Name: applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

Obs: Alla förfaranden som omfattar tillväxt eller manipulation av Coxiella burnetii RSA439 NMII bör utföras i en fysisk skyddsnivå 2 Laboratory och inom ett biologiskt säkerhetsskåp i enlighet med lokala riktlinjer. Ett schematiskt diagram av den omvända transfektion och translokation assay arbetsflöde som beskrivs nedan visas i fig 2. 1. Framställning av C. burnetii Culture Att uttrycka CBU0077 Fused till p-laktamas (pBlaM-CBU0077) (DAG 1) <ol>...

Sekretionssystem, och bakterie effektorproteiner dessa transportsystem i cytoplasman i värdceller, är en viktig virulens komponent som många patogena bakterier använder för att etablera en infektion inom unika replikativa nischer. Fokus för många forskargrupper har varit att undersöka samspelet mellan bakterieeffektenheter och värdproteiner och påverkar dessa effektenheter har på värd cellulära vägar. Mycket begränsad forskning, om någon, har undersökt möjligheten för värdproteiner vara nödvändigt ...

Coxiella burnetii är en unik intracellulär patogen som orsakar zoonotiska mänsklig infektion Q-feber. Denna sjukdom är förknippad med ett brett spektrum av kliniska presentationer som sträcker sig från asymtomatisk serokonversion till livshotande kronisk infektion som ofta manifesteras som endokardit år efter exponering 1. Mänsklig infektion sker främst genom inandning av kontaminerade aerosoler med idisslare huvud reservoar för infektion, i synnerhet mjölkkor, får och getter. Även Coxiella infektion i dessa djur är vanligtvis subklinisk, kan infektionen leda abort och betydande bakteriehalten i förlossningsvätskan och moderkakan kan förorena den lokala miljön en. Ett exempel på den enorma börda sådan förorening kan ha på både folkhälsan och jordbruksindustrin har nyligen observerats i Q-feber utbrott som inträffade i Nederländerna 2. Mellan 2007 och2010, över 4000 mänskliga fall av Q-feber diagnostiserades och detta utbrott var kopplat till betydande förorening av getgårdar 3. Dessutom är Coxiella en potentiell biologiskt vapen, enligt klassificeringen av de amerikanska Centers for Disease Control and Prevention, på grund av miljö stabiliteten hos bakterier och låg smitt dos som krävs för att orsaka allvarlig sjuklighet och dödlighet 4. Coxiella förekommer i två faser: Fas I organismer, isolerade från naturliga källor, är extremt virulent och fas II organismer är mycket försvagade in vivo. Till exempel, efter flera in vitro-passager av Coxiella burnetii Nine Mile fas I organismer har fas II bakterier produceras som innehåller en irreversibel kromosom deletion resulterar i stympad lipopolysackarid (LPS) 5. Denna stam, C. burnetii NMII är fenotypiskt liknar fas I i vävnadskulturmodeller och ger en säkrare lägel för forskare att studera Coxiella patogenes i laboratorier 5. Under senare år har flera genombrott har snabbt avancerat inom Coxiella genetik. Framför allt utvecklingen av axenisk media (surgjord citrat cystein medel - ACCM-2) har gjort det cellfria tillväxt Coxiella i både flytande och fasta medier 6,7. Detta resulterade i direkta förbättringar av genetiska verktyg för Coxiella inklusive en inducerbar genuttryck systemet, skyttelvektorer och slumpmässiga transposonmutanter system 8-11. Senast har två metoder för riktad gen inaktive också tagits fram, vilket banar väg för att undersöka specifika virulensgen kandidater 12. Efter internalisering av alveolära makrofager, replikerar Coxiella höga siffror inom en membranbundna fack kallas Coxiella- innehållande vakuolen (CCV). CCV kräver värd endocytiska handel thgrov tidiga och sena endosomer tills den mognar till en lysosom härrörande organell 13. Under hela denna process, CCV förvärvar värdfaktorer som antingen visas övergående eller förbli associerade med vakuolen, inklusive, men inte begränsat till, Rab5, Rab7, CD63 och LAMP-13-15 januari. Replikering av Coxiella inom värdceller är helt beroende av en fullt fungerande Dot / Icm typ IVB sekretionssystemet (T4SS) 8,16,17. Denna sekretionssystemet är en multi-proteinstruktur ancestrally relaterade till konjugering system och sträcker sig över båda bakteriella och vakuolära membran för att leverera bakteriella proteiner, benämnda effektorer, in i värd cytoplasman 18. Den Coxiella T4SS är funktionellt mycket lik den väl karakteriserade typ IVB Dot / Icm Sekretion System of Legionella pneumophila 19,20. Intressant, inte aktivering av T4SS och efterföljande effektor translokation inte ske förrän Coxiella når den sura lysosom-härleddaorganell, ungefär 8 h efter infektion 17,21. Hittills har mer än 130 punkter / Icm effektenheter identifierats 9,17,22-24. Många av dessa effektenheter spelar troligen en viktig roll vid replikering av Coxiella inom värdceller; har dock endast ett fåtal effektorer funktionellt karaktäriseras 25-29. I denna studie använder vi en fluorescensbaserad sloka analys som förlitar sig på klyvning av CCF2-AM FRET-substrat (i det följande kallat BLAM substrat) via β-laktamasaktivitet inuti värdcellen cytoplasma (Figur 1). Genen av intresse är sammansmält med TEM-1 β-laktamas (BLAM) på en reporterplasmid som ger konstitutiv expression. Den BLAM substrat är sammansatt av två fluoroforer (kumarin och fluorescein) som bildar ett FRET-par. Excitation av kumarinresulterar i FRET av fluorescein och grönt fluorescensemission i frånvaro av effektorn sloka; Men om den BlaM-effektor-fusionsproteinet translokeras in i värd cytoplasman, den erhållna β-laktamasaktivitet spaltar β-laktamringen av BLAM substrat, separering av FRET paret producerar blå fluorescensemission efter excitering. Denna translokation analys har väl beprövade som en metod för att identifiera effektor proteiner från en rad olika intracellulära och extracellulära bakterier, inklusive C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogen E. coli, Salmonella och Brucella 17,30-35. För att bestämma betydelsen av specifika värdfaktorer på Coxiella effektor sloka vi använder en väletablerad metod för geners uttryck kallas RNA-interferens, i synnerhet små störande RNA (siRNA). Ursprungligen identifieras i Caenorhabditis elegans, är RNA-interferens en bevarad endogen cellulär process som används för medfödda defeNSE mot virus samt genreglering 36,37. Efter bindning av sekvensspecifik siRNA sker nedbrytning av mRNA genom RISC (RNA-inducerad tysta komplex) som resulterar i specifik geners uttryck eller knockdown 38. I denna studie var siRNA används för att rikta två värdproteiner, Rab5A och Rab7A, som är viktiga regulatorer av den endocytiska vägen. Effekterna av ljuddämpnings Rab5A och Rab7A på effektor translokation fastställdes med hjälp av C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 valdes som det tidigare visat sig vara translokeras av Dot / Icm sekretionssystem av Coxiella 17. Med hjälp av både siRNA geners uttryck och fluorescensbaserad translokation analysen beskrivs här, börjar vi att etablera en roll för värdfaktorer i translokation av effektor proteiner av Coxiella. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på ett brett spektrum av både intracellulära och extracellulära bakterier som besitter liknande secretion system som ansvarar för translokation av effektorceller proteiner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Reagents</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Citric acid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0759</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S4641</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Potassium phosphate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60218</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">442611</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5080</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Iron sulfate</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S93248</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9625</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6852</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bacto-neopeptone</td>
			<td style="width:87px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">211681</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1424</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Methyl beta cyclodextrin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4555</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">RPMI + Glutamax</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378</td>
			<td style="width:211px;">For bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">D-001810-10-05</td>
			<td style="width:211px;">Non-targeting control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-003290-01-005</td>
			<td style="width:211px;">Causes cell death; measure of transfection efficiency</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-004009-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-010388-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">5X siRNA buffer</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:211px;">Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">T-2001-01</td>
			<td style="width:211px;">For transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Opti-MEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td style="width:211px;">Reduced-serum medium used for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">DMEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10567-014</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DMSO</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:211px;">For storage of Coxiella strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PBS</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">0.05% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">dH2O</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For dilution of samples and standards for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Quick-gDNA Mini Prep</td>
			<td style="width:87px;">ZYMO Research</td>
			<td style="width:119px;">D3007</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product to extract gDNA</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td>
			<td style="width:87px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-98020</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:343px;">LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K1032</td>
			<td style="width:211px;">For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106469</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71505</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium hydrogen orthophosphate</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106586</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Probenicid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62251</td>
			<td style="width:211px;">Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:211px;">Fixing solution for HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">25cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430639</td>
			<td style="width:211px;">For growth of bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">75cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430641</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">175cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431080</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Haemocytometer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For quantification of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tear-A-Way 96 Well PCR plates</td>
			<td style="width:87px;">4titude</td>
			<td style="width:119px;">4ti-0750/TA</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">8-Lid chain, flat</td>
			<td style="width:87px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">65.989.002</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top microfuge</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top vortex</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Orbital mixer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:211px;">For pelleting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">Mx3005P QPCR machine</td>
			<td style="width:87px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">401456</td>
			<td style="width:211px;">For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">ClarioSTAR microplate reader</td>
			<td style="width:87px;">BMG LabTech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For measurement of fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing

Coxiella burnetii, det orsakande medlet av Q-feber, är en intracellulär patogen som förlitar sig på en typ IV Dot / Icm sekretionssystemet för att etablera en replika nisch. En kohort av effekten translokeras genom detta system i värdcellen för att manipulera värdprocesser och möjliggöra inrättandet av en unik lysosom härrörande vacuole för replikering. Den metod som presenteras här innebär en kombination av två väletablerade metoder: specifik geners uttryck med hjälp av siRNA och mätning av effektor sloka med hjälp av en FRET-baserad substrat som bygger på β-laktamasaktivitet. Tillämpa dessa två metoder, kan vi börja att förstå vilken roll värdfaktorer i bakteriell sekretionssystemet funktion och effektor translokation. I denna studie undersökte vi roll Rab5A och Rab7A, både viktiga regulatorer av den endocytiska handel vägen. Vi visar att tysta uttrycket av antingen protein resulterar i en minskning av effektor translocation effektivitet. Dessa metoder kan lätt modifieras för att undersöka andra intracellulära och extracellulära patogener som också utnyttjar sekretionssystem. På detta sätt kan en global bild av värdfaktorer som är involverade i bakteriell effektor transloka avslöjas.

För denna studie, C. burnetii pBlaM-CBU0077 stammen valdes som CBU0077 har tidigare visats vara en translokerad effektor av Coxiella Dot / Icm sekretionssystemet 17. Före infektion, det totala antalet för ledare för genom / ml i sju dag C. burnetii pBlaM-CBU0077 kultur räknades med hjälp av qPCR. Figur 4 visar ett exempel på tröskeln cykeln (Ct) värden förväntas från både standarder och prover efter qPCR. Ct-värdena (re...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Undersöker samspelet mellan bakteriella patogener och deras värdar är ett viktigt område för biologisk forskning. Här beskriver vi de nödvändiga tekniker för att mäta effektor translokation av Coxiella burnetii under siRNA geners uttryck med hjälp av BLAM substrat.

Tillämpa Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) för att undersöka Effector Trans Effektivitet av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA Ljuddämpning

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Detektion av toxin Translokation i den mottagande cytosolen genom Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Övervinna svarsbenägenhet i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) Resistenta musstammar genom adoptiv överföring och Antigen Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In vitro-analys för att utvärdera effekten av immunPathWays på HIV-specifika CD4 T-cell effektorfunktion

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion av murina tarminflammation med adoptiv överföring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hög</sup&gt; T-celler i möss med immunbrist

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Tillämpa ett inducerbart uttryck system att studera Störningar av bakteriell Virulensfaktorer med intracellulära signal

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analys av<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translokation i värdceller Använda Beta-laktamas Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Mätning Phagosome pH genom Propportionell fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvecklingen av lyofiliserad Loop-medie Isothermal amplifieringsreagenserna för detektion av<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

En metod för att bedöma Fc-medierad effektor funktioner induceras av influensa Hemagglutinin specifika antikroppar

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...