Name: analysis of brain mitochondria using serial block-face scanning electron microscopy
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00
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We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) na Virginia Tech. Cuidado: precauções extremas devem ser tomados no manuseio e descarte vários componentes utilizados neste protocolo. Antes do uso, o diretrizes institucionais e práticas de saúde e segurança local deve ser estabelecido e seguido, particularmente para tetróxido de ósmio, que é volátil e extremamente venenoso, acetato de uranilo, que é tanto um metal pesado e uma fo...

A complexidade do sistema nervoso apresenta um desafio significativo na reconstrução de grandes volumes de tecido e análise da morfologia e distribuição dos organelos tais como as mitocôndrias com resolução adequada. Várias células, incluindo neurônios, oligodendrócitos e astrócitos com numerosos processos estendidos em três dimensões interagem dentro do tecido cerebral 43. Desde mitocôndrias reside tanto na soma das células e dos processos distantes, morfologia mitocondrial é extremamente p...

As mitocôndrias são organelos dinâmicos que alteram a sua forma e localização de acordo com as pistas e necessidades celulares, em interacção com apertado citoesqueleto celular, e em resposta a eventos celulares, tais como correntes de cálcio em neurónios 1. Mitocôndrias também interagir com outros organelos celulares, por exemplo, retículo endoplasmático, que por sua vez regula a sua dinâmica e metabolismo 2. Morfologia mitocondrial mostra heterogeneidade em diferentes tipos de células ou seja. a forma do organelo varia de tubulares para que consiste em folhas, sacos e ovais 3. Tem sido demonstrado que a fusão e fissão proteínas do ciclo mitocondriais pode regular a localização, tamanho, forma e distribuição das mitocôndrias 4. Além disso, alterações na forma mitocondrial estão associadas com a neurodegeneração, a plasticidade neuronal, atrofia muscular, a sinalização de cálcio, a geração de espécies de oxigénio reactivo, bem como tempo de vida e a morte celular implicando THAmorfologia mitocondrial especifica para a célula T é crítica para a manutenção da função celular normal de 5-11. Uma das principais funções bioenergética da mitocôndria é a geração de trifosfato de adenosina (ATP) através da execução de uma série de reacções metabólicas que envolvem degradação completa de nutrientes (ou seja glucose, ácidos gordos ou aminoácidos) através do ciclo do TCA e OXPHOS vias 12. O cérebro humano constitui apenas 2% do peso corporal no entanto, consome cerca de 20% da energia total produzida tornando-se extremamente energia exigindo órgão 13. É, por conseguinte, não é surpreendente que a disfunção mitocondrial em seres humanos conduz a um grande número de manifestações neurológicas 14-17. As mutações genéticas em componentes OXPHOS que prejudicam leads geração de ATP para doenças mitocondriais 17,18, que são clinicamente grupo heterogêneo de doenças com uma prevalência de ~ 1: 5.000 indivíduos, e uma das causas mais comum de mdistúrbios etabolic em crianças e adultos. Déficit de ATP derivado de mitocôndrias afeta vários sistemas do órgão com os órgãos que exigem alta energia, como o cérebro, coração e músculos esqueléticos sendo influenciados principalmente nesses pacientes 14,17,18. Nos últimos anos, vários estudos têm fornecido evidências para disfunção mitocondrial em ambas as desordens do desenvolvimento neurológico e neurodegenerativas 15-17,19,20. Desde mitocôndrias é essencial e crítico para o desenvolvimento e funcionamento do cérebro, é imperativo desenvolver protocolos que podem analisar as mudanças no cérebro mitocondrial morfologia, estrutura, tamanho, número e distribuição sob ambos os estados saudáveis ​​e doentes. Modelos de rato com mitocôndrias-alvo a proteína fluorescente verde (GFP) foram produzidos para visualizar movimentos mitocondriais e localização no cérebro 21,22. Embora esta seja uma ferramenta extremamente útil para analisar a motilidade mitocondrial e distribuição geral, existem algumas desvantagens que inclue limitada resolução e sensibilidade da microscopia de fluorescência. Estes atributos tornam difícil acompanhar os relativamente pequenos mitocôndrias porte. Da mesma forma, microscopia electrónica de transmissão em série tem sido utilizado com sucesso para visualizar mitocôndrias sináptica 23, mas este método é muito demorado. Morfologia mitocondrial é conhecida por ser altamente dinâmicos uma vez que passam por ciclos contínuos de fissão e de fusão, e na maioria das células mitocôndrias manter uma rede altamente ligado 24-26. Os neurônios são altamente células com vários dendritos e axônios estendidos, e as mitocôndrias que formam uma rede reticular conectado no corpo da célula polarizada pode ter que separar como eles fazem seu caminho através destes neurites (Figura 1). Isso faz com que as mitocôndrias do cérebro extremamente variadas em tamanho e forma. Por exemplo, usando microscopia eletrônica de varredura de bloco-face de série (SBFSEM) técnica, observamos anteriormente que a diferença no volume ou tamanho do mitochondr extrasynapticIA para mitocôndrias presentes nos terminais do nervo pode ser tanto quanto 27 dezasseis vezes. Existem várias abordagens para a realização de volume analisa 28, que inclui de série seção TEM 29, fita automatizada coleta ultramicrotome SEM 30, com foco Ion Beam SEM 31 e SBFSEM 32. A análise SBFSEM tem vantagens na medida em que tem a resolução de fornecer dados quantitativos sobre os morfológica forma, tamanho, número e distribuição dos organelos tais como a mitocôndria em áreas de até 1 mm do cérebro. A operação técnica é também o menos exigente, com aquisição de dados e análise dentro das capacidades de muitos laboratórios biológicos que não têm experiência EM anterior. O advento de instrumentos comerciais para gerar imagens de seção do tipo de série tem feito exame ultra-estrutural em 3D de tecidos de uma técnica de rotina, o que permite ainda uma análise volumétrica imparcial de uma forma rápida e repetível 28 </sup&gt;. O SBFSEM foi descrita pela primeira vez e usado no campo da neurobiologia em 2004 32, baseado em uma idéia introduzida por Leighton em 1981 33. Vários estudos desde então estabeleceram esta técnica como uma ferramenta importante na análise de reconstrução do circuito neuronal 34. Além disso, para muitos projectos de menor escala, ele fornece uma análise de reconstrução para identificar organelas celulares 27,35-39. Uma vez que, as imagens obtidas são derivados de baixa tensão elétrons volta de dispersão, novos protocolos de coloração que combinam diferentes técnicas conhecidas de coloração de metais pesados ​​foram desenvolvidos para aumentar a resolução 40. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para a utilização de 3D ​​imagens de microscopia eletrônica e análise volumétrica das mitocôndrias do cérebro com base em métodos que foram usados ​​previamente por nós e outros 38,39,41. Os métodos de tecido pós-processamento utilizadas foram como anteriormente descrito por Deerinck et al40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone, tradename Fluriso</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>S65105&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly canula</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.45 micron)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NC0813356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome sectioning system</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>Vibratome 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% Solution</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>43731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed-812 EMBEDDING KIT</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14120</td>
			<td>Contains Embed 812&#160; resin, DDSA, NMA, and DMP-30.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% EM Grade</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>20400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum specimen pin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Silver Liquid</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234790</td>
			<td>Hardware/craft stores carry this item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive epoxy</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>16043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Sigma VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In chamber ultramicrotome for SEM</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>3View2</td>
			<td>Can be designed for other SEMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming microscope for pin preparation</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td colspan="2">supplied as part of 3View system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low kV backscattered electron detector</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>3V-BSED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/ Fiji processing package&#160;</td>
			<td colspan="2">ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015</td>
			<td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of brain mitochondria using serial block-face scanning electron microscopy

O cérebro humano é um órgão alta consumindo energia que depende principalmente da glicose como fonte de combustível. A glicose é catabolizada pela mitocôndria do cérebro através de vias de glicólise, ácido tri-carboxílico (TCA) ciclo e fosforilação oxidativa (FOX) para produzir a energia celular na forma de trifosfato de adenosina (ATP). Comprometimento da produção de ATP mitocondrial provoca doenças mitocondriais, que apresentam clinicamente com sintomas neurológicos e miopáticos proeminentes. Defeitos mitocondriais também estão presentes em desordens do desenvolvimento neurológico (por exemplo, transtorno do espectro do autismo) e doenças neurodegenerativas (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer e Parkinson). Assim, há um aumento do interesse na área para a realização de análise 3D da mitocondrial morfologia, estrutura e distribuição em ambos os estados saudáveis ​​e doentes. A morfologia mitocondrial cérebro é extremamente diverso, com algumas mitocôndrias especialmente aqueles ema região sináptica estar na gama de &lt;200 nm de diâmetro, que é inferior ao limite de resolução de microscopia óptica tradicional. Expressando uma proteína mitocondrial-alvo verde fluorescente (GFP) no cérebro aumenta significativamente a detecção organelar por microscopia confocal. No entanto, ele não superar os constrangimentos sobre a sensibilidade de detecção de pequenas relativamente mitocôndrias porte sem supersaturação as imagens de grande porte mitocôndrias. Enquanto microscopia electrónica de transmissão em série tem sido utilizado com sucesso para caracterizar mitocôndrias na sinapse neuronal, esta técnica é extremamente demorada, especialmente quando se comparam amostras múltiplas. A técnica de microscopia eletrônica de varredura de bloco-face de série (SBFSEM) envolve um processo automatizado de corte, blocos de imagem de tecido e aquisição de dados. Aqui, nós fornecemos um protocolo para realizar SBFSEM de uma região definida a partir de cérebro de roedores para reconstruir rapidamente e visualizar a morfologia mitocondrial. esta tecnologianique também poderia ser utilizado para fornecer informação precisa sobre o número de mitocôndrias, de volume, de tamanho e distribuição na região do cérebro definido. Desde a resolução da imagem obtida é alta (tipicamente abaixo de 10 nm) quaisquer defeitos morfológicos mitocondriais brutas também pode ser detectado.

Nós demonstramos que a morfologia mitocondrial cérebro e tamanho é heterogênea em diferentes sub-compartimentos neuronais. A microscopia confocal na densidade culturas neuronais baixos transduzidas com lentivírus expressando a proteína fluorescente verde mitocôndrias-alvo mostraram que as mitocôndrias que residem na soma neuronal formar uma rede reticular, ao passo que aqueles que residem em neurites distais apresentam uma morfologia alongada discreto (Figura 1 AB).</stro...

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Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Análise do Cérebro mitocôndrias Usando Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

The overall goal of the serial block-face scanning electron microscopy technique is to analyze mitochondrial morphology, structure, distribution, volume, and number in a defined region of the mouse brain. This method can help answer many key questions in neurobiology, such as whether changes in brain mitochondria structure, number, and distribution contribute substantially to neurodegenerative and neurodevelopmental disorders. The main advantage of this technique is that it automates the process of imaging serial sections by incorporating a custom ultramicrotome built into the low vacuum scanning electron microscope chamber.To begin the experiment, wash the previously prepared glutaraldehyde-fixed tissues three times for five minutes each in 0.1 molar cacodylate buffer. Post-fix the tissues with 1 milliliter of cacodylate buffered 0.1%tannic acid for 30 minutes at room temperature. After post-fixing, wash the tissues in cacodylate buffer.Dissolve 0.3 grams of potassium ferrocyanide and 0.86 grams of sodium cacodylate in 10 milliliters of distilled water. Just before use, add 10 milliliters of 4%osmium tetroxide and stain the tissues with 2%osmium ferrocyanide solution for 90 minutes on ice. After staining, wash the tissue in distilled water.Treat the samples with freshly prepared 1%thiocarbohydrazide or TCH solution for 20 minutes at room temperature. Then wash the samples. Next, stain the tissues with 2%aqueous osmium tetroxide for one hour.After staining, wash the tissues with distilled water. Incubate the samples overnight in 1%uranyl acetate in distilled water at 4 degrees Celsius. The next day, rinse the tissues in distilled water and incubate them with Welton's lead aspartate stain in an oven.Obtaining the best possible stainings of tissues is critical to imaging, as poor staining results in a charging phenomenon on the sample that makes imaging difficult or impossible. Wash the tissue in distilled water. Dehydrate the samples through a graded series of alcohol using chilled solutions of ethanol for five minutes each, followed by a 100%ethanol dehydration three times for 10 minutes each.Wash the samples two times for 15 minutes each in propylene oxide. Place the tissues in a 1:1 mix of embedding resin and propylene oxide, cap the vial, and incubate the tissues overnight. Uncap the vial after two hours so that the propylene oxide evaporates over the nine-hour period.Transfer the tissues to 100%fresh embedding resin in clean vials for two hours. Embed the samples in fresh embedding resin in flat molds containing printed paper labels and cure them in an oven. After one hour, check the tissue placement and alignment and adjust if necessary.Trim the samples to the area of interest and mount them onto an aluminum pin using gelling cyanoacrylate super glue. Then coat the sample with colloidal silver paste around the sides of the block to provide a conductive path to the aluminum pin. Examine the tissue specimens using a scanning electron microscope system equipped with an in-chamber ultramicrotome stage and a low kilovolt backscattered electron detector.Image the samples with these settings. Begin analysis by selecting Image, Type, then 8-bit to convert the images to 8-bit TIFF format from the original proprietary 16-bit. If automatic contrast and/or brightness conversion during this step is not ideal for images, reopen the 16-bit images and press Image, Adjust, Brightness/Contrast.Select a range that works for all images and press Apply. Then perform the conversion. If there was unacceptable image movement between slices, align the image stacks by selecting Plugins, Registration, and Linear Stack Alignment with SIFT and set the alignment for translation-only mode rather than rigid body.Enlarge the canvas size prior to registration by selecting Image, Adjust, Canvas Size. Alternatively, reduce the image to an area of interest by selecting the desired region and then cropping it. If necessary, scale images to a smaller, more manageable size using ImageJ, then selecting Image and Scale.Confocal microscopy on low-density neuronal cultures showed that mitochondria residing in neuronal soma form a reticular network, whereas those residing in distal neurites exhibit a discrete elongated morphology. Using the serial block-face scanning electron microscopy, or SBFSEM technique, the mitochondria, dendrites, and axonal varicosities were clearly observed in the mouse brain. Three-day reconstructions of mitochondria in the neurites of mouse brain tissue displayed a difference in size between dendritic and axonal mitochondria.Data extracted from a representative 2-D SBFSEM image revealed that the volume or size of mitochondria residing within the neuronal presynapses was significantly smaller than those residing in the extrasynaptic region. The images acquired by SBFSEM analysis provide increased resolution to visual the ultrastructural characteristics of individual mitochondria. It is possible to classify the cellular compartment of mitochondria by determining its proximity to readily identifiable structures like non-synaptic somatic mitochondria and presynaptic mitochondria.This technique can be done in about seven days, which includes three days of staining, two days for resin curing, one day of imaging to produce a stack suitable for this analysis, and about two to four hours for image post-processing in preparation for the analysis. This procedure can also be used in conjunction with other methods for imaging mitochondria such as live imaging with genetically labeled mitochondria to answer questions about mitochondrial trafficking and the dynamics of their fission and fusion.

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