Name: how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases at JoVE.com

We thank Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) for the BPH-1 cells; and Thomas Cox and Janine Erler (Biotech Research &amp; Innovation Centre, University of Copenhagen) for their assistance with rheological measurements. MR-T was funded by Worldwide Cancer Research, formerly The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo and Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). MC was supported by Prostate Cancer UK (Grant S14-017 to JS and GS). KW was funded by The China Scholarship Council. MAM was funded by The Saudi Arabian Cultural Bureau.

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Comparison with amniotic and in vitro networks.</a> Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).</li><li>Halfter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+biomechanical+properties+of+in+vivo-derived+basement+membranes.">Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes.</a> Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).</li><li>Candiello, J., Cole, G. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+characterization+of+ex+vivo+prostate+tissue+via+spherical+indentation+in+the+clinic.">Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic.</a> Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).</li><li>Hoyt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+elasticity+properties+as+biomarkers+for+prostate+cancer.">Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer.</a> Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).</li><li>Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. 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The authors have nothing to disclose.

Un protocole pour la génération d&#39;acini glandulaires 3D à partir de MECs dans des gels RBM purs 6 a été modifié dans une étude précédente par l&#39;addition de 4 mg / ml de type collagène à la matrice RBM. L&#39;addition de collagène a entraîné le module d&#39;élasticité du gel RBM passant de 175 ± 37 à 1589 ± 380 pascals. Cette augmentation de 9,1 fois la rigidité modulée de la croissance, la survie, la migration et la différenciation des MECs 21. Le protocole a été modifié à nouveau en incluant une étape de traitement avec la D - (-) - ribose pour favoriser la réticulation non-enzymatique du collagène de type I qui a été ajouté au gel GAR. L&#39;augmentation de 15 fois résultante de la rigidité a été trouvé à coopérer avec la transformation oncogénique de MECs pour promouvoir leur comportement invasif 22. L&#39;approche expérimentale de Type ajoutant collagène à des gels RBM facilite l&#39;interaction directe de MECs avec des fibres de collagène, ce qui ne se produit dans le tissu humain après la barrière physique entre le stromaet de l&#39;épithélium fourni par le BM subit une dégradation protéolytique. En générant acini glandulaires 3D à partir de Pécs en gels RBM purs pré-traités avec GLA, le protocole actuel ouvre la voie à étudier la façon dont BM rigidité en soi peut déclencher leur comportement invasif (Figure 3). Les niveaux de rigidité BM induites dans ce protocole ont une pertinence physiologique. L&#39; incubation avec mM GLA 50 pendant 6 h et 14 h respectivement augmenté les modules élastiques du gel FrP pur à 175 ± 90 et 322 ± 160 par rapport à 122 ± 55 Pascals dans des gels RBM traités avec du PBS (tableau 1). Cette augmentation de 1,7 à 3,2 fois la rigidité FrP récapitule le 2.5- à 3,4 fois-augmentation de la rigidité observée dans maligne par rapport à la prostate normale ou le tissu de BPH 23-26. Comme il est indiqué dans une publication récente 13 , les changements morphologiques induits par l&#39;accumulation d&#39;AGE et FrP raideur dans PEC acini peuvent être quantifiés pour un changement statistiquement significative par rapport arondée de forme polygonale, une diminution de luminal / zone acineuses totale, et les cellules en saillie qui migrent du acina dans le ÂGE riche RBM (Figure 3). Immunotransfert peut également être utilisé pour évaluer les marqueurs de EMT (par exemple perte de E-cadhérine 13) et le comportement contractile (par exemple , la lumière de la myosine phosphorylée chaîne 2, pMLC2 13) à Pécs cultivées dans des conditions normales par rapport à raide FrP (Figure 3). Une évaluation plus poussée en utilisant une coloration immunofluorescente et la microscopie confocale peut être utilisé pour visualiser le BM (par exemple , la laminine, le collagène IV et AGE accumulation 13), la polarité apicale à base cellulaire (par exemple la localisation apicale ROE1: antigène endosomique précoce 1 et GM130: 130 kDa cis-Golgi marqueur 13) et des modèles cellulaires de molécules d&#39;adhésion (par exemple E-cadhérine localisation aux jonctions cellule-cellule 13) (figure 3). <img alt = &quot;Figure 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3:. Vue d&#39; ensemble des différents protocoles présentés ici Le diagramme décrit comment préparer et raidir la membrane basale reconstituée (RBM) avec glycolaldéhyde (réaction de Maillard), comment semer des cellules sur le FrP raide, comment analyser l&#39;FrP rigide ( étendue de la réaction de Maillard) et des procédures qui peuvent être utilisées pour analyser les changements cellulaires et moléculaires induits par AGE riches RBM. AGE, produits de glycation avancée; BM, la membrane basale; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole; EEA1, antigène précoce endosomal 1; GAPDH, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase; GLA, glycolaldéhyde; GEE, l&#39;ester éthylique de la glycine; GM130, 130 kDa marqueurs cis-Golgi; chaîne légère 2 p-MLC2 (Thr18 / SER19), myosine phosphorylée sur des sites thréonine 18 et la sérine 19; RBM, membrane basale reconstituée; SDS-PAGE, électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium. Pour bar RWPE1 acini échelle = 10 pm; pour les cellules tumorales PC3sphéroïdes Barre d&#39;échelle = 100 um. Ce chiffre a été modifié par la référence 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Les étapes de dépannage seront nécessaires si D - (-) - ribose est choisi comme agent de réticulation pour RBM. Au cours de l&#39; élaboration du protocole , il a été constaté que le traitement avec 1 M de D - (-) - ribose pendant 72 heures, comme décrit précédemment pour les gels RBM / 22 de collagène, conduit à la déshydratation et le retrait des gels GAR. L&#39;évaluation des concentrations plus faibles de D - (-) - ribose de courte durée de traitement peut aider à surmonter cette limitation. Une limitation potentielle dans des applications futures du protocole pourrait être rencontré où des niveaux plus élevés de la GAR rigidité sont souhaitées. Si de plus longues durées d&#39;incubation et des concentrations plus élevées de GLA sont utilisées pour induire des niveaux plus élevés de rigidité de gel FrP il sera nécessaire de<html> déterminer si les conditions de traitement ont un impact sur ​​la survie et la prolifération cellulaire, comme décrit précédemment 13. Il convient également de noter que l&#39;incubation des cellules RWPE-1 avec du sérum provoque une transition EMT analogue phénotypiques et l&#39;exposition à du sérum ou des matériaux contenant du sérum doit être évitée. Par exemple, si des expériences impliquent la transfection de petits ARN interférents (siARN) oligonucléotides, la procédure doit être optimisée en utilisant des cellules RWPE-1 cultivées en KSFM, sans changer les cellules à faible milieu de transfection de sérum. Cet inconvénient pourrait compromettre le niveau de silençage génique réalisé lors de l&#39;utilisation de siRNA transitoire approches dans le modèle. Pour certaines protéines cibles, il serait conseillé d&#39;employer des vecteurs inductibles shRNA pour le silençage génique accordable et la diminution souhaitée des taux de protéines. Adaptations qui incorporent la réticulation enzymatique par des cellules stromales ou de cellules tumorales associées lysyl oxydase (LOX) 17 peuvent également être incorporés dans les futurs modèles. jove_content &quot;&gt; Ce protocole facilitera la future étude des mécanismes pro-invasives déclenchées par AGE-dépendante BM raideur dans Pécs (RWPE-1, BPH-1) et l&#39;évaluation des cibles anti-métastatiques dans PTCs envahissantes (PC3). Étant donné que l&#39;HBP est considéré comme un trouble métabolique 27, ce protocole ouvre également la voie à l&#39; amélioration de notre compréhension du lien entre les troubles métaboliques et un risque accru de cancer de la prostate. Étant donné que BM rigidité induite par son exposition aux AGEs peut être un déclencheur pour invasivité dans d&#39; autres cancers types, il sera intéressant d&#39;utiliser le protocole à mettre en place des modèles similaires qui intègrent des cellules épithéliales normales et les cellules tumorales d&#39;autres organes (par exemple , du sein, du côlon, des ovaires, du pancréas). Les étapes critiques au sein du protocole, ainsi que leurs horaires, sont résumés dans la figure 4. Au cours de l&#39;étape initiale , il est essentiel de maintenir la solution mère de la GAR à 4 ° C alors qu&#39;il dégèle pour empêcher sa polymerization. Pointes de pipettes ne doivent pas être placés dans la solution rM des stocks jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient été refroidi à 4 ° C. Pour l&#39;étape suivante, il est également important d&#39;assurer que les diapositives de chambre ont équilibré à 4 ° C avant d&#39;être revêtus de la solution RBM. Dès que la température de la solution GAR est augmentée au-dessus de 4 ° C, il va subir une polymérisation irréversible pour former un gel. Il est essentiel que ces mécanismes ne soit pas perturbé pendant l&#39;étape de polymérisation pour s&#39;assurer qu&#39;il forme une surface plane appropriée pour la culture cellulaire et l&#39;analyse microscopique. La durée d&#39;incubation avec GLA avec ou sans inhibiteurs de la réaction de Maillard (de cyanoborohydrure de sodium et amingoguanidine) déterminera la raideur du gel FrP devient. Il est recommandé d&#39;utiliser une incubation de 6 h avec GLA si les conditions semi-rigides sont nécessaires, et 14 heures d&#39; incubation , si les conditions rigides sont nécessaires (tableau 1). Autres temps d&#39;incubation ou concentrations de GLA peuvent être utilisées si différents niveauxde la rigidité sont souhaitées. Dans ce cas, l&#39;analyse rhéologique des gels RBM doivent être incorporés comme une étape essentielle. Après l&#39;étape de trempe de la réaction de Maillard par incubation avec GEE et les étapes ultérieures de lavage avec du PBS, les gels GAR peuvent être utilisées immédiatement ou stockées à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 48 heures avant leur utilisation pour la culture cellulaire. Une fois que les cultures cellulaires sont mis en place, il est important de changer le milieu de culture (y compris les traitements), tous les deux jours. Il est recommandé de maintenir les cultures de cellules 3D pendant 3-12 jours en fonction des paramètres étudiés. Pour la 3D PEC Acini il est recommandé d&#39;analyser les cultures au bout de 6 jours, et 3D PTC sphéroïdes analyse est recommandée après 3 jours de culture en première instance. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> Figure 4:. Simple Aperçu du protocole avec les étapes et les synchronisations critiques Indiqué Le flow diagramme montre comment préparer et raidir la membrane basale reconstituée (RBM) avec glycolaldéhyde (réaction de Maillard) avec des étapes critiques et les horaires indiqués. Points où le protocole peut être arrêté, et les gels RBM stockés, sont également indiqués. RBM, membrane basale reconstituée; GLA, glycolaldéhyde; GEE, l&#39;ester éthylique de la glycine; ON, durant la nuit; PBS, solution saline tamponnée phosphate; RT, la température ambiante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

The basement membrane (BM) is a sheet of specialized extracellular matrix (ECM) that maintains stable tissue borders by separating layers of epithelial cells from the stroma1. Covalent crosslinking between adjacent triple helices of collagen IV in the BM stabilizes their lateral association by establishing an irregular network of super-twisted helices2. These collagen IV lattices act as a scaffold for its interaction with laminin and other BM components1. The structural arrangement of the BM provides it with the mechanical strength and rigidity necessary for the normal development of glandular epithelia3. 
During aging and disease the BM progressively thickens and stiffens3,4. For example, a 3-fold increase in the elastic modulus (E) of the ocular BM occurs between the ages of 50 and 80 in the normal population, and this stiffening is further exacerbated in metabolic disorders like diabetes5. The structural and biomechanical changes in the BM that result in its increased stiffness occur when its ECM components, collagen IV and laminin, become non-enzymatically crosslinked following their exposure to advanced glycation endproducts (AGEs).
The purpose of the method described here was to establish a model for the investigation of how BM stiffness, due to AGE exposure, promotes prostate epithelial cell (PEC) and prostate tumour cell (PTC) invasiveness in the context of the switch to metastatic prostate cancer (PCa). To do this a previous method used for generating 3D glandular acini from mammary epithelial cells (MECs) in reconstituted rBM gels6 was adapted to include an additional step where the rBM gels are pre-treated with glycolaldehyde (GLA). Several techniques for assessing GLA induced crosslinking and stiffening of pre-treated rBM gels are described, including photometric analysis, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), confocal microscopy and rheometric analysis. The prostate cell types selected for culture on the pre-stiffened rBM include: RWPE-1, PECs derived from a normal prostate gland7; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by BPH8; and PC3, metastatic PTCs derived from a secondary tumor located in the vertebral bone of a prostate cancer (PCa) patient9. 
In addition to advancing the study of prostate gland pathology, the protocol for stiffening of rBM gels by their treatment with GLA can be adapted to investigate how BM stiffness contributes to other age-related pathologies and metabolic disorders. For example, the model can be directly applied to investigate how metastatic cancer is induced by BM stiffness in organs such as the breast, colon, ovary and pancreas by the incorporation of appropriate cell types. Furthermore, the protocol can be adapted to investigate how stiff BM promotes biomechanical mechanisms of disease progression in diabetes-related microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:628px;">I - Material for monolayer culture</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:401px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPH-1</td>
			<td>CaP Cell Line Database</td>
			<td>PCaCL-132</td>
			<td>Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete keratinocyte serum-free media&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005-075</td>
			<td>Do not warm at 37 &#186;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>First Link UK Ltd</td>
			<td>02-00-850</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC3&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5886</td>
			<td>warm in 37 &#186;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RWPE-1&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">II - Material for 3D culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminoguanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>396494</td>
			<td>Irritating to eyes, respiratory system and skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chamber slides, 8-well&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td>
			<td>TKT-210-816M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract&#160;</td>
			<td>AMS Biotechnology</td>
			<td>3445-005-01</td>
			<td>Store Basement membrane (BM) at -80 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanogen bromide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C91492</td>
			<td>Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50060</td>
			<td>Irritating to eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycolaldehyde dimer (GLA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium cyanoborohydride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71435</td>
			<td>Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filter 0.22 microns</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>BC680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">III - Material to quantify Maillard reaction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>light sensitive and store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cloning cylinders</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb</td>
			<td>TransGenic Inc</td>
			<td>KH012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1041</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-laminin A/C pAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td>
			<td>sc-7292</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis cassette Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IV - Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ARG2 controlled strain rotational rheometer</td>
			<td>T.A. Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiovert S100 (20x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Axiovert 200M (40x, 63x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">V - Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J 1.47v</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress</td>
			<td>Molecular Divices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases

Nous décrivons ici un protocole qui peut être utilisé pour étudier le microenvironnement biophysiques liés à l&#39; augmentation de l&#39; épaisseur et la rigidité de la membrane basale (BM) au cours de pathologies liées à l&#39; âge et les troubles métaboliques (par exemple , le cancer, le diabète, la maladie microvasculaire, la rétinopathie, la néphropathie et la neuropathie) . La prémisse du modèle est la réticulation non enzymatique de la matrice BM reconstituée (RBM) par traitement avec glycolaldéhyde (GLA) pour promouvoir avancée glycation produit final (AGE) génération par la réaction de Maillard. Des exemples de techniques de laboratoire qui peuvent être utilisés pour confirmer la production d&#39;AGE, réticulation non enzymatique et une rigidité accrue dans GLA traitées FrP sont décrites. Ceux-ci comprennent la préparation de la GAR native (traitée avec un tampon phosphate salin, PBS) et raide RBM (traité avec GLA) pour la détermination de: sa teneur en AGE par analyse photométrique et de la microscopie par immunofluorescence, sa réticulation non enzymatique par le sulfate de dodécyle sodium polyacrylamideune électrophorèse sur gel (SDS PAGE), ainsi que la microscopie confocale, et sa rigidité augmentée à l&#39;aide rhéométrie. La procédure décrite ici peut être utilisée pour augmenter la rigidité (module élastique, E) de la GAR jusqu&#39;à 3,2 fois, en accord avec les mesures effectuées en bonne santé par rapport à un tissu malade de la prostate humaine. Pour recréer le microenvironnement biophysique associé au vieillissement et de la prostate malade glande trois types de cellules de la prostate ont été introduites sur FrP native et raide RBM: RWPE-1, les cellules épithéliales de la prostate (CBV) provenant d&#39;une glande de la prostate normale; BPH-1, Pecs dérivés d&#39;une glande de la prostate affectée par l&#39;hyperplasie bénigne de la prostate (HBP); et PC3, des cellules métastatiques dérivées d&#39;une tumeur osseuse secondaire provenant d&#39;un cancer de la prostate. Plusieurs paramètres peuvent être mesurés, y compris la taille, la forme et les caractéristiques invasives du acini glandulaires 3D formé par RWPE-1 et BPH-1 sur native par rapport raide FrP, et la longueur moyenne des cellules, la vitesse de migration et de la persistance du mouvement des cellules de Spher 3DOID formés par des cellules PC3 dans les mêmes conditions. voies et la localisation subcellulaire des protéines de signalisation cellulaire peut également être évaluée.

3D Prostate Acini Cultured sur Stiff FrP Après 6 jours de culture, PECs dérivées d&#39; un tissu normal de la prostate (RWPE-1) (figure 1A) et le tissu de BPH (HBP-1) (figure 1B) forme acini sur native (PBS traité) FrP qui sont organisés en sphéroïdes uniformes épithéliales cellules. Ces acini ont aussi les caractéristiques de PECs hautement organisées avec apical à base de polarité et un luminal visible l&#39; espace 13,20. Le acini formé par PECs dérivées de tissus de la prostate normale (RWPE-1) (figure 1A) et le tissu de BPH (HBP-1) (figure 1B) sur raidi RBM (AGE-riche) (traité avec GLA) ont une architecture perturbée (décalage de sphéroïde à forme polygonale et les cellules en saillie / migration de l&#39;acini dans l&#39;AGE riche RBM) (figure 1A). Ces<html> acini sont également caractérisés par PECs très désorganisés qui ont perdu leur polarité apicale à base d&#39;une petite ou inexistante espace luminal 13. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> Figure 1:. Les cellules de la prostate épithéliales Grown comme 3D glandulaire Acini sur autochtone et Stiff Sous - sol Reconstitué Membrane (RBM) (A) images fond clair de RWPE-1 des cellules cultivées pendant 12 heures jusqu&#39;à 6 jours sur des gels RBM traités avec du PBS (native) ou 50 mM glycolaldéhyde pendant 14 heures (AGE-riche, raide); Barre d&#39;échelle = 50 pm. (B) HBP-1 cellules, cultivées comme décrit dans la partie A; Barres d&#39;échelle = 50 pm; données sont représentatives de 3 expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <html> Tableau 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; Tableau 1:. Caractéristiques de la prostate épithéliale RWPE-1 acini Cultivé sur Native, semi-rigide et Stiff Sous - sol Reconstitué Membrane (RBM) RWPE-1 acini ont été cultivées sur FrP pré-traitée avec du PBS pendant 14 heures (native), glycolaldéhyde (GLA ) pendant 6 h (semi-rigide) ou GLA pendant 14 heures (raide). Pour la forme acineuses, le pourcentage (%) ± écart-type (SD) du tour, acini semi-polygonale et polygonale ont été calculées à partir de 5 expériences indépendantes (50 acini quantifiées par condition). Taille acineuses relative a été calculée (natif FrP = 100%) à partir de 3 expériences indépendantes. Pour invasivité,% ± écart-type acini avec une ou plusieurs cellules en saillie ont été calculées à partir de 3 expériences indépendantes. Fold changement est calculé en divisant la valeur moyenne obtenue dans des conditions de semi-rigides ou rigides par la valeur correspondante pour les conditions natives. Les valeurs de P calculées en utilisant le test t de Student (α = 0,05). ontenu &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; AGE dépend plus de rigidité FrP favorise PC3 la prostate migration des cellules tumorales Cellules PC3 cultivées sur natif FrP migrent en maintenant un contact continu de cellule à cellule, tandis que les cellules PC3 cultivées sur AGE riche (raide) FrP se déplacent indépendamment les uns des autres (figure 2A). Après 72 h en culture des cellules PC3 forment des foyers (sphéroïdes) sur natif (PBS traité) FrP, tandis que les cellules PC3 sur rigide (AGE-riche) FrP ne le font pas de sphéroïdes et migrent indépendamment (figure 2B). Cellules PC3 sur rigide (AGE-riche) FrP sont plus allongées que les cellules PC3 cultivées sur FrP native (figure 2C). Cellules PC3 sur raide FrP migrent plus rapidement que les cellules PC3 cultivées sur FrP native (figure 2D). Cellules PC3 sur raides FrP affichent une diminution de la persistance par rapport aux cellules PC3 cultivées sur FrP native (Figure 2F). <img alt = &quot;Figure 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2:. Prostate Migration des cellules tumorales sur les autochtones et Stiff Sous - sol Reconstitué Membrane (RBM) (A) images fond clair de cellules PC3 cultivées sur des gels RBM traités avec du PBS (native) ou 50 mM glycolaldéhyde pendant 14 heures (AGE-riche, raide) . Les cellules ont été imagées en utilisant un microscope à fond clair (objectif 10X) et un taux d&#39;acquisition de 1 image par heure pendant 12 heures suivie de suivi pour générer des trajectoires cellule. Les images présentées correspondent aux points de temps après 0, 3, 6, 9 et 12 heures. Trajectoires de cellules uniques sont présentées pour le point de temps de 12 heures. Barre d&#39;échelle = 100 um. Cellules (B) PC3 cultivées sur FrP native ou raide pendant 72 heures, et imagés comme décrit dans le panneau (A). Barre d&#39;échelle = 100 um. Détail montre la zone sélectionnée à 2X grossissement. (C) moyenne ± SD longueur de la cellule (um); différence significative entre FrP native et raide FrP (p = 1,2 x 10 -23). ( <strong&gt; D) moyenne ± vitesse (um / h) calculée à partir de trajectoires de cellules; différence significative entre FrP native et raide FrP (p = 0,004). (E) moyenne ± persistance du mouvement cellulaire (rapport D / T, où D = distance du début à la fin de la trajectoire de la cellule, T = longueur totale de la trajectoire de la cellule); différence significative entre FrP native et raide FrP (p = 0,0007). Pour les panneaux CE&gt; 10 cellules ont été analysées, les données sont représentatives de 3 expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Nous expliquons ici un protocole pour la modélisation du micro-environnement biophysique où la réticulation et une plus grande rigidité de la membrane basale (BM) induite par les produits de glycation avancée (AGE) ont une pertinence pathologique.

Comment étudier la membrane basale Rigidité comme Biophysical Trigger dans le cancer de la prostate et d&#39;autres pathologies liées à l&#39;âge ou les maladies métaboliques

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

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