Name: applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

Merk: Alle prosedyrer som involverer vekst eller manipulering av Coxiella burnetii RSA439 NMII bør utføres i en fysisk Containment Nivå 2 Laboratory og innenfor en biologisk sikkerhetskabinett i samsvar med lokale retningslinjer. Et skjematisk diagram av den reverserte transfeksjon og trans assay arbeidsflyten beskrevet nedenfor, er vist i figur 2. 1. Fremstilling av C. burnetii Kultur Uttrykke CBU0077 Fused p-laktamase (pBlaM-CBU0077) (DAG 1) <ol><li>...

Sekresjon systemer, og de bakterielle effektor proteiner disse systemene transport inn i cytoplasma av vertsceller, er en viktig virulens komponent som mange patogene bakterier benytter for å etablere en infeksjon i unike replikative nisjer. Fokus for mange forskningsgrupper har vært å undersøke samspillet mellom bakterielle effektorer og verts proteiner og innflytelsen disse effektorer har på vertscelle veier. Meget begrenset forskning, om noen, har undersøkt muligheten for vertsproteiner for å være nødvendig ...

Coxiella burnetii er en unik intracellulær patogen som forårsaker zoonotiske menneske-smitte Q-feber. Denne sykdommen er assosiert med et vidt spektrum av kliniske presentasjoner som strekker seg fra asymptomatisk serokonversjon til livstruende kronisk infeksjon som ofte manifesterer seg som endokarditt år etter eksponering 1. Humant infeksjon skjer først og fremst ved inhalering av aerosoler forurenset med drøvtyggere den store reservoar for infeksjon, spesielt melkekyr, sauer og geiter. Selv Coxiella infeksjon i disse dyrene er vanligvis subklinisk, kan infeksjonen utløse abort og betydelig bakteriemengden i birthing væske og morkaken kan forurense nærmiljøet en. Et eksempel på den enorme byrden slik forurensning kan ha på både folkehelsen og landbruket ble nylig observert i Q-feber utbrudd som skjedde i Nederland to. Mellom 2007 og2010 ble over 4000 menneskelige tilfeller av Q-feber diagnostisert og dette utbruddet var knyttet til betydelig forurensning av geit gårder 3. I tillegg er Coxiella en potensiell biologisk våpen, som klassifisert av US Centers for Disease Control and Prevention, på grunn av de miljømessige stabiliteten av bakterier og lav smittedose er nødvendig for å forårsake alvorlig sykdom og død fire. Coxiella finnes i to faser: Fase I organismer, isolert fra naturlige kilder, er svært virulente og fase II organismer er sterkt svekket in vivo. For eksempel, etter flere in vitro passasjer av Coxiella burnetii Nine Mile Fase I organismer, ble Fase II bakterier produsert som inneholder en irreversibel kromosom sletting resulterer i forkortet lipopolysakkarid (LPS) 5. Denne belastningen, C. burnetii NMII, er fenotypisk lik fase I i vevskultur modeller og gir et sikrere modusl for forskere å studere Coxiella patogenesen i laboratorier 5. I de senere årene har flere gjennombrudd har raskt avanserte innen Coxiella genetikk. Mest spesielt utviklingen av axenic media (surgjort sitrat cystein medium - ACCM-2) har tillatt den cellefrie vekst av Coxiella både i flytende og på faste medier 6,7. Dette resulterte i direkte forbedringer av genetiske verktøy tilgjengelig for Coxiella inkludert en induserbar genuttrykksystem transporttjenester vektorer og tilfeldige transposon systemer 8-11. Nå nylig, har to metoder for målrettet genet inaktive også blitt utviklet, banet vei for å undersøke spesifikke virulens gen kandidater 12. Etter internalisering av alveolære makrofager, Coxiella replikerer til høye tall innenfor et membranbundet rommet kalt Coxiella- inneholder vakuole (CCV). CCV krever verts endocytic menneskehandel thgrove tidlige og sene endosomer før den modnes inn i en lysosome-avledet organ 13. Gjennom hele denne prosessen, kjøper CCV vertsfaktorer som enten vises forbigående eller forbli knyttet til vakuole, inkludert, men ikke begrenset til, Rab5, Rab7, CD63 og LAMP-13 til 15 januar. Replikering av Coxiella innenfor vertsceller er helt avhengig av et fullt funksjonelt Dot / Icm Type IVB Sekresjon System (T4SS) 8,16,17. Dette sekret system er et multi-proteinstruktur slektsmessig relatert til konjugering systemer og strekker seg over både bakterielle og vacuolar membraner for å levere bakterielle proteiner, betegnet effektorer, i verten cytoplasma 18. Den Coxiella T4SS er funksjonelt svært lik den godt karakterisert Type IVB Dot / Icm Sekresjon System of Legionella pneumophila 19,20. Interessant, aktivering av T4SS og påfølgende effektor trans ikke skje før Coxiella når den sure lysosomet-avlededeorganelle, ca 8 timer etter infeksjon 17,21. Hittil har over 130 Dot / ICM effektorer blitt identifisert 9,17,22-24. Mange av disse effektorer sannsynlig spiller viktige roller under replikering av Coxiella innenfor vertsceller; men har bare noen få effektorer blitt funksjonelt preget 25-29. I denne studien benytter vi en fluorescens-basert assay translokasjon som er avhengig av spalting av CCF2-AM FRET substrat (heretter referert til som BLAM substrat) via β-laktamase-aktivitet i vertscellen cytoplasma (figur 1). Genet av interesse fusjonert til TEM-1 β-laktamase (BLAM) på en reporter plasmid som gir konstitutiv ekspresjon. Den BLAM substratet er sammensatt av to fluoroforer (kumarin og fluorescein) som danner et FRET par. Eksitasjon av kumarin resulterer i FRET av fluorescein og grønne fluorescensemisjonen i fravær av effektoren translokasjon; Hvis imidlertid BlaM-effektor-fusjonsprotein blir translokert inn i verts cytoplasma, den resulterende β-laktamase-aktivitet spalter β-laktam-ring av BLAM substratet, separering av FRET paret fremstilling blå fluorescens-emisjon etter eksitasjon. Denne trans analysen har blitt godt dokumentert som en tilnærming for å identifisere effektor proteiner fra en rekke forskjellige intracellulære og ekstracellulære bakterier, inklusive C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogen E. coli, Salmonella og Brucella 17,30-35. For å finne ut hvilken rolle spesifikke vertsfaktorer på Coxiella effektor trans vi benytter en veletablert metode for genet Slå kjent som RNA-interferens, særlig små interfererende RNA (siRNA). Opprinnelig identifisert i Caenorhabditis elegans, er RNA interferens en konservert endogen cellulær prosess som brukes for medfødt defense mot virus, så vel som genregulering 36,37. Etter binding av sekvens-spesifikk siRNA, degradering av mRNA skjer gjennom RISC (RNA-induced Slå kompleks) som resulterer i spesifikke genet Slå eller knockdown 38. I denne studien ble siRNA brukes til å målrette to verts proteiner, Rab5A og Rab7A, som er viktige regulatorer av endocytoseveien. Virkningen av stanse Rab5A og Rab7A på effektor trans ble konstatert ved hjelp av C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 ble valgt som det var tidligere vist seg å være translocated av Dot / Icm sekresjon system av Coxiella 17. Utnytte både siRNA genet Slå og fluorescencebased trans analysen beskrevet her, er vi i ferd med å etablere en rolle for vertsfaktorer i trans av effektor proteiner ved Coxiella. Denne tilnærmingen kan brukes på et stort utvalg av både intracellulære og ekstracellulære bakterier som innehar lignende secretion-systemer som er ansvarlig for translokasjon av effektor proteiner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Reagents</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Citric acid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0759</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S4641</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Potassium phosphate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60218</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">442611</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5080</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Iron sulfate</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S93248</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9625</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6852</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bacto-neopeptone</td>
			<td style="width:87px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">211681</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1424</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Methyl beta cyclodextrin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4555</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">RPMI + Glutamax</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378</td>
			<td style="width:211px;">For bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">D-001810-10-05</td>
			<td style="width:211px;">Non-targeting control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-003290-01-005</td>
			<td style="width:211px;">Causes cell death; measure of transfection efficiency</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-004009-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-010388-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">5X siRNA buffer</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:211px;">Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">T-2001-01</td>
			<td style="width:211px;">For transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Opti-MEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td style="width:211px;">Reduced-serum medium used for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">DMEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10567-014</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DMSO</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:211px;">For storage of Coxiella strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PBS</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">0.05% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">dH2O</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For dilution of samples and standards for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Quick-gDNA Mini Prep</td>
			<td style="width:87px;">ZYMO Research</td>
			<td style="width:119px;">D3007</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product to extract gDNA</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td>
			<td style="width:87px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-98020</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:343px;">LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K1032</td>
			<td style="width:211px;">For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106469</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71505</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium hydrogen orthophosphate</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106586</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Probenicid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62251</td>
			<td style="width:211px;">Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:211px;">Fixing solution for HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">25cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430639</td>
			<td style="width:211px;">For growth of bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">75cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430641</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">175cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431080</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Haemocytometer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For quantification of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tear-A-Way 96 Well PCR plates</td>
			<td style="width:87px;">4titude</td>
			<td style="width:119px;">4ti-0750/TA</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">8-Lid chain, flat</td>
			<td style="width:87px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">65.989.002</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top microfuge</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top vortex</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Orbital mixer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:211px;">For pelleting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">Mx3005P QPCR machine</td>
			<td style="width:87px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">401456</td>
			<td style="width:211px;">For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">ClarioSTAR microplate reader</td>
			<td style="width:87px;">BMG LabTech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For measurement of fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing

Coxiella burnetii, den utløsende agent for Q-feber er en intracellulær patogen som er avhengig av en type IV Dot / Icm Sekresjon System for å etablere en replicative nisje. En kohort av effektorer er translokaliseres gjennom dette systemet inn i vertscellen for å manipulere vertsprosesser, og tillate etablering av en unik lysosom-avledet vacuole for replikasjon. Metoden som presenteres her omfatter en kombinasjon av to godt etablerte teknikker: spesifikk genet Slå ved hjelp av siRNA og måling av effektoren translokasjon ved å bruke et FRET-basert substrat som er avhengig av β-laktamase-aktivitet. Bruk av disse to tilnærmingene, kan vi begynne å forstå hvilken rolle vertsfaktorer i bakterie sekresjon systemets funksjon og effektor trans. I denne studien undersøkte vi hvilken rolle Rab5A og Rab7A, både viktige regulatorer av endocytic menneskehandel veien. Vi viser at stanse ekspresjonen av enten protein resulterer i en reduksjon i effektor translocation effektivitet. Disse metodene kan enkelt endres til å undersøke andre intracellulære og ekstracellulære patogener som også utnytter sekresjon systemer. På denne måte kan et globalt bilde av vertsfaktorer som er involvert i bakteriell translokasjon effektor bli avslørt.

For denne studien, C. burnetii pBlaM-CBU0077 stamme ble valgt som CBU0077 tidligere er blitt vist å være en translokert effektor av Coxiella Dot / Icm sekresjon system 17. Før infeksjon, det totale antall genom / ml i syv dagers C. burnetii pBlaM-CBU0077 kulturen ble nummerert ved hjelp av qPCR. Figur 4 viser et eksempel av syklusen terskel (Ct-verdier) forventet fra begge standarder og prøver etter qPCR. De Ct verdier (represent...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Gransker samspillet mellom bakterielle patogener og deres verter er et viktig område for biologisk forskning. Her beskriver vi de nødvendige teknikker for å måle effektor trans av Coxiella burnetii under siRNA genet Slå hjelp Blam underlaget.

Bruk av Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) for å undersøke Effector Trans Effektivitet av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA lyddemping

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Påvisning av giftstoffer translokasjon i Host cytosol ved Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overvinne manglende respons i Eksperimentelle Autoimmune encefalomyelitt (EAE) Resistente musestammer av adoptivforeldre Transfer og antigen Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro analysen å evaluere virkningen av immunoregulatory Pathways på HIV-spesifikke CD4 T Cell effektorfunksjon

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induksjon av murine tarmbetennelse etter adoptiv overføring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høy</sup&gt; T-celler i immundefekte mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Påføre en induserbar Expression System for å studere forstyrrelser av bakteriell virulensfaktorer med intracellulære signal

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse av<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translokasjon i vertsceller Bruke Beta-laktamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Måling Phagosome pH ved Proporsjonellekspansjon Fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvikling av lyofilisert Loop-mediert Isotermiske amplifiseringsreagenser for deteksjon av<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Metode for å vurdere funksjoner Fc-mediert effektor av influensa Hemagglutinin spesifikke antistoffer

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...