подробную информацию о методологии этой системы. Описанный протокол может быть использован для создания мутанта VV с определенным делеции гена и / или руку мутантный вирус с терапевтическим трансгенов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Plasmid #41824</td>
			<td style="width:212px;">41824</td>
			<td style="width:137px;">Addgene</td>
			<td style="width:225px;">gRNA cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pST1374&#160;</td>
			<td>13426</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Cas9 cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pGEMT easy</td>
			<td>A1360</td>
			<td>promega</td>
			<td>repair donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">One Shot TOP10 Chemically Competent&#160;E .Coli</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>27106</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dulbecco&#8217;s Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>SH30088.03HI</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin, streptomycin</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Effectene</td>
			<td>301425</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>transfection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL</td>
			<td>W-06754-96</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>collect virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Olympus BX51 Fluorescence&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>find RFP-positive plque</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>69506</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix</td>
			<td>AB-0794/B</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PCR reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cm culture dish</td>
			<td>Z688819-6EA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plate</td>
			<td>Z707759</td>
			<td>sigma</td>
			<td>cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell scraper</td>
			<td>C5981</td>
			<td>sigma</td>
			<td>scrap cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XTrypsin-EDTA solution</td>
			<td>T4299</td>
			<td>sigma</td>
			<td>trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Virkon</td>
			<td>95015661</td>
			<td>Anachem Ltd</td>
			<td>desinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tube</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>hold cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N1L forward 5&#8217;-TATCTAGCAATGGACCGT-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N1L reverse&#160; 5&#8217;-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">A52R forward 5&#8217;-ATAGGATTGTGTGCATGC-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">A52R reverse 5&#8217;-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RFP forward 5&#8217;- GCTACCGGACTCAGATCCA-3&#8217;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RFP reverse 5&#8217;-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3&#8217;</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCR primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Argarose</td>
			<td>A7431</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>resolve PCR product</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G:BOX F3</td>
			<td>G:BOX F3</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>UV gel doc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Для строительства нового вектора VV, ключевой отправной точкой является проектирование и строительство челночный вектор донор, который может предназначаться для конкретного региона генома. В этом исследовании, ген В.В. n1l был использован в качестве примера цели. Кассета челночного вектора донора для рекомбинации и целевой области в VV показаны на рисунке 1. Для повышения эффективности гомологичной рекомбинации, плазмиды , экспрессирующие cas9 и n1l-специфическую gRNA котрансфицируют в CV -1 клетки 48 ч до проведения гомологичной рекомбинации 33. Однажды (24 ч) после трансфекции, была выражена RFP в клетках CV-1 (рисунок 2). После заражения CV-1 клеток со всей лизата из гомологичной рекомбинации (этап 5), ЗП-положительные и отрицательные бляшки и наблюдали в клетках CV-1 (рисунок 3). После протокола очистки, описанный, чистый со бляшка<html> ÜLD быть получен после того, как 3-5 раундов очистки. Как показано на рисунке 4, все бляшки после инфицирования клеточного лизата , полученного из чистого бляшки с мутантным вирусом осповакцины представил сигнал RFP. Для того, чтобы проверить , является ли чистый мутант В.В. имел правильную модификацию гена, использовали ПЦР , чтобы подтвердить отсутствие гена - мишени n1l, как показано на рисунке 5. ПЦР - модифицированного вируса показали положительный сигнал для ЗП и отсутствующий сигнал для n1l ( на рисунке 5 полоса AG), в то время как результаты ПЦР n1l для контрольного вируса (КТР) с интактным n1l области положительна. Фрагменты ДНК управления A52R были положительными для всех рекомбинантных вирусов и вируса Ctr. Эффективность HR в RFP-положительных бляшек составляет 100% (6/6) в этом эксперименте (это было до 94% в предыдущей работе 34). Описанный в настоящем документе способ улучшило эффективность рекомбинации более чем в 100 раз по сравнению с обычными протоколами 33, 34. Содержание &quot;ВОК: Keep-together.within-страница =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> Рисунок 1:. Кассета из челночного вектора донора для гомологичной рекомбинации, а целевая область в геноме В.В. Очистку маркерный ген RFP управляется промотором H5. Вектор ремонта донор ориентированных на результаты региона n1l в гене RFP включаются в n1l области после гомологичной рекомбинации. &#39;X&#39; указывает на гомологичную последовательность в векторе донора ремонта , который заменит ту же последовательность на геном вируса осповакцины. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> Рис . 2: Визуализация CV-1 клеток через один день после гомологичной рекомбинации Однажды Afteг гомологичной рекомбинации, клетки , инфицированные VV и трансфицированные вектором донора ремонта являются RFP-положительным A:. Фазовый контраст изображения (исходное увеличение 100X . ) B: люминесцентной микроскопии изображение (исходное увеличение 100X). Шкала бар = 50 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> Рис . 3: ПНП-позитивных бляшек в первом раунде очистки мутантного вируса В первом раунде очистки мутантного вируса, ЗП-положительные бляшки (обведено красной линией) с удалением целевой области окружены бляшек , образованных вирус дикого типа (обведено желтой линией) A:. Фазовый контраст изображения (исходное увеличение 100X . ) B: флуоресценция микрoscopy изображение (исходное увеличение 100X). Шкала бар = 50 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> Рис . 4: Чистый мутант В.В. Через 3-5 раундов очистки, чистые бляшки были получены , как и все бляшки были RFP-положительными A:. Фазовый контраст изображения (исходное увеличение 100X . ) B: люминесцентной микроскопии изображение (исходное увеличение 100X) , Шкала бар = 50 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> Рисунок 5: Verificatioп чистого мутант VV. ДНК экстрагировали из VV инфицированных CV-1 клеток. Удаление целевой области n1l была подтверждена с помощью ПЦР с использованием праймеров n1l, введение ЗП в n1l области была подтверждена с помощью ПЦР с использованием праймеров, RFP. Дорожки AF соответствуют шесть очищенных бляшек, полоса G является контрольным табличка с n1l удаление подтверждено в предыдущей работе 33, полоса Ctr (контроль) является диким типом вируса коровьей оспы (с n1l области нетронутыми). A52R ген амплифицировали в качестве контрольного гена для всех образцов. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors at JoVE.com

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Вирус коровьей оспы (VV) широко используется в медико-биологических исследований и улучшения здоровья человека. В данной статье описывается простой, очень эффективный метод для редактирования В.В. генома с использованием системы CRISPR-cas9.

Простой и эффективный подход к Construct Mutant осповакцины вирусного вектора

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Скрининг на хост факторов, участвующих в Vaccinia Вирусной инфекции использованием Drosophila Ячейки

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Простой и эффективный способ изолировать Макрофаги из смешанного первичных культурах клеток взрослого организма Печень

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Простая и надежная В естественных условиях И В пробирке Подход к изучению вируса Ассамблеи

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Инженерные и эволюции Синтетическая адено-связанный вирус (AAV) генной терапии векторы с помощью ДНК семьи Перетасовка

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Простой и эффективный метод для обнаружения ядерных активация фактора в человеческих нейтрофилов с помощью проточной цитометрии

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Методология эффективного поколения флуоресцентно помеченных вирусных белков Vaccinia

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro анализ MyD88-опосредованной клеточного иммунного ответа на вирус Западного Нила мутантный штамм инфекции

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Простое и эффективное производство и очистка мыши миелина олигодендроцитов гликопротеина для экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита исследований

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Эффективной и простой метод для установления линии Т-клеток у больных с хроническим активный вирус Эпштейна - Барр инфекции и НК

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...