Name: applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

Bemærk: Alle procedurer, der omfatter vækst eller manipulation af Coxiella burnetii RSA439 NMII bør udføres i en fysisk indeslutning niveau 2 Laboratorium og inden for en biologisk sikkerhedsskab i overensstemmelse med lokale retningslinjer. Et skematisk diagram af den omvendte transfektion og translokation assay arbejdsgang er beskrevet nedenfor, er vist i figur 2. 1. Fremstilling af C. burnetii Culture Udtrykke CBU0077 fusioneret til p-lactamase (pBlaM-...

Sekretionssystemer og de bakterielle effektor proteiner disse transportsystemer ind i cytoplasmaet af værtsceller, er en vigtig virulens komponent, mange patogene bakterier anvender til at etablere en infektion i unikke replikative nicher. Fokus for mange forskergrupper har været at undersøge samspillet mellem bakterielle effektorer og værtsproteiner og den indflydelse, disse effektorer har på værten cellulære veje. Meget begrænset forskning, om nogen, har undersøgt potentialet for værtsproteiner at være nød...

Coxiella burnetii er en unik intracellulært patogen, som forårsager den zoonotiske infektioner hos mennesker Q-feber. Denne sygdom er forbundet med et bredt spektrum af kliniske præsentationer strækker sig fra asymptomatisk serokonversion til livstruende kronisk infektion, som ofte manifesterer sig som endocarditis år efter eksponering 1. Menneskelig infektion forekommer primært gennem indånding af forurenede aerosoler med drøvtyggere den største reservoir for infektion, især malkekøer, får og geder. Selv Coxiella infektion i disse dyr er typisk subklinisk, kan infektionen udløse abort og den betydelige bakterielle belastning i fødende væske og placenta kan forurene det lokale miljø en. Et eksempel på den enorme byrde sådan kontaminering kan have på både folkesundheden og landbrugsindustrien blev for nylig observeret i Q-feber udbrud, der fandt sted i Holland 2. Mellem 2007 og2010 blev over 4.000 humane tilfælde af Q-feber diagnosticeret og dette udbrud var forbundet med betydelig forurening af ged gårde 3. Derudover Coxiella er en potentiel biologisk våben, som klassificeret af det amerikanske Centers for Disease Control og Forebyggelse, på grund af den miljømæssige stabilitet bakterier og lav infektiøs dosis nødvendig for at forårsage alvorlig sygelighed og dødelighed 4. Coxiella eksisterer i to faser: Fase I organismer, isoleret fra naturlige kilder, er yderst virulent og fase II organismer er stærkt svækket in vivo. For eksempel, efter flere in vitro passager af Coxiella burnetii Nine Mile Fase I organismer, blev fase II bakterier produceres der indeholder en irreversibel kromosomal deletion resulterer i afkortede lipopolysaccharid (LPS) 5. Denne stamme, C. burnetii NMII, er fænotypisk svarer til fase I i vævskultur modeller og giver en mere sikker tilstandl for forskerne at studere Coxiella patogenese i laboratorier 5. I de senere år har flere gennembrud hurtigt avancerede inden for Coxiella genetik. Mest bemærkelsesværdigt, udvikling af axenisk medier (syrnet citrat cystein medium - ACCM-2) har tilladt celle-fri vækst i Coxiella i både flydende og faste medier 6,7. Dette resulterede i direkte forbedringer af genetiske værktøjer til rådighed for Coxiella herunder et inducerbart genekspression systemet, shuttle vektorer og tilfældige transposon systemer 8-11. Senest har to metoder til målrettet gen inaktivering også blevet udviklet, hvilket banede vejen for behandlingen specifikke virulens gen kandidater 12. Efter internalisering af alveolære makrofager, Coxiella replikerer til høje numre i en membranbundet rum betegnet Coxiella- indeholdende vacuolen (CCV). Den CCV kræver vært endocytiske handel thru tidlige og sene endosomer indtil det modnes til en lysosomer-afledt organel 13. I hele denne proces, CCV erhverver værten faktorer, enten vises forbigående eller forblive forbundet med vakuolet, herunder, men ikke begrænset til, Rab5, Rab7, CD63 og LAMP-1 13-15. Replikation af Coxiella inden værtsceller er helt afhængig af en fuldt funktionel Dot / Icm Type IVB Sekretion System (T4SS) 8,16,17. Denne sekretion system er en multi-proteinstruktur ancestrally relateret konjugering systemer og strækker sig over begge bakterielle og vakuolære membraner til at levere bakterielle proteiner, betegnet effektorer, i værtens cytoplasma 18. Coxiella T4SS er funktionelt meget lig den velkarakteriserede Type IVB Dot / Icm Sekretion System af Legionella pneumophila 19,20. Interessant nok aktivering af T4SS og efterfølgende effektor translokation ikke før Coxiella når den sure lysosomet-afledteorganel, ca. 8 timer efter infektion 17,21. Til dato har over 130 Dot / .icm effektorer blevet identificeret 9,17,22-24. Mange af disse effektorer sandsynligvis spiller en vigtig rolle under replikation af Coxiella inden værtsceller; har dog kun få effektorer blevet funktionelt karakteriseret 25-29. I denne undersøgelse anvender vi en fluorescens baseret translokation assay, der bygger på spaltning af CCF2-AM FRET substrat (i det følgende benævnt BlaM substrat) via β-lactamase-aktivitet i værtscellen cytoplasma (figur 1). Genet af interesse er fusioneret til TEM-1 β-lactamase (BlaM) på et reporterplasmid, der tilvejebringer konstitutiv ekspression. Den BlaM Bundlaget består af to fluorophorer (coumarin og fluorescein), som danner et FRET-par. Excitation af coumarin resultater i FRET af fluorescein og grøn fluorescensemission i fraværet af effektor translokation; Men hvis BlaM-effektor-fusionsproteinet translokeres i værtens cytoplasma, den resulterende β-lactamase-aktivitet spalter β-lactamringen af ​​BlaM substratet, adskillelse af FRET-par producerer blå fluorescensemission efter excitation. Denne translokation assay er blevet godt bevist som en tilgang til at identificere effektor proteiner fra en række forskellige intracellulære og ekstracellulære bakterier, herunder C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogene E. coli, salmonella og Brucella 17,30-35. For at fastlægge den rolle, specifikke vært faktorer på Coxiella effektor translokation vi udnytte en veletableret metode til gendæmpning kaldet RNA-interferens, især små interfererende RNA (siRNA). Oprindeligt identificeret i Caenorhabditis elegans, RNA-interferens er et bevaret endogen cellulær proces, der anvendes til medfødte FORSVARSPOLITIKNSE mod virus samt genregulering 36,37. Efter binding af sekvens-specifikke siRNA, nedbrydning af mRNA forekommer gennem RISC (RNA-induceret silencing kompleks) resulterer i specifikt gen-nedregulering eller knockdown 38. I denne undersøgelse blev siRNA anvendes til at målrette to værtsproteiner, Rab5A og Rab7A, som er vigtige regulatorer af endocytiske proces. Virkningen af lyddæmpning Rab5A og Rab7A på effektor translokation blev konstateret ved hjælp af C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 blev valgt som det var tidligere vist at være omplantes af Dot / Icm sekretion system Coxiella 17. Ved hjælp både siRNA gendæmpning og fluorescencebased translokation assay beskrives her, er vi begyndt at etablere en rolle for værten faktorer i translokationen af effektor proteiner ved Coxiella. Denne fremgangsmåde kan anvendes til en bred vifte af både intracellulære og ekstracellulære bakterier, der besidder lignende secretion-systemer, der er ansvarlige for translokation af effektor proteiner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Reagents</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Citric acid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0759</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S4641</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Potassium phosphate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60218</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">442611</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5080</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Iron sulfate</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S93248</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9625</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6852</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bacto-neopeptone</td>
			<td style="width:87px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">211681</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1424</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Methyl beta cyclodextrin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4555</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">RPMI + Glutamax</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378</td>
			<td style="width:211px;">For bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">D-001810-10-05</td>
			<td style="width:211px;">Non-targeting control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-003290-01-005</td>
			<td style="width:211px;">Causes cell death; measure of transfection efficiency</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-004009-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-010388-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">5X siRNA buffer</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:211px;">Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">T-2001-01</td>
			<td style="width:211px;">For transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Opti-MEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td style="width:211px;">Reduced-serum medium used for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">DMEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10567-014</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DMSO</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:211px;">For storage of Coxiella strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PBS</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">0.05% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">dH2O</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For dilution of samples and standards for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Quick-gDNA Mini Prep</td>
			<td style="width:87px;">ZYMO Research</td>
			<td style="width:119px;">D3007</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product to extract gDNA</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td>
			<td style="width:87px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-98020</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:343px;">LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K1032</td>
			<td style="width:211px;">For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106469</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71505</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium hydrogen orthophosphate</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106586</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Probenicid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62251</td>
			<td style="width:211px;">Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:211px;">Fixing solution for HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">25cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430639</td>
			<td style="width:211px;">For growth of bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">75cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430641</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">175cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431080</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Haemocytometer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For quantification of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tear-A-Way 96 Well PCR plates</td>
			<td style="width:87px;">4titude</td>
			<td style="width:119px;">4ti-0750/TA</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">8-Lid chain, flat</td>
			<td style="width:87px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">65.989.002</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top microfuge</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top vortex</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Orbital mixer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:211px;">For pelleting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">Mx3005P QPCR machine</td>
			<td style="width:87px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">401456</td>
			<td style="width:211px;">For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">ClarioSTAR microplate reader</td>
			<td style="width:87px;">BMG LabTech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For measurement of fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing

Coxiella burnetii, det agens af Q-feber, er et intracellulært patogen, der bygger på en type IV Dot / Icm Sekretion System at etablere et replikativt niche. En kohorte af effektorer translokeres via dette system i værtscellen til at manipulere vært processer og tillade etableringen af ​​et unikt lysosom-afledt vacuole for replikation. Fremgangsmåden præsenteres her involverer kombinationen af ​​to veletablerede teknikker: specifik gendæmpning hjælp siRNA og måling af effektor translokation anvendelse af en FRET-baseret substrat, der er afhængig af β-lactamase-aktivitet. Anvendelsen af ​​disse to tilgange, kan vi begynde at forstå betydningen af ​​værten faktorer i bakteriel sekretion-system funktion og effektor translokation. I dette studie undersøgte vi rollen som Rab5A og Rab7A, som begge er vigtige regulatorer af endocytiske trafficking pathway. Vi viser, at silencing ekspressionen af ​​enten protein resulterer i en formindskelse af effektor translocation effektivitet. Disse fremgangsmåder kan let modificeres til at undersøge andre intracellulære og ekstracellulære patogener, der også udnytter sekretionssystemer. På denne måde kan et samlet billede af værten faktorer involveret i bakteriel effektor translokation blive afsløret.

Til denne undersøgelse C. burnetii pBlaM-CBU0077 stamme blev valgt som CBU0077 tidligere er blevet vist at være en omplantes effektor af Coxiella Dot / Icm sekretionssystem 17. Før infektion, det samlede antal genomer / ml i syv dages C. burnetii pBlaM-CBU0077 kulturen blev optalt under anvendelse af qPCR. Figur 4 viser et eksempel på tærsklen cyklus (Ct) værdier forventes fra begge standarder og prøver følgende qPCR. De Ct-v...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Undersøge samspillet mellem bakterielle patogener og deres værter er et vigtigt område for biologisk forskning. Her beskriver vi de nødvendige teknikker til at måle effektor translokation af Coxiella burnetii under siRNA gendæmpning hjælp BlaM substrat.

Anvendelse fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) til at undersøge Effector translokationseffektivitet af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Påvisning af toksin translokation i værtslandet cytosolen af ​​overflade plasmon resonans

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overvinde unresponsiveness i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) Resistente musestammer ved adoptiv overførsel og antigenudfordring

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In vitro assay at evaluere virkningen af immunoregulerende Pathways på HIV-specifikke CD4 T-celle effektorfunktion

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion af murine tarmbetændelse ved adoptiv overførsel af effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høj</sup&gt; T celler i immunsvækkede mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation og Multi-fænotypisk High-indhold Screening af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Anvende en Inducerbar Expression System til Studieinformationen Interferens med bakteriel virulensfaktorer med intracellulær signalering

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse af<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translokation i værtsceller Brug Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Måling fagosom pH ved Ratiometrisk fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Udviklingen af ​​Frysetørret Loop-medierede Isotermiske Amplification reagenser til påvisning af<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

En metode til at vurdere Fc-medieret effektor funktion induceret af Influenza Hemagglutinin specifikke antistoffer

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...