Name: applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

Nota: Todos los procedimientos que implican el crecimiento o la manipulación de Coxiella burnetii en RSA439 NMII deben llevarse a cabo en un Contención Nivel Físico 2 Laboratorio y dentro de una cabina de seguridad biológica en el cumplimiento de las directrices locales. Un diagrama esquemático del flujo de trabajo de la transfección y el ensayo de translocación inversa se ​​describe a continuación se muestra en la Figura 2. 1. Preparación de C. burne...

sistemas de secreción, y las proteínas efectoras bacterianas estos sistemas de transporte en el citoplasma de células huésped, son un importante componente de la virulencia que muchas bacterias patógenas utilizan para establecer una infección dentro de nichos replicativos únicas. El foco de muchos grupos de investigación ha sido investigar la interacción entre los efectores bacterianos y las proteínas del huésped y la influencia que estos tienen efectores en las vías celulares del huésped. investigación mu...

Coxiella burnetii es un patógeno intracelular único que causa la fiebre Q infección humana zoonótica. Esta enfermedad está asociada con un amplio espectro de manifestaciones clínicas que se extienden desde la seroconversión asintomática a la infección crónica que amenaza la vida que a menudo se manifiesta como endocarditis años después de la exposición 1. La infección humana se produce principalmente a través de la inhalación de aerosoles contaminados con rumiantes el principal reservorio de la infección, en particular, las vacas lecheras, ovejas y cabras. Aunque la infección por Coxiella en estos animales suele ser subclínica, la infección puede desencadenar aborto y la carga bacteriana considerable dentro del fluido de parto y la placenta puede contaminar el medio ambiente local 1. Un ejemplo de la enorme carga de dicha contaminación puede tener sobre la salud pública y la industria de la agricultura se observó recientemente en el brote de fiebre Q que se produjo en los Países Bajos 2. Entre 2007 y2010, más de 4.000 casos humanos de fiebre Q fueron diagnosticados y este brote se vinculó a la contaminación significativa de granjas de cabras 3. Además, Coxiella es un arma biológica potencial, según la clasificación de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, debido a la estabilidad ambiental de las bacterias y de baja dosis infecciosa necesaria para causar morbilidad y mortalidad 4 grave. Coxiella existe en dos fases: Fase I organismos, aislados de fuentes naturales, son extremadamente virulenta y Fase II son organismos altamente atenuados in vivo. Por ejemplo, después de varios pasajes en vitro de Coxiella burnetii Nine Mile Fase I organismos, se producen las bacterias de fase II que contiene una deleción cromosómica irreversible que resulta en lipopolisacárido truncada (LPS) 5. Esta cepa, C. burnetii NMII, es fenotípicamente similar a la Fase I en modelos de cultivo de tejidos y proporciona un modo más segurol para los investigadores estudiar la patogénesis Coxiella en laboratorios 5. En los últimos años varios avances han avanzado rápidamente en el campo de la genética Coxiella. En particular, el desarrollo de los medios axénicos (acidifica medio cisteína citrato - ACCM-2) ha permitido el crecimiento de células libres de Coxiella en tanto líquidos como sólidos en medios de 6,7. Esto dio lugar a mejoras directas de herramientas genéticas disponibles para Coxiella incluyendo un sistema de expresión génica inducible, vectores lanzadera y sistemas de transposón azar 8-11. Más recientemente, dos métodos para la inactivación génica dirigida también se han desarrollado, allanando el camino para el examen de los candidatos de genes de virulencia específicos 12. Después de la internalización por los macrófagos alveolares, Coxiella replica en un número elevado dentro de un compartimiento unido a la membrana denominado el Coxiella- contiene vacuolas (CCV). El CCV requiere el tráfico endocítica anfitrión THendosomas tempranos y tardíos en bruto hasta que madura en un orgánulo lisosoma derivados 13. A lo largo de este proceso, el CCV adquiere factores del huésped que, o bien aparecen de forma transitoria o permanecen asociados con la vacuola, incluyendo, pero no limitado a, Rab5, Rab7, CD63 y el indicador LAMP-1 13-15. La replicación de Coxiella dentro de las células huésped es totalmente dependiente de un tipo de sistema completamente funcional Dot / ICM IVB secreción (T4SS) 8,16,17. Este sistema de secreción es una estructura multi-proteína ancestralmente relacionada con los sistemas de conjugación y se extiende por ambas membranas bacterianas y vacuolar para entregar proteínas bacterianas, denominado efectores, en el citoplasma de acogida 18. El Coxiella T4SS es funcionalmente muy similar a la del sistema de secreción bien caracterizado Tipo IVB Dot / Icm de Legionella pneumophila 19,20. Curiosamente, la activación de la translocación efector T4SS y posterior no se produce hasta Coxiella alcanza el lisosoma derivado de ácidoorgánulo, aproximadamente 8 horas después de la infección 17,21. Hasta la fecha, más de 130 efectores Dot / ICM se han identificado 9,17,22-24. Muchos de estos efectores probablemente juegan un papel importante durante la replicación de Coxiella dentro de las células huésped; Sin embargo, sólo unos pocos efectores se han caracterizado funcionalmente 25-29. En este estudio utilizamos un ensayo de translocación basado en la fluorescencia que se basa en la escisión del sustrato CCF2-AM FRET (en lo sucesivo, el sustrato BlaM) a través de la actividad de β-lactamasa en el citoplasma de la célula huésped (Figura 1). El gen de interés se fusiona con TEM-1 β-lactamasa (BlaM) en un plásmido reportero que proporciona la expresión constitutiva. El sustrato BlaM se compone de dos fluoróforos (cumarina y fluoresceína) que forman un par de FRET. La excitación de los resultados de la cumarina en FRET de la fluoresceína y la emisión de fluorescencia verde en la ausencia de la translocación efector; sin embargo, si el Blaproteína de fusión M-efector se transloca al citoplasma de acogida, la resultante β-lactamasa escinde actividad del anillo β-lactámico del sustrato Blam, la separación de la producción de la emisión de fluorescencia azul después de la excitación par de FRET. Este ensayo de translocación se ha probado como un enfoque para identificar las proteínas efectoras de una gama de diferentes bacterias intracelulares y extracelulares, incluyendo C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, E. enteropatógena coli, Salmonella y Brucella 17,30-35. Para determinar el papel de los factores del huésped específicas sobre Coxiella translocación efector utilizamos un método bien establecido para el silenciamiento de genes conocido como interferencia de ARN, en particular los pequeños ARN de interferencia (siRNA). Originalmente identificado en Caenorhabditis elegans, la interferencia de ARN es un proceso celular endógeno conservada utilizado para DEFE innataNSE contra los virus, así como la regulación de genes 36,37. Después de la unión de la secuencia específica de siRNA, la degradación de mRNA se produce a través de RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) que resulta en el silenciamiento de genes específico o desmontables 38. En este estudio, siRNA se utiliza para apuntar dos proteínas del huésped, y Rab5a Rab7A, que son importantes reguladores de la vía endocítica. El impacto de silenciar Rab5a y Rab7A sobre la traslocación efector se determinó usando C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 fue seleccionado como se ha demostrado previamente para ser trasladadas por el sistema de secreción Dot / ICM de Coxiella 17. Utilizando tanto siRNA silenciamiento de los genes y el ensayo de translocación fluorescencebased descrito aquí, estamos empezando a establecer una función de los factores del huésped en la translocación de las proteínas efectoras por Coxiella. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de bacterias intracelulares y extracelulares que poseen secretio similaresn sistemas responsables de la translocación de las proteínas efectoras.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Reagents</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Citric acid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0759</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S4641</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Potassium phosphate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60218</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">442611</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5080</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Iron sulfate</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S93248</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9625</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6852</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bacto-neopeptone</td>
			<td style="width:87px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">211681</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1424</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Methyl beta cyclodextrin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4555</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">RPMI + Glutamax</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378</td>
			<td style="width:211px;">For bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">D-001810-10-05</td>
			<td style="width:211px;">Non-targeting control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-003290-01-005</td>
			<td style="width:211px;">Causes cell death; measure of transfection efficiency</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-004009-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-010388-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">5X siRNA buffer</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:211px;">Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">T-2001-01</td>
			<td style="width:211px;">For transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Opti-MEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td style="width:211px;">Reduced-serum medium used for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">DMEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10567-014</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DMSO</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:211px;">For storage of Coxiella strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PBS</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">0.05% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">dH2O</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For dilution of samples and standards for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Quick-gDNA Mini Prep</td>
			<td style="width:87px;">ZYMO Research</td>
			<td style="width:119px;">D3007</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product to extract gDNA</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td>
			<td style="width:87px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-98020</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:343px;">LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K1032</td>
			<td style="width:211px;">For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106469</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71505</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium hydrogen orthophosphate</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106586</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Probenicid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62251</td>
			<td style="width:211px;">Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:211px;">Fixing solution for HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">25cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430639</td>
			<td style="width:211px;">For growth of bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">75cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430641</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">175cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431080</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Haemocytometer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For quantification of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tear-A-Way 96 Well PCR plates</td>
			<td style="width:87px;">4titude</td>
			<td style="width:119px;">4ti-0750/TA</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">8-Lid chain, flat</td>
			<td style="width:87px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">65.989.002</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top microfuge</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top vortex</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Orbital mixer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:211px;">For pelleting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">Mx3005P QPCR machine</td>
			<td style="width:87px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">401456</td>
			<td style="width:211px;">For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">ClarioSTAR microplate reader</td>
			<td style="width:87px;">BMG LabTech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For measurement of fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing

Coxiella burnetii, el agente causante de la fiebre Q, es un patógeno intracelular que se basa en un punto IV / ICM sistema de secreción tipo para establecer un nicho replicativo. Una cohorte de efectores se translocan a través de este sistema en la célula huésped a manipular los procesos de acogida y permitir el establecimiento de una vacuola lisosoma derivado único para la replicación. El método que aquí se presenta implica la combinación de dos técnicas bien establecidas: el silenciamiento de genes específico utilizando siRNA y la medición de la translocación efector utilizando un sustrato a base de FRET que se basa en la actividad β-lactamasa. La aplicación de estos dos enfoques, podemos empezar a entender el papel de los factores del huésped en la función del sistema de secreción bacteriana y translocación efector. En este estudio se examinó el papel de Rab5a y Rab7A, ambos importantes reguladores del tráfico de la vía endocítica. Demostramos que el silenciamiento de la expresión de cualquiera de los resultados de proteínas en una disminución de la translocatio efectorn eficiencia. Estos métodos pueden ser fácilmente modificados para examinar otros patógenos intracelulares y extracelulares que también utilizan sistemas de secreción. De esta manera, una visión global de los factores del huésped implicados en la translocación bacteriana efector puede ser revelada.

Para este estudio, la C. Se seleccionó la cepa burnetii pBlaM-CBU0077 como CBU0077 se ha demostrado previamente para ser un efector translocado del sistema de secreción de Coxiella Dot / ICM 17. Antes de la infección, el número total de genomas / ml en los siete día C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 se enumeró utilizando qPCR. La figura 4 muestra un ejemplo del ciclo umbral valores (Ct) que se espera de ambos ...

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Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

La investigación de las interacciones entre los patógenos bacterianos y sus anfitriones es un área importante de la investigación biológica. A continuación, describimos las técnicas necesarias para medir la translocación efector por Coxiella burnetii durante siRNA silenciamiento de genes utilizando sustrato Blam.

La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Durante siRNA silenciamiento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

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Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

La detección de la translocación de la toxina en el citosol de host de resonancia de plasmones superficiales

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Investigación

Inmunología e Infección

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...