Name: how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases at JoVE.com

We thank Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) for the BPH-1 cells; and Thomas Cox and Janine Erler (Biotech Research &amp; Innovation Centre, University of Copenhagen) for their assistance with rheological measurements. MR-T was funded by Worldwide Cancer Research, formerly The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo and Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). MC was supported by Prostate Cancer UK (Grant S14-017 to JS and GS). KW was funded by The China Scholarship Council. MAM was funded by The Saudi Arabian Cultural Bureau.

<ol>
	<li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+assembly+of+basement+membranes.">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li><li>Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+lateral+associations+in+the+EHS+tumor+matrix.+Comparison+with+amniotic+and+in+vitro+networks.">Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks.</a> Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).</li><li>Halfter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+biomechanical+properties+of+in+vivo-derived+basement+membranes.">Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes.</a> Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).</li><li>Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+the+structure,+composition+and+biophysical+properties+of+a+human+basement+membrane.">Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane.</a> Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).</li><li>To, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes-induced+morphological,+biomechanical,+and+compositional+changes+in+ocular+basement+membranes.">Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes.</a> Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+responsive+adult+human+prostatic+epithelial+cell+lines+immortalized+by+human+papillomavirus+18.">Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18.</a> Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).</li><li>Hayward, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+an+immortalized+but+non-transformed+human+prostate+epithelial+cell+line:+BPH-1.">Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).</li><li>Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+prostatic+carcinoma+cell+line+(PC-3).">Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).</a> Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels:+a+10-year+synthesis.">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).</li><li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGE-modified+basement+membrane+cooperates+with+Endo180+to+promote+epithelial+cell+invasiveness+and+decrease+prostate+cancer+survival.">AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival.</a> J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).</li><li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models.">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li><li>Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nonlinear+rheology+with+inertio-elastic+oscillations.">Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations.</a> J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).</li><li>Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+enzymatic+function+increases+stiffness+to+drive+colorectal+cancer+progression+through+FAK.">Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK.</a> Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).</li><li>Caley, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+Endo180+requires+stromal-derived+LOX+to+promote+metastatic+prostate+cancer+cell+migration+on+human+ECM+surfaces.">Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces.</a> Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).</li><li>Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPI-anchored+uPAR+requires+Endo180+for+rapid+directional+sensing+during+chemotaxis.">GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis.</a> J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).</li><li>Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+generate+localized+Rho-ROCK-MLC2-based+contractile+signals+via+Endo180+to+promote+adhesion+disassembly.">Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly.</a> J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).</li><li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+Outcome+and+EMT+Suppression+Mediated+by+a+Lectin+Domain+Interaction+of+Endo180+and+CD147.">Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147.</a> Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Carson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+characterization+of+ex+vivo+prostate+tissue+via+spherical+indentation+in+the+clinic.">Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic.</a> Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).</li><li>Hoyt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+elasticity+properties+as+biomarkers+for+prostate+cancer.">Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer.</a> Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).</li><li>Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+moduli+of+breast+and+prostate+tissues+under+compression.">Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression.</a> Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+viscoelastic+properties+of+human+prostate+correlated+with+histology.">Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology.</a> Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).</li><li>Corona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benign+prostatic+hyperplasia:+a+new+metabolic+disease+of+the+aging+male+and+its+correlation+with+sexual+dysfunctions.">Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions.</a> Int J Endocrinol. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Een protocol voor het genereren van 3D glandular acini van MEC in pure rBM gels 6 is in een eerdere studie gemodificeerd door toevoeging van 4 mg / ml type I collageen de RBM matrix. De toevoeging van collageen resulteerde in de elastische modulus van de rBM gel toeneemt van 175 ± 37-1589 ± 380 Pascal. Deze 9,1-voudige toename in stijfheid gemoduleerde de groei, overleving, migratie en differentiatie van MEC 21. Het protocol werd wederom gewijzigd door opname van een behandelingsstap met D - (-) - ribose niet-enzymatische verknoping van de type I collageen dat was toegevoegd aan de gel rBM bevorderen. De resulterende 15-voudige toename in stijfheid bleek te werken met oncogene transformatie van MEC hun invasief gedrag 22 bevorderen. De experimentele benadering van het toevoegen type I collageen gels rBM vergemakkelijkt de directe interactie van MEC&#39;s ​​met collageenvezels, die alleen in menselijk weefsel na de fysieke barrière tussen de stromaen epitheel door de BM ondergaat proteolytische afbraak. Door het genereren van 3D-glandular acini van PEC in pure rBM gels voorbehandeld met GLA, het huidige protocol opent de weg om te onderzoeken hoe BM stijfheid per se hun invasief gedrag (figuur 3) kan leiden. De niveaus van BM stijfheid veroorzaakt in dit protocol hebben fysiologische relevantie. Incubatie met 50 mM GLA 6 uur en 14 uur met respectievelijk de elastische moduli van de zuivere rBM gel 175 ± 90 en 322 ± 160 ten opzichte van 122 ± 55 Pascal in rBM gels behandeld met PBS (tabel 1). Dit 1,7-3,2-voudige toename in stijfheid rBM recapituleert het 2,5 tot 3,4-voudige toename van de stijfheid waargenomen maligne opzichte van normale prostaat of BPH weefsel 23-26. Zoals in een recente publicatie de 13 morfologische veranderingen bij de accumulatie van AGE en rBM stijfheid in PEC acini kan worden gekwantificeerd om een statistisch significante verschuiving van arounded naar polygonale vorm, verminderde luminale / totale oppervlakte acinaire en uitsteekt cellen migreren vanuit het acina in de AGE-rijke rBM (figuur 3). Immunoblotting kan ook worden gebruikt om merkers van EMT beoordelen (bijvoorbeeld verlies van E-cadherine 13) en de contractiele beïnvloeden (gefosforyleerd myosine lichte keten-2, pMLC2 13) in PEC gekweekt in normale versus stijve rBM (figuur 3). Verdere beoordelingsproces met immunofluorescentie kleuring en confocale microscopie kunnen worden toegepast op de BM visualiseren (bijvoorbeeld laminine, collageen IV en AGE accumulatie 13), cellulaire apicale naar basale polariteit (bijvoorbeeld apicale lokalisatie van EEA1: vroege endosomale antigeen 1 en GM130: 130 kDa cis Golgi-merker 13) en cellulaire patronen van adhesiemoleculen (bijv E-cadherine lokalisatie tot cel-cel contacten 13) (figuur 3). <img alt = &quot;Figuur 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; Figuur 3:. Overzicht van de verschillende protocollen hier gepresenteerde Het diagram toont hoe voor te bereiden en te verstijven het opgeloste basaal membraan (RBM) met glycolaldehyde (Maillard-reactie), hoe je cellen te zaaien op de stijve rBM, hoe de stijve rBM analyseren ( omvang van Maillard reactie) en -procedures die kunnen worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire veranderingen bij AGE-rijke rBM analyseren. AGE, geavanceerde glycatie eindproducten; BM, basaal membraan; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindol; EEA1, vroeg endosomale antigen 1; GAPDH, glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase; GLA, glycolaldehyde; GEE, glycine ethyl ester; GM130, 130 kDa cis-Golgi marker; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), myosine lichte keten-2 gefosforyleerd op sites threonine 18 en serine 19; rBM, gereconstitueerde basaal membraan; SDS-PAGE, natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese. Voor RWPE1 acini Schaal bar = 10 micrometer; voor PC3 tumorcellensferoïden Schaal bar = 100 micrometer. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Stappen voor probleemoplossing is noodzakelijk als D - (-) - ribose gekozen als verknopingsmiddel voor rBM. Tijdens protocolontwikkeling bleek dat behandeling met 1 M D - (-) - ribose gedurende 72 uren, zoals eerder beschreven voor rBM / collageen gels 22, geleid tot de dehydratatie en krimp van rBM gels. De evaluatie van lagere concentraties van D - (-) - ribose en kortere behandelingstijden kunnen helpen om deze beperking te overwinnen. Een mogelijke beperking van toekomstige toepassingen van het protocol kan waar hogere niveaus van rBM stijfheid gewenst worden aangetroffen. Bij langere incubatietijden en hogere concentraties GLA worden gebruikt om hogere rBM gel stijfheid veroorzaken, zullen dit noodzakelijk<html> beoordelen of deze behandeling die een impact hebben op celoverleving en proliferatie, zoals eerder beschreven 13. Ook moet worden opgemerkt dat incubatie van RWPE-1-cellen met serum induceert een fenotypische EMT-achtige overgang en blootstelling aan serum of serum-bevattende materialen moet worden vermeden. Als bijvoorbeeld experimenten omvatten de transfectie van korte interfererende RNA (siRNA) oligonucleotiden, moet de werkwijze worden geoptimaliseerd met behulp RWPE-1 cellen gekweekt in KSFM zonder het schakelen van de cellen aan lage serum transfectie media. Dit nadeel zou het niveau van gen beschadigen geluidsdemping bereikt bij gebruik van voorbijgaande siRNA zal in het model. Voor sommige eiwit targets zou worden geadviseerd om induceerbare shRNA vectoren voor afstembare gene silencing en de gewenste afname van de eiwitgehalten in dienst. Aanpassingen die enzymatische verknoping te nemen door stromale cel of tumorcel geassocieerd lysyloxidase (LOX) 17 kan ook in toekomstige modellen worden opgenomen. jove_content &quot;&gt; Dit protocol zal de toekomstige studie van pro-invasieve mechanismen geactiveerd door leeftijdsafhankelijke BM stijfheid in PEC (RWPE-1, BPH-1) en evaluatie van anti-metastatische doelstellingen invasieve PTC (PC3) te vergemakkelijken. Aangezien BPH wordt als een stofwisselingsstoornis 27 zijn, dit protocol effent ook de weg naar onze beter inzicht in de relatie tussen metabole stoornissen en verhoogd risico op prostaatkanker. Aangezien BM stijfheid veroorzaakt door de blootstelling aan AGEs trigger voor invasieve andere kanker kan types, zal het van belang zijn om het protocol te gebruiken voor het opzetten van vergelijkbare modellen die normale epitheliale cellen en tumorcellen op te nemen van andere organen (zoals borst-, colon, eierstokken, pancreas). Kritische stappen in het protocol met de timings, zijn in figuur 4. In de eerste stap is het essentieel om de voorraadoplossing van rBM houden bij 4 ° C terwijl het ontdooit zijn pol voorkomenymerization. Pipetpunten mag niet worden geplaatst in de RM voorraad oplossing totdat ze zijn afgekoeld tot 4 ° C. Voor de volgende stap is eveneens belangrijk de kamer sleden geëquilibreerd tot 4 ° C voordat zij worden bekleed met het rBM oplossing. Zodra de temperatuur van de oplossing rBM boven 4 ° C wordt verhoogd zal het onomkeerbare polymerisatie vorming van een gel ondergaat. Het essentieel dat de rBM niet verstoord tijdens de polymerisatiestap zodat er een homogene oppervlak geschikt voor celcultuur en microscopische analyse. De duur van de incubatie met GLA, met of zonder remmers van de Maillard-reactie (natriumcyaanboorhydride en amingoguanidine) zal bepalen hoe stijf de rBM gel wordt. Het wordt aanbevolen om een 6 uur incubatie te gebruiken met GLA ​​als semi-stijve voorwaarden nodig zijn, en 14 uur incubatie als stijve voorwaarden zijn vereist (tabel 1). Alternatieve incubatietijden of concentraties GLA kan worden gebruikt als verschillende niveausstijfheid gewenst zijn. In dit geval rheologische analyse van de RBM gels nodig als een essentiële stap te worden opgenomen. Na de stap van het blussen van de Maillard reactie door incubatie met GEE en de daaropvolgende wasstappen met PBS, kan de rBM gels onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 48 uur vóór het gebruik voor celcultuur. Zodra celkweken worden ingesteld is het belangrijk om het kweekmedium (inclusief eventuele behandelingen) om de twee dagen veranderen. Het wordt aanbevolen om de 3D celculturen handhaven 3-12 dagen afhankelijk van de onderzochte parameters. Voor 3D PEC Acini is het raadzaam om de culturen te analyseren na 6 dagen, en voor 3D PTC sferoïden analyse wordt aanbevolen na 3 dagen van de cultuur in de eerste plaats. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> Figuur 4:. Eenvoudig overzicht van het protocol met kritische stappen en timings gewezen op de flow diagram toont hoe voor te bereiden en te verstijven het opgeloste basaal membraan (RBM) met glycolaldehyde (Maillard-reactie) met kritische stappen en timings aangegeven. Punten waar de protocol kan worden gestopt, en rBM gels opgeslagen, zijn ook aangegeven. rBM, gereconstitueerde basaal membraan; GLA, glycolaldehyde; GEE, glycine ethyl ester; ON, &#39;s nachts; PBS, fosfaatgebufferde zoutoplossing; RT, kamertemperatuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

The basement membrane (BM) is a sheet of specialized extracellular matrix (ECM) that maintains stable tissue borders by separating layers of epithelial cells from the stroma1. Covalent crosslinking between adjacent triple helices of collagen IV in the BM stabilizes their lateral association by establishing an irregular network of super-twisted helices2. These collagen IV lattices act as a scaffold for its interaction with laminin and other BM components1. The structural arrangement of the BM provides it with the mechanical strength and rigidity necessary for the normal development of glandular epithelia3. 
During aging and disease the BM progressively thickens and stiffens3,4. For example, a 3-fold increase in the elastic modulus (E) of the ocular BM occurs between the ages of 50 and 80 in the normal population, and this stiffening is further exacerbated in metabolic disorders like diabetes5. The structural and biomechanical changes in the BM that result in its increased stiffness occur when its ECM components, collagen IV and laminin, become non-enzymatically crosslinked following their exposure to advanced glycation endproducts (AGEs).
The purpose of the method described here was to establish a model for the investigation of how BM stiffness, due to AGE exposure, promotes prostate epithelial cell (PEC) and prostate tumour cell (PTC) invasiveness in the context of the switch to metastatic prostate cancer (PCa). To do this a previous method used for generating 3D glandular acini from mammary epithelial cells (MECs) in reconstituted rBM gels6 was adapted to include an additional step where the rBM gels are pre-treated with glycolaldehyde (GLA). Several techniques for assessing GLA induced crosslinking and stiffening of pre-treated rBM gels are described, including photometric analysis, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), confocal microscopy and rheometric analysis. The prostate cell types selected for culture on the pre-stiffened rBM include: RWPE-1, PECs derived from a normal prostate gland7; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by BPH8; and PC3, metastatic PTCs derived from a secondary tumor located in the vertebral bone of a prostate cancer (PCa) patient9. 
In addition to advancing the study of prostate gland pathology, the protocol for stiffening of rBM gels by their treatment with GLA can be adapted to investigate how BM stiffness contributes to other age-related pathologies and metabolic disorders. For example, the model can be directly applied to investigate how metastatic cancer is induced by BM stiffness in organs such as the breast, colon, ovary and pancreas by the incorporation of appropriate cell types. Furthermore, the protocol can be adapted to investigate how stiff BM promotes biomechanical mechanisms of disease progression in diabetes-related microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:628px;">I - Material for monolayer culture</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:401px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPH-1</td>
			<td>CaP Cell Line Database</td>
			<td>PCaCL-132</td>
			<td>Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete keratinocyte serum-free media&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005-075</td>
			<td>Do not warm at 37 &#186;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>First Link UK Ltd</td>
			<td>02-00-850</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC3&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5886</td>
			<td>warm in 37 &#186;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RWPE-1&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">II - Material for 3D culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminoguanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>396494</td>
			<td>Irritating to eyes, respiratory system and skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chamber slides, 8-well&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td>
			<td>TKT-210-816M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract&#160;</td>
			<td>AMS Biotechnology</td>
			<td>3445-005-01</td>
			<td>Store Basement membrane (BM) at -80 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanogen bromide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C91492</td>
			<td>Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50060</td>
			<td>Irritating to eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycolaldehyde dimer (GLA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium cyanoborohydride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71435</td>
			<td>Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filter 0.22 microns</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>BC680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">III - Material to quantify Maillard reaction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>light sensitive and store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cloning cylinders</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb</td>
			<td>TransGenic Inc</td>
			<td>KH012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1041</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-laminin A/C pAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td>
			<td>sc-7292</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis cassette Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IV - Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ARG2 controlled strain rotational rheometer</td>
			<td>T.A. Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiovert S100 (20x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Axiovert 200M (40x, 63x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">V - Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J 1.47v</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress</td>
			<td>Molecular Divices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases

Hier beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt om de biofysische micro verband met de toegenomen dikte en stijfheid van de basale membraan (BM) bij leeftijdsgebonden pathologieën en metabole stoornissen (zoals kanker, diabetes, microvasculaire ziekte, retinopathie, nefropathie en neuropathie) bestuderen . Het uitgangspunt van het model is niet-enzymatische verknoping van opgeloste BM (RBM) matrix door behandeling met glycolaldehyde (GLA) tot geavanceerde glycatie eindproduct (AGE) generatie te bevorderen via de Maillard-reactie. Voorbeelden van laboratoriumtechnieken die kunnen worden gebruikt om AGE generatie niet-enzymatische verknoping bevestigen en verhoogde stijfheid in GLA behandelde rBM geschetst. Deze omvatten bereiding van natief rBM (behandeling met fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS) en stijf rBM (behandeling met GLA) voor het bepalen van: een AGE gehalte in fotometrische analyse en immunofluorescentie microscopie, de niet-enzymatische verknoping door natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese (SDS PAGE) en confocale microscopie en de toegenomen stijfheid behulp reometrie. De hier beschreven procedure kan worden gebruikt om de stijfheid (elastische modulus, E) van rBM verhogen tot 3,2-voudige, in overeenstemming met metingen bij gezonde versus zieke menselijke prostaatweefsel. Om de biofysische micro-omgeving in verband met de vergrijzing en zieke prostaat recreëren klier drie prostaat celtypen werden geïntroduceerd aan inheemse rBM en stijf rBM: RWPE-1, prostaat epitheelcellen (PEC) afgeleid van een normale prostaat; BPH-1, PEC afgeleid van een prostaat die door goedaardige prostaathyperplasie (BPH); en PC3, metastatische cellen afkomstig van een secundaire beentumor afkomstig van prostaatkanker. Meerdere parameters kunnen worden gemeten, waaronder de grootte, vorm en invasieve eigenschappen van de 3D glandulaire acini gevormd door RWPE-1 en BPH-1 op inheemse versus stijf rBM en gemiddelde celgrootte lengte, migrerend snelheid en persistentie van celbeweging 3D kobaOIDs gevormd door PC3 cellen onder dezelfde omstandigheden. Cel signaalwegen en de subcellulaire lokalisatie van eiwitten kan ook worden beoordeeld.

3D Prostaat Acini gekweekt op Stijf rBM Na 6 dagen kweken PEC afgeleid van normaal prostaatweefsel (RWPE-1) (Figuur 1A) en BPH weefsel (BPH-1) (Figuur 1B) vorm acini op natieve (PBS behandelde) rBM die zijn georganiseerd in uniform sferoïden van epitheliale cellen. Deze acini hebben ook de kenmerken van goed georganiseerde PEC met apicale-to-basale polariteit en een zichtbare luminale ruimte 13,20. De acini gevormd door PEC afgeleid van normaal prostaatweefsel (RWPE-1) (Figuur 1A) en BPH weefsel (BPH-1) (Figuur 1B) met verstijfde (AGE-rich) rBM (behandeling met GLA) een verstoord architectuur (verschuiven van bolvormige naar veelhoekige in vorm en cellen uitsteken / migreren van de acini in de AGE-rijke rBM) (Figuur 1A). Deze<html> acini worden ook gekenmerkt door zeer ongeorganiseerd PEC op hun apicale-basale polariteit te hebben verloren met een klein of nihil luminale ruimte 13. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> Figuur 1:. Prostate epitheelcellen gegroeid 3D Glandular Acini op natieve en Stiff Gereconstitueerd Basement Membrane (rBM) (A) Helderveld afbeeldingen RWPE-1 cellen gekweekt gedurende 12 uur tot 6 dagen rBM gels behandeld met PBS (natief) of 50 mM glycolaldehyde gedurende 14 uur (AGE-rijk, stijf); Schaal bar = 50 micrometer. (B) BPH-1 cellen gekweekt zoals beschreven in paneel A; Schaalbalken = 50 urn; data is representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <html> Tabel 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; Tabel 1:. Kenmerken van de prostaat Epitheliale RWPE-1 acini Grown op Native, Semi-Stijf en stijf Gereconstitueerd Basement Membrane (RBM) RWPE-1 acini werden gekweekt op rBM voorbehandeld met PBS gedurende 14 uur (native), glycolaldehyde (GLA ) gedurende 6 uur (semi-stijf) of GLA gedurende 14 uur (stijf). Voor acinar vorm, het percentage (%) ± standaarddeviatie (SD) van de toer, werden semi-veelhoekige en veelhoekige acini berekend op basis van 5 onafhankelijke experimenten (50 acini gekwantificeerd per conditie). Relatieve acinar grootte werd berekend (inheemse rBM = 100%) van 3 onafhankelijke experimenten. Voor invasiviteit% ± SD acini met één of meer uitstekende cellen werden berekend uit 3 onafhankelijke experimenten. Voudige verandering wordt berekend door de gemiddelde waarde onder semi-stijf of stijf omstandigheden verkregen door de overeenkomstige waarde voor natieve omstandigheden verdelen. P-waarden berekend met t-toets (α = 0,05). NHOUD &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; AGE afhankelijk verhoogd rBM stijfheid bevordert PC3 prostaattumor celmigratie PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM migreren door het handhaven van continue cel-cel contact, terwijl PC3 cellen gekweekt op AGE-rijke (stijf) rBM bewegen onafhankelijk van elkaar (Figuur 2A). Na 72 uur in de cultuur PC3 cellen vormen foci (bolletjes) op inheemse (PBS behandeld) rBM, terwijl PC3 cellen op stijf (AGE-rijke) rBM van bolletjes niet en migreren onafhankelijk (Figuur 2B). PC3 cellen op stijf (AGE-rijke) rBM zijn meer langwerpig dan PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM (figuur 2C). PC3 cellen op stijve rBM migreren sneller dan PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM (figuur 2D). PC3 cellen op stijf rBM vertonen een daling van de persistentie in vergelijking met PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM (figuur 2E). <img alt = &quot;Figuur 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2:. Prostaattumor celmigratie op natieve en Stiff Gereconstitueerd Basement Membrane (rBM) (A) Helderveld afbeeldingen PC3 cellen gekweekt op rBM gels behandeld met PBS (natief) of 50 mM glycolaldehyde 14 uur (AGE-rijke, stijf) . De cellen werden afgebeeld met behulp van een helderveld microscoop (10X objectief) en een overname snelheid van 1 beeld per uur gedurende 12 uur, gevolgd door de cel volgen om trajecten te genereren. Getoonde afbeeldingen komen overeen met de tijdstippen na 0, 3, 6, 9 en 12 uur. Trajecten van enkele cellen worden getoond voor de 12 uur tijdstip. Schaal bar = 100 micrometer. (B) PC3-cellen gekweekt op natieve of stijve rBM voor 72 uur, en afgebeeld zoals in paneel (A). Schaal bar = 100 micrometer. Detail toont geselecteerde gebied op 2X vergroting. (C) Gemiddelde ± SD cellengte (pm); significant verschil tussen autochtone rBM en stijf rBM (p = 1,2 x 10 -23). ( <strong&gt; D) Gemiddelde ± SD snelheid (um / hr) berekend op basis van cell trajecten; significant verschil tussen autochtone rBM en stijf rBM (p = 0,004). (E) Gemiddelde ± SD voortbestaan ​​van de cel beweging (verhouding D / T, waarbij D = afstand van het begin tot het einde van de cel traject, T = totale lengte van de cel traject); significant verschil tussen autochtone rBM en stijf rBM (p = 0,0007). Voor panelen CE&gt; 10 cellen werden geanalyseerd, data is representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases at JoVE.com

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Hier leggen we een protocol voor het modelleren van de biofysische micro-omgeving waar de verknoping en verhoogde stijfheid van het basaal membraan (BM) geïnduceerd door geavanceerde glycatie eindproducten (AGE&#39;s) heeft pathologische relevantie.

Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

hypergepolariseerde<sup&gt; 13</sup&gt; C Metabolic magnetische resonantie spectroscopie en beeldvorming

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

De Colon-26 carcinoom Tumor-dragende Mouse als een model voor de studie van kankercachexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detectie van Mitochondria membraanpotentiaal CLIC4 Knockdown-geïnduceerde HN4 cel Apoptosis om te studeren In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Prostaat-Organoid culturen als hulpmiddelen om genotypes en Mutationele profielen te vertalen naar farmacologische reacties

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Met behulp van de Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model om gynaecologische en urologische kankers studie

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...