Name: assay of adhesion under shear stress for the study of t lymphocyte-adhesion molecule interactions
Uploaded: 2016-06-29T16:00:00
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The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.

1. Placage les cellules CHO-ICAM Remarque: Le but de cette étape est de plaquer les cellules CHO-ICAM dans les chambres d&#39;écoulement pour la croissance durant la nuit dans le but de générer une monocouche confluente. <ol><li> Maintenir les cellules CHO-ICAM dans 10 cm de culture de tissus traités boîtes de culture dans 10 ml de milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (CHO-ICAM milieu de culture complet) à 37 ° C avec 5% CO 2.</su...

<ol>
	<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+and+its+effector+RIAM+are+required+for+lymphocyte+trafficking.">Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking.</a> Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).</li><li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation.">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+adhesion+assay+for+the+study+of+integrin+activation+in+T+lymphocytes.">Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li><li>Ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+shear+rates+for+ibidi+&#956;-Slides+-+based+on+numerical+calculations.">Shear stress and shear rates for ibidi &#956;-Slides - based on numerical calculations.</a> Application Note 11. , (2014).</li><li>van Gijsel-Bonnello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantethine+Alters+Lipid+Composition+and+Cholesterol+Content+of+Membrane+Rafts,+With+Down-Regulation+of+CXCL12-Induced+T+Cell+Migration.">Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration.</a> J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).</li><li>Tozeren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+adhesion+of+phorbol+12-myristate-13-acetate-stimulated+T+lymphocytes+to+planar+membranes+containing+intercellular+adhesion+molecule-1.">Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1.</a> Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).</li><li>Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+mechanisms+regulating+chemokine+activity+and+availability.">Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability.</a> Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).</li><li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+binding+assay+for+studying+chemokine+interactions+with+endothelial+cells.">In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells.</a> J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1:+getting+a+grip+on+leukocyte+adhesion.">ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion.</a> J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).</li></ol>

Afin d&#39;analyser correctement T l&#39; adhésion cellulaire, le stimulant à inclure dans l&#39;étude doit être pris en compte lors du choix d&#39; une méthode in vitro. Bien qu&#39;il existe plusieurs tests pour étudier les signaux menant à LFA-1 activation et ICAM-1 liant toutes les méthodes ne sont pas interchangeables. Un essai d&#39;adhérence statique 10 est le mieux adapté pour étudier les interactions des cellules T-APC; En variante, le procédé de la contrainte de cisaillement d?...

Adhérence des lymphocytes T médiatise un certain nombre de processus distincts dans un système immunitaire sain, 3 jouant un rôle essentiel dans le trafic des lymphocytes T et la présentation de l&#39; antigène. Que ce soit lors de la surveillance immune ou une réponse immunitaire active ces deux tâches d&#39;adhérence sont critiques. 4 Les événements de signalisation physiologiques des interactions cellulaires de cellules endothéliales T sont distinctes des cellules T cellule présentatrice d&#39; antigène (APC) des interactions, et donc nécessitent des méthodes distinctes de étude pour comprendre mieux les cascades de signalisation impliquées. L&#39;adhérence ferme d&#39;une cellule T à une paroi du vaisseau sanguin pendant l&#39;extravasation des lymphocytes nécessite une activation rapide et dynamique intégrine. L&#39;interaction étroite entre une intégrine et d&#39; adhérence des molécules d&#39;État actifs le long de l&#39;endothélium conduit à résistant à l&#39;écoulement du sang adhérence, qui permet aux cellules T à ramper le long de la surface à la recherche d&#39;une zone permissive au passage cellulaire. 5 L&#39;exploration d&#39;un bi cellulaire T -directionally alonga paroi du vaisseau sanguin est tributaire de l&#39; adhésion polarisée, avec une extrémité avant adhésive distincte de la cellule T. 6 Plus important encore , l&#39; adhésion ferme et la transmigration exigent une résistance à la force de cisaillement générée par la circulation du flux sanguin. Lors de la conception des expériences pour étudier l&#39;adhérence des lymphocytes, l&#39;attention devrait être accordée à la relance d&#39;intérêt spécifique. Bien que l&#39;activation des intégrines est un composant commun et critique de toutes les formes de T adhésion cellulaire, les cascades d&#39;activation sont susceptibles d&#39;être unique en aval des récepteurs individuels et co-récepteurs. De même, les paires d&#39;intégrine et la molécule d&#39;adhésion en fonction des micro-environnements spécialisés et sur des sous-populations spécifiques. De cette façon, ces paires peuvent être réglées différemment. Le modèle présenté ici est idéal pour l&#39;étude des cascades conduisant à l&#39; activation qui se déroule dans des conditions de contrainte de cisaillement intégrine de signalisation. 7 Ces interactions ne peuvent être compris de manière adéquate dans un ADHESI statiquesur le système en raison de l&#39;impact a été démontré que ces forces d&#39;avoir directement sur ​​le comportement des cellules T. 8 Bien que présenté ici avec des cellules T et CHO (ovaire de hamster chinois) , les cellules modifiées pour exprimer (cellules CHO-ICAM) ICAM-1 humain , le système peut facilement être modifié pour étudier différentes populations leucocytaires ou des molécules d&#39;adhésion. Cet essai fournit un procédé pour quantifier adhésivité des cellules T et l&#39;activation de l&#39;intégrine en utilisant une contrainte de cisaillement, en fournissant un modèle pour la phase solide d&#39;adhérence de leucocyte extravasation. Grâce à l&#39;utilisation de cellules CHO-ICAM l&#39;affinité de LFA-1 pour son ligand dans les cellules vivantes peuvent être examinées en temps réel en réponse à divers stimuli d&#39;intérêt. Cette technique nécessite facilement obtenu, disponibles dans le commerce des chambres micro-flux en combinaison avec une pompe seringue, grandement simplifier l&#39;équipement nécessaire pour modéliser le flux sanguin et la contrainte de cisaillement par rapport aux autres modèles. 9 Un autre avantage majeur de cette analyse est que la signalisation spécifiquecascades et l&#39;état d&#39;activation résultant des intégrines individuelles peuvent être étudiées proprement grâce à l&#39;utilisation de cellules CHO modifiées exprimant des molécules d&#39;adhésion humaines d&#39;intérêt. En outre, la combinaison des données quantitatives avec l&#39;imagerie des cellules vivantes est un avantage important de cette méthode. Dans l&#39;ensemble, tandis qu&#39;un certain nombre d&#39;essais de statique adhérence des cellules T ont été décrit que bien modéliser les interactions des cellules T-APC, ces modèles ne sont pas suffisantes pour capturer le processus dynamique de T adhérence de cellules épithéliales. Pour cette raison, lors du choix d&#39;un test d&#39;adhérence du stimulus en question doit être envisagée.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">T cell samples (cell line or primary)</td>
			<td style="width:269px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-152</td>
			<td style="width:248px;">Peripheral human T cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHO-ICAM-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-2093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#181;-Slide VI 0.4 ibiTreat</td>
			<td>ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">500 ml glass bottle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml glass bottle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB800250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicone tubing 0.8 mm</td>
			<td>ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscope with incubator chamber</td>
			<td>Ziess</td>
			<td style="width:119px;">700</td>
			<td>Any wide field fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td style="width:119px;">NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">60 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:119px;">309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFSE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">65-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDF-1&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">350-NS-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">16561-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Volocity software</td>
			<td style="width:269px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:269px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.48V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay of adhesion under shear stress for the study of t lymphocyte-adhesion molecule interactions

Dans l&#39;ensemble, l&#39;adhérence des cellules T est une composante essentielle de la fonction, ce qui contribue aux processus distincts de recrutement cellulaire à des sites d&#39;inflammation et de l&#39;interaction avec les cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC) dans la formation des synapses immunologiques. Ces deux contextes de T adhésion cellulaire diffèrent en ce que T interactions cellule-APC peuvent être considérés comme statique, alors que les interactions des vaisseaux cellules T dans le sang sont contestées par la contrainte de cisaillement générée par la circulation elle-même. les interactions cellule T-APC sont classés comme statique en ce que les deux partenaires cellulaires sont statiques par rapport à l&#39;autre. En règle générale, cette interaction se produit dans les ganglions lymphatiques. Comme une cellule T interagit avec la paroi du vaisseau sanguin, les cellules arrêtent et doivent résister à la contrainte de cisaillement générée. 1,2 Ces différences mettent en évidence la nécessité de mieux comprendre l&#39; adhérence statique et l&#39; adhérence dans des conditions d&#39;écoulement comme deux processus réglementaires distincts. La régulation de T adhérence cellulaire peut être très succinctement décrit comme conpêche à la traîne de l&#39;état de molécules d&#39;intégrine exprimées sur la surface cellulaire, et régulant ainsi l&#39;interaction des intégrines avec les ligands de molécules d&#39;adhérence exprimées à la surface de la cellule d&#39;interaction d&#39;affinité. Notre compréhension actuelle de la réglementation des intégrines états d&#39;affinité provient souvent simpliste dans des systèmes modèles in vitro. L&#39;essai d&#39;adhérence en utilisant des conditions d&#39;écoulement décrites ici permet la visualisation et la quantification précise des interactions cellulaires de cellules épithéliales T en temps réel, suite à un stimulus. Une adhérence sous test d&#39;écoulement peut être appliqué à l&#39;étude de l&#39;adhérence de signalisation au sein des cellules T après un traitement avec des substances inhibitrices ou stimulateurs. De plus, ce dosage peut être étendu au-delà de la signalisation des cellules T à une population leucocytaire adhésif et une paire quelconque d&#39;une molécule d&#39;intégrine-adhérence.

Les résultats représentatifs sont présentés dans le test d&#39;adhérence de l&#39; écoulement à l&#39; aide de Jurkat et des cellules T CD3 + humaines primaires, comme indiqué, stimulées par le SDF-1α. Les contrôles négatifs dans toutes les expériences présentées sont des cellules non stimulées. Un seuil de base pour cent l&#39;adhésion des cellules non stimulées est comprise entre 5 - 10%; adhérence de base, notamment au-dessus de cette fourchette indique u...

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Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Ce test d&#39;adhésion de flux fournit un modèle d&#39;impact simple, élevé d&#39;interactions cellulaires de cellules épithéliales T. Une pompe à seringue est utilisée pour générer une contrainte de cisaillement, et la microscopie confocale capture des images pour la quantification. Le but de ces études est de quantifier efficacement l&#39;adhérence des cellules T en utilisant des conditions d&#39;écoulement.

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

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