Name: how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases at JoVE.com

We thank Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) for the BPH-1 cells; and Thomas Cox and Janine Erler (Biotech Research &amp; Innovation Centre, University of Copenhagen) for their assistance with rheological measurements. MR-T was funded by Worldwide Cancer Research, formerly The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo and Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). MC was supported by Prostate Cancer UK (Grant S14-017 to JS and GS). KW was funded by The China Scholarship Council. MAM was funded by The Saudi Arabian Cultural Bureau.

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	<li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+assembly+of+basement+membranes.">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li><li>Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+lateral+associations+in+the+EHS+tumor+matrix.+Comparison+with+amniotic+and+in+vitro+networks.">Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks.</a> Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).</li><li>Halfter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+biomechanical+properties+of+in+vivo-derived+basement+membranes.">Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes.</a> Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).</li><li>Candiello, J., Cole, G. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+generate+localized+Rho-ROCK-MLC2-based+contractile+signals+via+Endo180+to+promote+adhesion+disassembly.">Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly.</a> J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).</li><li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+Outcome+and+EMT+Suppression+Mediated+by+a+Lectin+Domain+Interaction+of+Endo180+and+CD147.">Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147.</a> Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).</li><li>Paszek, M. 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The authors have nothing to disclose.

純粋なRBMゲル6でのMECから3D腺腺房の世代のためのプロトコルは、私はRBM行列にコラーゲンを4mg / mlのタイプの添加により、以前の研究で変更されました。コラーゲンの添加は175±37 1589年に±380パスカルから増加RBMゲルの弾性率が得られました。剛性のこの9.1倍の増加がのMEC 21の成長、生存、遊走および分化を変調しました。 - （ - ） - RBMゲルに添加されたI型コラーゲンの非酵素的架橋を促進するためにリボースプロトコルがDでの処理工程を含むことにより再び変更されました。剛性の結果として得られる15倍の増加は、それらの侵襲的挙動22を促進するためのMECの発癌性形質転換と協同することが見出されました。 RBMゲルにI型コラーゲンを追加する実験的アプローチは、間質との間の物理的な障壁後のヒトの組織に発生したコラーゲン繊維とのMECの直接的な相互作用を容易にし、そして、BMが提供する上皮は、タンパク質分解を受けます。純粋なRBMゲルGLAで前処理でのPECから3D腺腺房を生成することにより、現在のプロトコルは、BM剛性自体がその侵襲性の挙動（ 図3）をトリガする方法を研究する道を開きます。このプロトコルで誘導されたBM剛性のレベルは生理的関連性を持っています。 6時間および14時間、50 mMのGLAとのインキュベーションは、それぞれPBS（ 表1）で処理されたRBMゲルで122±55パスカルに比べて175±90および322±160に純粋なRBMゲルの弾性率を増加させました。 RBM剛性のこの1.7から3.2倍の増加が、正常な前立腺またはBPH組織23-26と比較して、悪性で観察された剛性の2.5〜3.4倍の増加を再現します。最近の刊行物13で概説したようにPEC腺房におけるAGEとRBM剛性の蓄積によって誘導される形態学的変化は、ARからの統計学的に有意なシフトを定量化することができます多角形状にounded、管腔/総腺房面積、およびAGE-豊富なRBM（ 図3）にacinaから移行突出した細胞を減少させました。免疫ブロッティングも硬いRBM（ 図3）対正常に成長したPECに（E-カドヘリン13の例えば損失）と収縮挙動（ 例えば 、リン酸化ミオシン軽鎖-2、pMLC2 13）EMTのマーカーを評価するために使用することができます。さらに、免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡を用いて評価BM（ 例えばラミニン、コラーゲンIVおよびAGE蓄積13）を視覚化するために適用することができ、細胞の頂端対基底極性（ 例えば 、頂端EEA1の局在：早期エンドソーム抗原1;及びGM130：130 kDaのシス-ゴルジマーカー13）および接着分子の細胞パターン（ 例えば E-カドヘリンの局在化、細胞-細胞接合部13）（ 図3）。 <img aLT =「図3」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; 図3：ここで紹介するさまざまなプロトコルの概要図は（硬いRBMを分析する方法、硬いRBM上に細胞を播種するためにどのように、グリコールアルデヒド（メイラード反応）で再構成基底膜（RBM）を準備し、補強する方法を示していますメイラード反応の程度）とAGEリッチRBMにより誘導される細胞および分子の変化を分析するために使用され得る手順。 AGE、糖化最終産物; BM、基底膜; DAPI、4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール; EEA1、早期エンドソーム抗原1。 GAPDH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ。 GLA、グリコールアルデヒド; GEE、グリシンエチルエステル; GM130、130 kDaのシスゴルジマーカー; P-MLC2（Thr18 / Ser19）、ミオシン軽鎖-2部位でリン酸化は18とセリン19トレオニン; RBM、再構成基底膜; SDS-PAGE、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。 RWPE1腺房スケールバーのため= 10ミクロン; PC3腫瘍細胞のためのスフェロイドのスケールバー=100μmです。この図は、基準13から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> - （ - ） - リボースRBMの架橋剤として選択され、Dは場合トラブルシューティング手順が必要となります。 - （ - ） - 72時間リボース、以前にRBM /コラーゲンゲル22について記載したように、RBMゲルの脱水及び収縮をもたらしプロトコルの開発中には、1 MのDでの処置がことがわかりました。 Dの低濃度の評価 - （ - ） - リボース及び短い処理時間がこの制限を克服するのを助けることができます。 RBM剛性の高いレベルが望まれる場合、プロトコルの将来のアプリケーションの潜在的な制限が発生する可能性があります。より長いインキュベーション時間およびGLAのより高い濃度がRBMゲル剛性の高いレベルを誘導するために使用されている場合には、する必要があります<html>以前に13を説明したように、これらの処理条件は、細胞の生存および増殖に影響を与えるかどうかを評価します。また、血清とRWPE-1細胞のインキュベーションは避けるべき血清または血清含有材料への表現型EMT様移行および露出を誘導することに留意すべきです。実験は短い性RNA（siRNA）オリゴヌクレオチド、干渉のトランスフェクションを含む場合、例えば、手順は、低血清トランスフェクション培地に細胞を切り替えることなく、KSFM中で増殖させたRWP​​E-1細胞を使用して最適化されるべきです。この欠点は、一時的なsiRNAを使用してモデルに近づくときに達成遺伝子サイレンシングのレベルを損なう可能性があります。いくつかのタンパク質標的に対しては、調整可能な遺伝子サイレンシングおよびタンパク質レベルにおける所望の減少を誘導可能なshRNAベクターを使用することが賢明でしょう。間質細胞または腫瘍細胞関連リシルオキシダーゼ（LOX）17による酵素架橋を組み込む適応はまた、将来のモデルに組み込むことができます。 jove_contentは &quot;&gt;このプロトコルは、プロ侵襲のPECにAGE-依存BM剛性によってトリガメカニズム（RWPE-1、BPH-1）および浸潤性のPTC（PC3）における抗転移目標の評価の今後の研究を促進します。BPHことを考えます代謝障害27であると考えられ、このプロトコルはまた、代謝性疾患および前立腺癌のリスクを増加させたとの間のリンクの私達の理解向上に向けての道を開く。AGEsのへの曝露によって誘導さBMの剛性が他の癌における侵襲性のトリガーとすることができることを考えます種類は、それが他の臓器（ 例えば 、乳癌、結腸、卵巣、膵臓）から正常上皮細胞と腫瘍細胞を組み込んで同様のモデルを設定するためのプロトコルを使用する対象としています。 一緒にタイミングとプロトコル内の重要なステップは、 図4に要約されている。最初のステップの間に、そのPOLを防止するために解凍しながら4℃でRBMのストック溶液を維持するために不可欠ですymerization。彼らは4℃に冷却されるまで、ピペットチップは、RMストック溶液の中に置くべきではありません。次のステップのために、それらはRBM液を塗布する前に、チャンバースライドを4℃に平衡化していることを確認することも重要です。できるだけ早くRBM溶液の温度が4℃を超えて上昇されるように、ゲルを形成する不可逆的な重合を受けます。必須のRBMは、それがあっても、細胞培養及び顕微鏡分析に適した表面を形成することを保証するために、重合段階中に妨害されません。メイラード反応（シアノ水素化ホウ素ナトリウムとamingoguanidine）の阻害剤の有無にかかわらずGLAとのインキュベーションの期間は、RBMゲルはどうなるか硬いかを決定します。堅い条件が必要とされるかどうかは（ 表1）半堅い条件が必要な場合GLAで6時間のインキュベーションを使用することをお勧めし、14時間のインキュベーションされます。 GLAの代替インキュベーション時間または濃度が異なるレベルならば使用することができます剛性が望まれます。この場合、RBMゲルのレオロジー解析は必須の工程として組み込まれる必要があります。 GEEとのインキュベーションおよびPBSでのその後の洗浄工程によりメイラード反応をクエンチする工程に続いて、RBMゲルはすぐに使用することができ、または前の細胞培養のためのそれらの使用を最大48時間、4℃で保存しました。細胞培養物を設定したら、2日ごとに（任意の処理を含む）培地を変更することが重要です。調査対象のパラメータに応じて3-12日間の3D細胞培養を維持することをお勧めします。 3D PECについては、6日後、および3D PTCスフェロイド分析のための培養液を分析することをお勧めします腺房は、最初のインスタンスでの培養の3日後にお勧めします。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> 図4：重要なステップとタイミングとプロトコルの簡単な概要示さフロワット図が示された重要なステップとタイミングでグリコールアルデヒド（メイラード反応）で再構成基底膜（RBM）を準備し、補強する方法を示しています。プロトコルが停止することができ、及びRBMゲルが格納ポイントも示されています。 RBM、再構成基底膜; GLA、グリコールアルデヒド; GEE、グリシンエチルエステル; ON、一晩。 PBS、リン酸緩衝生理食塩水。 RT、室温が。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

The basement membrane (BM) is a sheet of specialized extracellular matrix (ECM) that maintains stable tissue borders by separating layers of epithelial cells from the stroma1. Covalent crosslinking between adjacent triple helices of collagen IV in the BM stabilizes their lateral association by establishing an irregular network of super-twisted helices2. These collagen IV lattices act as a scaffold for its interaction with laminin and other BM components1. The structural arrangement of the BM provides it with the mechanical strength and rigidity necessary for the normal development of glandular epithelia3. 
During aging and disease the BM progressively thickens and stiffens3,4. For example, a 3-fold increase in the elastic modulus (E) of the ocular BM occurs between the ages of 50 and 80 in the normal population, and this stiffening is further exacerbated in metabolic disorders like diabetes5. The structural and biomechanical changes in the BM that result in its increased stiffness occur when its ECM components, collagen IV and laminin, become non-enzymatically crosslinked following their exposure to advanced glycation endproducts (AGEs).
The purpose of the method described here was to establish a model for the investigation of how BM stiffness, due to AGE exposure, promotes prostate epithelial cell (PEC) and prostate tumour cell (PTC) invasiveness in the context of the switch to metastatic prostate cancer (PCa). To do this a previous method used for generating 3D glandular acini from mammary epithelial cells (MECs) in reconstituted rBM gels6 was adapted to include an additional step where the rBM gels are pre-treated with glycolaldehyde (GLA). Several techniques for assessing GLA induced crosslinking and stiffening of pre-treated rBM gels are described, including photometric analysis, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), confocal microscopy and rheometric analysis. The prostate cell types selected for culture on the pre-stiffened rBM include: RWPE-1, PECs derived from a normal prostate gland7; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by BPH8; and PC3, metastatic PTCs derived from a secondary tumor located in the vertebral bone of a prostate cancer (PCa) patient9. 
In addition to advancing the study of prostate gland pathology, the protocol for stiffening of rBM gels by their treatment with GLA can be adapted to investigate how BM stiffness contributes to other age-related pathologies and metabolic disorders. For example, the model can be directly applied to investigate how metastatic cancer is induced by BM stiffness in organs such as the breast, colon, ovary and pancreas by the incorporation of appropriate cell types. Furthermore, the protocol can be adapted to investigate how stiff BM promotes biomechanical mechanisms of disease progression in diabetes-related microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:628px;">I - Material for monolayer culture</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:401px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPH-1</td>
			<td>CaP Cell Line Database</td>
			<td>PCaCL-132</td>
			<td>Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete keratinocyte serum-free media&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005-075</td>
			<td>Do not warm at 37 &#186;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>First Link UK Ltd</td>
			<td>02-00-850</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC3&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5886</td>
			<td>warm in 37 &#186;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RWPE-1&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">II - Material for 3D culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminoguanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>396494</td>
			<td>Irritating to eyes, respiratory system and skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chamber slides, 8-well&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td>
			<td>TKT-210-816M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract&#160;</td>
			<td>AMS Biotechnology</td>
			<td>3445-005-01</td>
			<td>Store Basement membrane (BM) at -80 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanogen bromide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C91492</td>
			<td>Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50060</td>
			<td>Irritating to eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycolaldehyde dimer (GLA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium cyanoborohydride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71435</td>
			<td>Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filter 0.22 microns</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>BC680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">III - Material to quantify Maillard reaction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>light sensitive and store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cloning cylinders</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb</td>
			<td>TransGenic Inc</td>
			<td>KH012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1041</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-laminin A/C pAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td>
			<td>sc-7292</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis cassette Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IV - Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ARG2 controlled strain rotational rheometer</td>
			<td>T.A. Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiovert S100 (20x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Axiovert 200M (40x, 63x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">V - Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J 1.47v</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress</td>
			<td>Molecular Divices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases

ここでは、加齢に関連する病状および代謝障害（ 例えば、癌、糖尿病、微小血管疾患、網膜症、腎症および神経障害）の間に増加した厚さと基底膜（BM）の剛性に関連する生物物理学的微小環境を研究するために使用可能なプロトコルを記述する。モデルの前提は、メイラード反応を介して、糖化最終産物（AGE）の生成を促進するためのグリコールアルデヒド（GLA）で処理することによって再構成されたBM（RBM）行列の非酵素的架橋です。 AGEの生成、非酵素的架橋を確認するために使用され、GLAで剛性を向上させることができる実験技術の例としては、RBMが概説されて処理されました。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドにより測光分析によるそのAGE含有量および免疫蛍光顕微鏡法、その非酵素的架橋：これらは、決意のネイティブRBM（リン酸緩衝生理食塩水、PBSで処置した）および堅いRBM（GLAで処理された）の調製を含みますレオメトリーを用いてゲル電気泳動（SDS-PAGEの）だけでなく、共焦点顕微鏡、及びその剛性の増加。ここで説明する手順は、罹患したヒト前立腺組織に対して健康で行われる測定と一致して、3.2倍までRBMの剛性（弾性率、E）を増加させるために使用することができます。老化や病気の前立腺に関連した生物物理学的微小環境を再作成するには、3つの前立腺細胞型がネイティブRBMと硬いRBM上に導入された腺：RWPE-1、正常前立腺由来の前立腺上皮細胞（PECの）; BPH-1、良性前立腺肥大症（BPH）の影響を受け前立腺に由来するのPEC。そして、PC3、転移性細胞は、前立腺癌に由来する二次骨腫瘍由来します。複数のパラメータは大きさ、形状および剛性RBM対ネイティブのRWPE-1及びBPH-1によって形成された3D腺腺房の侵襲的特性、平均セル長、遊走速度および3D spherの細胞運動の持続性を含む、測定することができます。同じ条件下で、PC3細胞によって形成されたOID。経路およびタンパク質の細胞内局在を細胞シグナル伝達も評価することができます。

スティッフRBM上の3D前立腺腺房培養文化の中で6日後、のPECが正常な前立腺組織由来（RWPE-1）（ 図1A）およびBPH組織（BPH-1）上皮の均一な球状体に編成されている（ 図1B）は、ネイティブ（PBS処理）RBM上のフォーム腺房細胞。これらの腺房はまた、頂端ツー基底極性と可視管腔スペース13,20と高度に組織化されたPECの特徴を有しています。 剛性化（AGE-リッチ）RBM（GLAで処理された）上で正常前立腺組織（RWPE-1）（ 図1A）由来のPECとBPH組織（BPH-1）（ 図1B）によって形成された腺房が中断アーキテクチャ（シフトを持っています回転楕円体からの多角形に形状や細胞AGE-豊富なRBM）（ 図1A）に房からの移行/突出インチこれら<html>腺房も小さくまたは存在しない管腔空間13とその頂端ツー基底極性を失った非常に無秩序のPECを特徴とします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> 図1：ネイティブおよびスティッフ再構成基底膜（RBM）に3D腺腺房として成長した前立腺上皮細胞 （A）RWPE-1細胞の明視野画像は、PBS（ネイティブ）またはで処理されたRBMゲル上で6日に12時間まで増殖させ14時間（;堅いAGE-リッチ）のための50mMのグリコールアルデヒド; =50μmのスケールバー。パネルAに記載のように増殖させた（B）BPH-1細胞。スケールバー=50μmの。データは3つの独立した実験の代表である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html>表1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; 表1：ネイティブ、セミスティッフとスティッフ再構成基底膜（RBM）上に成長した前立腺上皮RWPE-1房の特性 RWPE-1房がRBM上で成長させた14時間（ネイティブ）のために、PBSで前処理し、グリコールアルデヒド（GLA。 ）6時間（半堅い）または14時間（硬い）のためにGLA。腺房形状については、割合（％）は、円形の標準偏差（SD）を±、半多角形、および多角形の腺房（50腺房条件ごとに定量）5つの独立した実験から計算しました。相対的な腺房の大きさは、3つの独立した実験からの（ネイティブRBM = 100％）を算出しました。侵襲性のために、一つ以上の突出した細胞とSDの腺房±％は、3つの独立した実験から計算しました。倍数変化は、天然の状態の対応する値によって、半剛性または剛性の条件下で得られた平均値で割ることによって計算されます。 P値は、スチューデントのt検定（α= 0.05）を用いて計算しました。 ontent「FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; AGE依存増加RBM剛性はPC3前立腺腫瘍細胞の遊走を促進します PC3細胞はAGE-リッチ（硬い）上に成長させたのに対し、ネイティブRBM上に成長したPC3細胞は互いに（ 図2A）から独立して、連続的な細胞-細胞接触を維持することによって、RBMの動きを移行します。培養PC3細胞における72時間がネイティブに巣（スフェロイド）を形成した後、スフェロイドからないと独立して（ 図2B）を移行硬い（AGE-リッチ）RBM上のPC3細胞に対し、RBMを（PBS処理します）。堅い（AGE-リッチ）RBM上のPC3細胞は、天然のRBM（ 図2C）上に成長させたPC3細胞よりも細長いです。硬いRBM上のPC3細胞は、天然のRBM（ 図2D）上に成長させたPC3細胞よりも速く移行します。硬いRBM上のPC3細胞は、天然のRBM（ 図2E）上に成長させたPC3細胞と比較して、持続性の減少を表示します。 <img aLT = &quot;図2&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：ネイティブおよびスティッフ再構成基底膜（RBM）に前立腺腫瘍細胞の移動 （A）14時間PBS（ネイティブ）または50ミリモルのグリコールアルデヒドで処理されたRBMゲル上で増殖させたPC3細胞の明視野画像（AGE-豊富な、堅いです） 。細胞は、明視野顕微鏡（10倍対物レンズ）を使用して画像化し、12時間時間あたり1画像の取得率は軌道を生成するために、細胞追跡が続きます。示されている画像は、0、3、6、9、及び12時間後の時点に相当します。単一細胞の軌跡は12時間の時点について示されています。スケールバー=100μmです。 （B）PC3細胞を、72時間、天然または硬いRBM上で培養し、パネル（A）に記載されるように画像化しました。スケールバー=100μmです。詳細は、2倍の倍率で選択した領域を示しています。 （C）平均±SDセル長さ（μm）;ネイティブRBMと硬いRBMとの間に有意な差（p = 1.2×10 -23）。 （ <str細胞軌道から計算オング&gt; D）平均値±SD速度（ミクロン/時間）。ネイティブRBMと硬いRBMた（p = 0.004）との間に有意差。 （スタートからの細胞軌道、細胞軌道のT =全長の末尾にDが=距離比D / T）細胞運動の（E）平均値±SD持続。ネイティブRBMと硬いRBMた（p = 0.0007）との間に有意差。 CE&gt; 10細胞を分析したパネルの場合、データは3つの独立した実験の代表である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

ここでは、架橋および終末糖化産物（AGEsの）によって誘導された基底膜（BM）の剛性の増加は、病理学的関連性を持っている生物物理学的微小環境をモデル化するためのプロトコルを説明します。

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