Name: how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases at JoVE.com

We thank Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) for the BPH-1 cells; and Thomas Cox and Janine Erler (Biotech Research &amp; Innovation Centre, University of Copenhagen) for their assistance with rheological measurements. MR-T was funded by Worldwide Cancer Research, formerly The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo and Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). MC was supported by Prostate Cancer UK (Grant S14-017 to JS and GS). KW was funded by The China Scholarship Council. MAM was funded by The Saudi Arabian Cultural Bureau.

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	<li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+assembly+of+basement+membranes.">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li><li>Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+lateral+associations+in+the+EHS+tumor+matrix.+Comparison+with+amniotic+and+in+vitro+networks.">Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. 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The authors have nothing to disclose.

순수 RBM 젤 6 MEC의에서 3D 선의 선포 세포의 생성을위한 프로토콜은 내가 RBM 행렬에 콜라겐 4 ㎎ / ㎖ 유형의 추가에 의해 이전의 연구에서 수정되었습니다. 콜라겐의 첨가는 1,589 ± 380 ± 175 파스칼 (37)로부터 증가 RBM 겔 탄성률 결과. 강성이 9.1 배 증가 MEC의 (21)의 성장, 생존, 마이그레이션 및 차별화를 변조. - (-) - RBM 겔에 첨가 한 타입 I 콜라겐의 비 효소 적 가교 결합을 촉진하기 리보스 프로토콜은 D와 처리 공정을 포함하여 다시 변경되었다. 강성의 결과로 15 배 증가 그들의 침략 행위 (22)을 촉진하기 위해 MEC의의 종양 변화와 협력 밝혀졌다. I가 RBM 겔 콜라겐 추가 유형의 실험 방법에만 기질 간의 물리적 배리어 후 인체 조직에서 발생하는 콜라겐 섬유와 MEC의 직접적인 상호 작용을 용이상기 BM에 의해 제공 상피 단백질 가수 분해를 거친다. 순수 RBM 젤 GLA로 사전 처리의 농도 (PEC)에서 3D 선의 선포 세포를 생성하여, 현재의 프로토콜은 BM 강성 자체가 자신의 침략 행위 (그림 3)을 실행할 수있는 방법을 연구하는 방법을 엽니 다. 이 프로토콜에 의한 BM 강성의 수준은 생리 학적 관련성을 가지고있다. 6 시간, 14 시간 동안 50 mM의 GLA와 배양은 각각 PBS (표 1)로 처리 RBM 젤 122 ± 55 파스칼에 비해 175 ± 90, 322 ± 160 순수 RBM 젤의 탄성 계수 증가했다. RBM의 강성이 1.7-3.2 배 증가는 정상 전립선 또는 BPH 조직 23-26에 비해 악성 관찰 강성에서 2.5로 3.4 배 증가 되풀이되었습니다. 최근 책에서 PEC 꽈리의 나이와 RBM 강성의 축적에 의해 유발 13 형태 학적 변화를 설명 된대로 아칸소에서 통계적으로 유의 한 변화에 대한 정량화 할 수있다다각형 모양에 ounded, 내강 / 총 선포 영역 및 AGE 풍부한 RBM (그림 3)에 acina에서 이주 돌출 세포를 감소. 면역 또한 EMT의 마커를 평가하기 위해 상기 수축 거동 (예 인산화 미오신 경쇄 -2 pMLC2 13) 강성 RBM 대 정상 성장 농도 (PEC)에서 (도 3) (E-cadherin의 (13)의 소멸)을 사용할 수있다. 130 : 및 GM130 초기 엔도 좀 항원 1 : 면역 염색 및 공 초점 현미경을 사용하여 추가 평가 (예를 들어, 라미닌, 콜라겐 IV와 AGE 축적 13), 휴대 혀끝 - 투 - 기초 극성 (예를 들어 정점 EEA1의 현지화 BM을 시각화에 적용 할 수 kDa의 시스 - 골지 마커 13)과 접착 분자의 세포 패턴 (세포 - 세포 접합 (13)에 예를 들어, E-cadherin의 현지화) (그림 3). <img aLT = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot;/&gt; 그림 3 :. 여기에 제시된 다른 프로토콜의 개요도 (준비 글리콜 알데히드 (메일 라드 반응)으로 재구성 기저막 (RBM), 뻣뻣한 RBM에게 세포를 시드하는 방법, 뻣뻣한 RBM을 분석을 단단하게하는 방법을 보여줍니다 메일 라드 반응) 및 AGE 풍부한 RBM에 의해 유도 된 세포 및 분자 변화를 분석 할 수있는 절차 정도. AGE, 당화 산물; BM, 기저막; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌; EEA1, 초기 엔도 좀 항원 (1); GAPDH, 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 데히드로게나; GLA, 글리콜 알데히드; GEE 글리신 에틸 에스테르; GM130, 130 kDa의 시스 - 골지 마커; P-MLC2 (Thr18 / Ser19), 미오신 경쇄-이 사이트에서 인산화 (18)과 세린 (19) 트레오닌; RBM, 재구성 기저막; SDS-PAGE 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동. RWPE1 꽈리 스케일 바 = 10 μm의; PC3 종양 전지용타원체 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림은 참조 (13)에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> - (-) - 리보스 RBM위한 가교제로서 선택되는 D가 표시된 경우 단계가 필요할 것이다. (- -) - 72 시간 동안 리보오스, 이전에 RBM / 콜라겐 젤 (22)에 기재 한 바와 같이, RBM 젤의 탈수 및 수축의 결과 프로토콜 개발 과정은 1 M의 D와 치료를 한 것으로 나타났습니다. - (-) - D의 낮은 농도의 평가 리보스 짧은 치료 시간은 이러한 한계를 극복하는 데 도움이된다. RBM 강성의 높은 수준이 요구되는 경우, 프로토콜의 미래의 애플리케이션에 제한 전위가 발생 될 수있다. 긴 배양 시간 및 GLA의 높은 농도가 RBM 겔 강성의 높은 수준을 유도하기 위해 사용되는 경우가 필요할 것이다<html> 이러한 처리 조건은 세포 생존 및 증식에 영향을 줄 수 있는지 여부를 미리 13 바와 같이 평가한다. 또한 혈청 RWPE-1 세포의 배양은 피해야 혈청 또는 혈청 - 함유 물질에 대한 표현형 EMT 같은 전이 노광을 유도함을 유의해야한다. 실험 짧은 RNA (siRNA의) 뉴클레오티드 간섭의 형질 전환을 포함하는 경우, 예를 들어, 절차는 낮은 혈청 형질 감염 배지로 세포를 전환하지 않고, KSFM 성장 RWPE-1 세포를 이용하여 최적화되어야한다. 일과성의 siRNA를 사용하는 모델에 접근 할 때 유전자 수준을 손상시킬 수있는 단점이 달성의 음소거. 일부 단백질 표적을 위해 그것은 조정 가능한 유전자 침묵과 단백질 수준에서 원하는 감소를위한 유도의 shRNA 벡터를 사용하는 것이 좋습니다 것입니다. 간질 세포 또는 종양 세포 관련 리실 산화 효소 (LOX) (17)에 의해 효소 가교를 통합 적응은 미래 모델에 통합 될 수있다. jove_content은 &quot;&gt;이 프로토콜은 프로 침습적 농도 (PEC)에 AGE 의존 BM 강성에 의해 트리거 메커니즘 (RWPE-1, BPH-1) 및 침입 PTCS (PC3)에 반 전이 대상의 평가의 미래 연구를 촉진 할 것이다. BPH 점을 감안 대사 장애 (27)로 간주됩니다,이 프로토콜은 또한 신진 대사 장애 및 증가 된 전립선 암 위험 사이의 링크의 우리의 개선 된 이해를 향해 길을 불법 체류자.은 AGEs에의 노출에 의해 유도 된 BM 강성이 다른 암에 침입하기위한 트리거가 될 수 있음을 감안할 때 유형은, 다른 기관 (예를 들어 유방, 결장, 난소, 췌장)에서 정상 상피 세포와 종양 세포를 포함 유사한 모델을 설정 프로토콜을 사용하여 관심을 가질 것이다. 함께 그들의 타이밍과 프로토콜 내에서 중요한 단계는도 4에 요약되어있다. 초기 단계에서는 그것의 POL 방지 해동하면서 4 ° C에서 RBM의 원액을 유지하는 것이 필수적이다ymerization. 그들은 4 ° C로 냉각 될 때까지 피펫 팁은 RM은 원액에 배치 할 수 없습니다. 다음 단계는 그들이 RBM 용액 코팅 전에 상기 챔버 슬라이드는 4 ℃에 평형화 보장하기 위하여 중요하다. 즉시 RBM 용액의 온도는 39 ° C의 이상 증가로는 겔을 형성하기 위해 비가역 중합을 거칠 것이다. 이는 필수적인 RBM은 짝수 세포 배양 및 현미경 분석에 적합한 표면을 형성하도록 중합 단계 동안 방해되지 않도록. 또는 메일 라드 반응 (시아 노 수소화 붕소 나트륨과 amingoguanidine)의 억제제없이 GLA와 인큐베이션 기간은 RBM 겔 방법 뻣뻣하게 결정할 것이다. 뻣뻣한 조건 (표 1) 필요한 경우는 반 강성 조건이 필요한 경우 GLA와 함께 6 시간 배양를 사용하는 것이 좋습니다, 14 시간 배양한다. GLA의 다른 배양 시간 또는 상이한 농도 수준 경우 사용될 수있다강성 요구된다. RBM 겔이 경우 유동 학적 분석에서 필수적인 단계로 통합 될 필요가있다. GEE 함께 배양하고 PBS로 후속 세척 단계에 의해 메일 라드 반응을 급냉하는 단계에 이어, RBM 겔 바로 사용되거나 종래의 세포 배양을위한 그들의 용도에 최대 48 시간 동안 4 ℃에서 보관. 세포 배양이 설정된 후에는 이틀 (모든 치료 포함) 배지를 변경하는 것이 중요하다. 조사중인 파라미터에 따라 3~12일 대한 3 차원 세포 배양 물을 유지하도록 권장한다. 3D를 들어 PEC는 6 일 후에 문화를 분석하는 것이 좋습니다 및 3D PTC는 첫 번째 인스턴스에서 배양 3 일 후 권장 분석을 회전 타원체위한 것입니다 꽈리. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> 그림 4 :. 중요한 단계 및 타이밍과 프로토콜의 간단한 개요 표기됩니다 플로w도 준비하고 표시된 중요한 단계 및 타이밍과 글리콜 알데히드 (메일 라드 반응)으로 재구성 기저막 (RBM)를 단단하게하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜이 중단 될 수 있고, RBM 겔 저장 지점도 표시된다. RBM, 재구성 기저막; GLA, 글리콜 알데히드; GEE 글리신 에틸 에스테르; ON, 밤새; PBS, 인산염 완충 염수; RT, 실내 온도가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

The basement membrane (BM) is a sheet of specialized extracellular matrix (ECM) that maintains stable tissue borders by separating layers of epithelial cells from the stroma1. Covalent crosslinking between adjacent triple helices of collagen IV in the BM stabilizes their lateral association by establishing an irregular network of super-twisted helices2. These collagen IV lattices act as a scaffold for its interaction with laminin and other BM components1. The structural arrangement of the BM provides it with the mechanical strength and rigidity necessary for the normal development of glandular epithelia3. 
During aging and disease the BM progressively thickens and stiffens3,4. For example, a 3-fold increase in the elastic modulus (E) of the ocular BM occurs between the ages of 50 and 80 in the normal population, and this stiffening is further exacerbated in metabolic disorders like diabetes5. The structural and biomechanical changes in the BM that result in its increased stiffness occur when its ECM components, collagen IV and laminin, become non-enzymatically crosslinked following their exposure to advanced glycation endproducts (AGEs).
The purpose of the method described here was to establish a model for the investigation of how BM stiffness, due to AGE exposure, promotes prostate epithelial cell (PEC) and prostate tumour cell (PTC) invasiveness in the context of the switch to metastatic prostate cancer (PCa). To do this a previous method used for generating 3D glandular acini from mammary epithelial cells (MECs) in reconstituted rBM gels6 was adapted to include an additional step where the rBM gels are pre-treated with glycolaldehyde (GLA). Several techniques for assessing GLA induced crosslinking and stiffening of pre-treated rBM gels are described, including photometric analysis, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), confocal microscopy and rheometric analysis. The prostate cell types selected for culture on the pre-stiffened rBM include: RWPE-1, PECs derived from a normal prostate gland7; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by BPH8; and PC3, metastatic PTCs derived from a secondary tumor located in the vertebral bone of a prostate cancer (PCa) patient9. 
In addition to advancing the study of prostate gland pathology, the protocol for stiffening of rBM gels by their treatment with GLA can be adapted to investigate how BM stiffness contributes to other age-related pathologies and metabolic disorders. For example, the model can be directly applied to investigate how metastatic cancer is induced by BM stiffness in organs such as the breast, colon, ovary and pancreas by the incorporation of appropriate cell types. Furthermore, the protocol can be adapted to investigate how stiff BM promotes biomechanical mechanisms of disease progression in diabetes-related microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:628px;">I - Material for monolayer culture</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:401px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPH-1</td>
			<td>CaP Cell Line Database</td>
			<td>PCaCL-132</td>
			<td>Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete keratinocyte serum-free media&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005-075</td>
			<td>Do not warm at 37 &#186;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>First Link UK Ltd</td>
			<td>02-00-850</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC3&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5886</td>
			<td>warm in 37 &#186;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RWPE-1&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">II - Material for 3D culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminoguanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>396494</td>
			<td>Irritating to eyes, respiratory system and skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chamber slides, 8-well&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td>
			<td>TKT-210-816M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract&#160;</td>
			<td>AMS Biotechnology</td>
			<td>3445-005-01</td>
			<td>Store Basement membrane (BM) at -80 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanogen bromide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C91492</td>
			<td>Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50060</td>
			<td>Irritating to eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycolaldehyde dimer (GLA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium cyanoborohydride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71435</td>
			<td>Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filter 0.22 microns</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>BC680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">III - Material to quantify Maillard reaction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>light sensitive and store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cloning cylinders</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb</td>
			<td>TransGenic Inc</td>
			<td>KH012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1041</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-laminin A/C pAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td>
			<td>sc-7292</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis cassette Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IV - Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ARG2 controlled strain rotational rheometer</td>
			<td>T.A. Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiovert S100 (20x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Axiovert 200M (40x, 63x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">V - Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J 1.47v</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress</td>
			<td>Molecular Divices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases

여기서 우리는 연령과 관련된 병리 및 대사성 질환 (예를 들면 암, 당뇨병, 미세 혈관 질환, 망막증, 신장 병증 및 신경 병증) 중에 증가 된 두께 및 기저막 (BM)의 강도에 관련된 생물 물리학 적 미세 환경을 연구하는데 사용될 수있는 프로토콜을 설명 . 모델의 전제는 메일 라드 반응 (Maillard reaction)을 통해 당화 최종 생성물 인 (AGE) 생성을 촉진하는 글리콜 알데히드 (GLA)로 처리하여 재구성 BM (RBM) 행렬의 비 효소 가교이다. AGE 생성 비 효소 적 가교 결합을 확인하는데 사용 GLA의 강성을 증가시킬 수 실험실 기술로서는 RBM이 설명되어 처리 하였다. 광도 분석 및 면역 형광 현미경, 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드에 의한 그것의 비 효소 가교의 AGE 함량 : 이러한 결정 용 (GLA 처리) 단단한 RBM (포스페이트 - 완충 염수, PBS 처리) 네이티브 RBM의 제조를 포함겔 전기 영동 (SDS 페이지)과 공 초점 현미경, 그 증가 된 강성 사용 유변학. 여기에 설명 된 절차는 병든 인간 전립선 조직에 비해 건강에 대한 측정과 일치 3.2 배까지 RBM의 강성 (탄성 계수, E)을 증가시키기 위해 사용될 수있다. 노화와 질병 전립선과 관련된 생물 물리학 적 미세 환경을 다시 만들려면 세 가지 전립선 세포 유형을 기본 RBM과 뻣뻣한 RBM에에 소개 된 글 랜드 : RWPE-1, 전립선 상피 세포 (농도 (PEC)) 정상 전립선에서 파생 된; BPH-1, 양성 전립선 비대증 (BPH)에 의해 영향을받는 전립선 유래의 농도 (PEC); 및 PC3 전이성 세포들은 전립선 암 유래 이차 골 종양으로부터 유래. 여러 매개 변수의 크기, 형상 및 강성 RBM 대 네이티브에 RWPE-1 BPH-1에 의해 형성된 3 차원 샘 꽈리의 침입 특성, 및 평균 셀 길이 이동성 속도 및 3D spher의 세포 이동의 지속성을 포함한 측정 할 수있다동일한 조건 하에서 PC3 세포에 의해 형성 된 OID. 경로 및 단백질의 세포 내 지역화 신​​호 셀도 평가 될 수있다.

뻣뻣한 RBM에 3D 전립선 선포 세포 배양 문화 6 일 후, 농도 (PEC)이 정상 전립선 조직에서 파생 된 (RWPE-1) (그림 1A)와 BPH 조직 (BPH-1) 상피의 균일 한 회전 타원체로 구성됩니다 (그림 1B) 기본 (PBS 치료) RBM에 양식 꽈리 세포. 이 꽈리는 극성 - 기초 - 정점 및 가시 내강 공간 13, 20 고도로 조직 된 페치 특성을 가지고있다. 정상 전립선 조직에서 파생 된 농도 (PEC)에 의해 형성된 꽈리 (RWPE-1) (그림 1A) 및 (GLA 처리) 보강 (AGE 리치) RBM에 BPH 조직 (BPH-1) (그림 1B)를 중단 구조를 가지고 (이동 모양과 세포의 다각형에 구상에서) 나이가 풍부한 RBM) (그림 1A로 선포 세포에서 이주 / 돌출. 이들<html> 꽈리 또한 작거나 존재하지 않는 공간 (13) 내강 그들의 정점 간 기저 극성을 잃었다 고 무질서 농도 (PEC)을 특징으로한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> 그림 1 :. 기본 및 뻣뻣한 재구성 지하 막 (RBM)에 3D 샘 꽈리로 자란 전립선 상피 세포 (A) RWPE-1 세포의 브라이트 이미지는 PBS (기본) 또는 처리 RBM 젤 6 일 12 시간까지 재배 14 시간 (; 뻣뻣한 AGE 리치) 50 MM의 글리콜 알데히드; 스케일 바는 50 μm의 =. 패널 (A)에 기재된 바와 같이 재배 (B) BPH-1 세포; 스케일 바는 50 μm의 =; 데이터는 3 독립적 인 실험의 대표입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> 표 1 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; 표 1. 기본, 세미 뻣뻣한과 까다로운 재구성 지하 막 (RBM)에 재배 전립선 상피 RWPE-1 꽈리의 특성 RWPE-1 꽈리 GLA (RBM 14 시간 (기본), 글리콜 알데히드 PBS로 전처리 성장했다 ) 6 시간 동안 (반 강성) 또는 14 시간 (딱딱한)에 대한 GLA. 선포 모양의 경우, 백분율 (%)은 라운드의 표준 편차 (SD)를 ±, 반 다각형과 다각형 꽈리는 (50 꽈리는 조건에 따라 정량) 5 독립적 인 실험에서 계산 하였다. 상대 선포 크기는 세 독립적 인 실험에서 (기본 RBM = 100 %)을 산출 하였다. 침입 들어, 하나 이상의 돌출 세포 SD 된 꽈리 % ± 3 독립적 인 실험으로부터 계산 하였다. 배 변화 기본 조건에 대응하는 값에 의해, 반 강성 또는 강성 조건에서 얻어진 평균값으로 나누어 계산한다. P 값은 스튜던트 t 검정 (α = 0.05)을 사용하여 계산 하였다. ontent &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; AGE 따라 증가 RBM 강성은 PC3 전립선 종양 세포의 이동을 촉진 PC3 세포는 나이가 풍부한 (딱딱한)에 성장하는 반면 기본 RBM 성장 PC3 세포는 서로 (그림 2A)에서 독립적으로 연속 세포 - 세포 접촉을 유지하여 RBM 움직임을 마이그레이션 할 수 있습니다. 문화 PC3 세포에 72 시간은 기본에 초점 (타원체)를 형성 한 후 회전 타원체에서하지 않고 독립적으로 (그림 2B)를 마이그레이션 강성 (AGE 리치) RBM에 PC3 세포 반면, RBM을 (PBS 치료). 뻣뻣한 (AGE 리치) RBM에 PC3 세포는 기본 RBM (그림 2C)에 성장 PC3 세포보다 더 긴합니다. 뻣뻣한 RBM에 PC3 세포는 기본 RBM (그림 2D)에 성장 PC3 세포보다 더 빠르게 이동한다. 뻣뻣한 RBM에 PC3 세포는 네이티브 RBM (도 2e) 상에 성장 PC3 세포에 비해 지속성의 저하를 표시. <img aLT = &quot;그림 2&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2 :. 기본 및 뻣뻣한 재구성 지하 막 (RBM)에 전립선 종양 세포 마이그레이션 (A) 14 시간 동안 PBS (기본) 또는 50 밀리미터 글리콜 알데히드로 처리 RBM 젤에 성장 PC3 세포의 브라이트 이미지 (AGE-풍부하고 뻣뻣한) . 세포를 명 시야 현미경 (10X 대물 렌즈) 및 궤도를 생성하는 트래킹 셀 다음 12 시간 동안 시간 당 1 화상의 취득 속도를 사용하여 영상화되었다. 도시 된 이미지는 0, 3, 6, 9 및 12 시간 이후의 시점에 대응한다. 단일 세포의 궤도는 12 시간 시점에 대해 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm의. 패널 (A)에 기재된 바와 같이 (B) PC3 세포는 72 시간 동안 천연 또는 뻣뻣한 RBM상에서 배양하고, 묘화. 스케일 바 = 100 μm의. 세부 배의 배율에서 선택한 영역을 보여줍니다. (C) 평균 ± SD 셀 길이 (μm의); 기본 RBM과 뻣뻣한 RBM 사이에 유의 한 차이 (p = 1.2 × 10 -23). ( <str셀 궤도 계산 옹&gt; D) 평균 ± SD 속도 (μm의 / 시간) 기본 RBM과 뻣뻣한 RBM (P = 0.004) 사이의 유의 한 차이. 세포 이동 (E) 평균 ± SD 지속성 (비 D / T, 여기서 D = 처음부터 셀 궤도, 세포 궤도의 T는 = 총 길이의 끝 부분까지의 거리) 기본 RBM과 뻣뻣한 RBM (P = 0.0007) 사이에 유의 한 차이. CE&gt; 10 세포를 분석 하였다 패널의 경우, 데이터가 3 독립적 인 실험의 대표입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

여기에서 우리는 가교 및 당화 산물 (은 AGEs)에 의해 유도 된 기저막 (BM)의 증가 강성 병리학 적 관련성이있는 생물 물리학 적 미세 환경을 모델링하기위한 프로토콜을 설명합니다.

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