Name: applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

Nota: Tutte le procedure che coinvolgono la crescita o la manipolazione di Coxiella burnetii RSA439 NMII devono essere eseguite in un livello di contenimento fisico 2 Laboratorio e all&#39;interno di una cappa di sicurezza biologica in conformità con le linee guida locali. Un diagramma schematico del flusso di lavoro trasfezione e dosaggio traslocazione inversa descritto di seguito è mostrata in figura 2. 1. Preparazione di C. burnetii cultura Esprimendo CB...

sistemi di secrezione, e le proteine ​​effettrici batteriche questi sistemi di trasporto nel citoplasma delle cellule ospiti, sono una componente importante di virulenza che molti batteri patogeni utilizzano per stabilire una infezione all&#39;interno di nicchie replicative unici. L&#39;attenzione di molti gruppi di ricerca è stato quello di indagare l&#39;interazione tra effettori batterici e proteine ​​host e l&#39;influenza di questi effettori hanno sui percorsi cellulari ospitanti. la ricerca molto limitata...

Coxiella burnetii è un patogeno intracellulare unico che provoca la febbre Q infezione umana zoonotici. Questa malattia è associata con un ampio spettro di manifestazioni cliniche che si estendono dalla sieroconversione asintomatica a infezione cronica pericolosa per la vita, che spesso si manifesta come anni endocardite dopo l&#39;esposizione 1. L&#39;infezione umana avviene principalmente attraverso l&#39;inalazione di aerosol contaminati con ruminanti il ​​principale serbatoio di infezione, in particolare, vacche da latte, pecore e capre. Anche se l&#39;infezione Coxiella in questi animali è in genere subclinica, l&#39;infezione può innescare l&#39;aborto e la notevole carica batterica all&#39;interno del fluido parto e la placenta può contaminare l&#39;ambiente locale 1. Un esempio di enorme peso tale contaminazione può avere sia la salute pubblica e il settore agricolo è stato recentemente osservato nel focolaio febbre Q che si è verificato nei Paesi Bassi 2. Tra il 2007 eIl 2010, oltre 4.000 casi umani di febbre Q sono stati diagnosticati e questa epidemia era legata alla contaminazione significativa delle aziende agricole di capra 3. Inoltre, Coxiella è un potenziale arma biologica, come classificati dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie, a causa della stabilità ambientale dei batteri e bassa dose infettante necessaria per causare grave morbilità e mortalità 4. Coxiella esiste in due fasi: Fase I microrganismi, isolati da fonti naturali, sono estremamente virulenti e organismi di fase II sono molto attenuate in vivo. Ad esempio, dopo diversi passaggi in vitro degli organismi Coxiella burnetii Nine Mile Fase I, Fase II, i batteri sono stati prodotti che contengono una delezione cromosomica irreversibile conseguente lipopolisaccaride tronco (LPS) 5. Questo ceppo, C. burnetii NMII, è fenotipicamente simile alla Fase I in modelli di coltura di tessuti e fornisce una modalità più sicural per i ricercatori di studiare Coxiella patogenesi nei laboratori 5. Negli ultimi anni molti passi avanti sono rapidamente avanzato il campo della genetica Coxiella. Più in particolare, lo sviluppo dei mezzi di comunicazione axeniche (acidificato medio cisteina citrato - ACCM-2) ha permesso la crescita privo di cellule di Coxiella sia liquido e su supporti solidi 6,7. Ciò ha determinato miglioramenti diretti di strumenti genetici disponibili per Coxiella tra cui un sistema di espressione del gene inducibile, vettori navetta e sistemi di trasposoni casuali 8-11. Più di recente, sono stati sviluppati due metodi per l&#39;inattivazione genica mirata, aprendo la strada per l&#39;esame specifico di virulenza geni candidati 12. A seguito di interiorizzazione da parte dei macrofagi alveolari, Coxiella replica ai numeri elevati all&#39;interno di un vano di membrana definito il Coxiella- contenente vacuolo (CCV). Il CCV richiede traffico endocitico ospite esimogrezzi precoce e tardiva endosomi fino a quando non matura in un organello lisosoma di derivazione 13. In tutto questo processo, il CCV acquisisce fattori dell&#39;ospite che o appaiono transitoriamente o rimanere connessi con il vacuolo, compresi, ma non limitatamente a, Rab5, Rab7, CD63 e LAMP-gennaio 13-15. La replica di Coxiella all&#39;interno di cellule ospiti è interamente dipendente da un Dot / Icm Tipo IVB secrezione sistema completamente funzionante (T4SS) 8,16,17. Questo sistema di secrezione è una struttura multi-proteina ancestrally relative ai sistemi di coniugazione e si estende su entrambi membrane batteriche e vacuolari per fornire proteine ​​batteriche, definito effettori, nel citoplasma ospitante 18. Il Coxiella T4SS è funzionalmente molto simile al ben caratterizzato tipo IVB Dot / Icm secrezione Sistema di Legionella pneumophila 19,20. È interessante notare che l&#39;attivazione del T4SS e successiva effettore traslocazione avviene solo Coxiella raggiunge l&#39;acido lisosoma derivatoorganello, circa 8 ore dopo l&#39;infezione 17,21. Ad oggi, più di 130 effettori Dot / ICM sono stati identificati 9,17,22-24. Molti di questi effettori probabilmente svolgono un ruolo importante durante la replica di Coxiella all&#39;interno di cellule ospiti; tuttavia, solo pochi effettori sono stati funzionalmente caratterizzata 25-29. In questo studio utilizziamo un saggio di traslocazione di fluorescenza base che si basa sulla scissione del substrato CCF2-AM FRET (di seguito denominato il substrato blam) attraverso attività di β-lattamasi all&#39;interno del citoplasma della cellula ospite (Figura 1). Il gene di interesse è fuso TEM-1 β-lattamasi (blam) su un plasmide giornalista che fornisce espressione costitutiva. Il substrato BLAM è composto da due fluorofori (cumarina e fluoresceina) che formano una coppia FRET. Eccitazione dei risultati cumarinici in FRET della fluoresceina e l&#39;emissione di fluorescenza verde in assenza di effettore traslocazione; Tuttavia, se il BlaM-effector proteina di fusione viene traslocato nel citoplasma ospite, la risultante β-lattamasi attività fende l&#39;anello β-lattamici del substrato Blam, che separa la coppia FRET produrre blu emissione di fluorescenza a seguito di eccitazione. Questo test traslocazione è stato ben dimostrato come un approccio per identificare le proteine ​​effettrici da una gamma di diversi batteri intracellulari ed extracellulari, tra cui C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogena E. coli, Salmonella e Brucella 17,30-35. Per determinare il ruolo dei fattori di accoglienza specifici su Coxiella effettrici traslocazione utilizziamo un metodo consolidato per silenziamento gene noto come interferenza dell&#39;RNA, in particolare piccoli RNA interferenti (siRNA). Originariamente identificato nel Caenorhabditis elegans, interferenza dell&#39;RNA è un processo cellulare endogena conservato utilizzato per defe innataNSE contro i virus così come gene regolamentazione 36,37. Dopo il legame di specifiche sequenze siRNA, degradazione del mRNA avviene attraverso RISC (RNA-indotta complesso tacere) con conseguente specifico silenziamento genico o atterramento 38. In questo studio, siRNA è stato utilizzato per indirizzare due proteine ​​ospitanti, Rab5A e Rab7A, che sono importanti regolatori della via endocitico. L&#39;impatto di tacere Rab5A e Rab7A su effettori traslocazione è stata determinata mediante C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 è stato scelto in quanto è stato precedentemente dimostrato di essere traslocata dal sistema di secrezione Dot / Icm di Coxiella 17. Utilizzando sia siRNA silenziamento genico e il saggio di traslocazione fluorescencebased descritto qui, stiamo cominciando a definire un ruolo per fattori di accoglienza nella traslocazione di proteine ​​effettrici da Coxiella. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di entrambi batteri intracellulari ed extracellulari che possiedono secretio similesistemi n responsabili della traslocazione di proteine ​​effettrici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Reagents</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Citric acid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0759</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S4641</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Potassium phosphate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60218</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">442611</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5080</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Iron sulfate</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S93248</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9625</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6852</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bacto-neopeptone</td>
			<td style="width:87px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">211681</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1424</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Methyl beta cyclodextrin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4555</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">RPMI + Glutamax</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378</td>
			<td style="width:211px;">For bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">D-001810-10-05</td>
			<td style="width:211px;">Non-targeting control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-003290-01-005</td>
			<td style="width:211px;">Causes cell death; measure of transfection efficiency</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-004009-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-010388-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">5X siRNA buffer</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:211px;">Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">T-2001-01</td>
			<td style="width:211px;">For transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Opti-MEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td style="width:211px;">Reduced-serum medium used for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">DMEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10567-014</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DMSO</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:211px;">For storage of Coxiella strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PBS</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">0.05% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">dH2O</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For dilution of samples and standards for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Quick-gDNA Mini Prep</td>
			<td style="width:87px;">ZYMO Research</td>
			<td style="width:119px;">D3007</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product to extract gDNA</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td>
			<td style="width:87px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-98020</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:343px;">LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K1032</td>
			<td style="width:211px;">For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106469</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71505</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium hydrogen orthophosphate</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106586</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Probenicid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62251</td>
			<td style="width:211px;">Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:211px;">Fixing solution for HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">25cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430639</td>
			<td style="width:211px;">For growth of bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">75cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430641</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">175cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431080</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Haemocytometer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For quantification of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tear-A-Way 96 Well PCR plates</td>
			<td style="width:87px;">4titude</td>
			<td style="width:119px;">4ti-0750/TA</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">8-Lid chain, flat</td>
			<td style="width:87px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">65.989.002</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top microfuge</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top vortex</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Orbital mixer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:211px;">For pelleting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">Mx3005P QPCR machine</td>
			<td style="width:87px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">401456</td>
			<td style="width:211px;">For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">ClarioSTAR microplate reader</td>
			<td style="width:87px;">BMG LabTech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For measurement of fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing

Coxiella burnetii, l&#39;agente eziologico della febbre Q, è un patogeno intracellulare che si basa su un tipo IV Dot / Icm secrezione di sistema per stabilire una nicchia replicativa. Una coorte di effettori sono traslocato attraverso questo sistema nella cellula ospite per manipolare i processi di accoglienza e consentire la creazione di un vacuolo lisosoma di derivazione unica per la replica. Il metodo qui presentato comporta la combinazione di due tecniche ben consolidate: specifica silenziamento genico con siRNA e misura di traslocazione effettore utilizzando un substrato FRET-based che si basa sull&#39;attività β-lattamasi. L&#39;applicazione di questi due approcci, possiamo cominciare a comprendere il ruolo dei fattori di accoglienza in batterico funzione del sistema di secrezione e traslocazione effettrici. In questo studio abbiamo esaminato il ruolo di Rab5A e Rab7A, entrambi importanti regolatori del percorso traffico endocitico. Abbiamo dimostrato che il silenziamento dell&#39;espressione di una proteina risultati in una diminuzione della effettori translocatioefficienza n. Questi metodi possono essere facilmente modificati per esaminare altri agenti patogeni intracellulari ed extracellulari che utilizzano anche sistemi di secrezione. In questo modo, un quadro globale dei fattori di accoglienza che partecipano batterica traslocazione effettrici può essere rivelata.

Per questo studio, la C. burnetii pBlaM-CBU0077 ceppo è stato selezionato come CBU0077 è stato precedentemente dimostrato di essere un effettore traslocato del sistema di secrezione coxiella Dot / Icm 17. Prima di infezione, il numero totale dei genomi / ml in i sette giorni d&#39;C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 è stato enumerato utilizzando qPCR. La figura 4 dimostra un esempio della soglia di ciclo valori (Ct) attesi ...

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Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Indagare le interazioni tra batteri patogeni ei loro ospiti è un&#39;area importante della ricerca biologica. Qui, descriviamo le tecniche necessarie per misurare effettrici traslocazione da Coxiella burnetii durante siRNA silenziamento genico mediante substrato Blam.

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Rilevamento di Traslocazione tossina nel citosol Host Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In vitro per valutare l&#39;impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

L&#39;applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analisi di<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...