Name: how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases at JoVE.com

We thank Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) for the BPH-1 cells; and Thomas Cox and Janine Erler (Biotech Research &amp; Innovation Centre, University of Copenhagen) for their assistance with rheological measurements. MR-T was funded by Worldwide Cancer Research, formerly The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo and Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). MC was supported by Prostate Cancer UK (Grant S14-017 to JS and GS). KW was funded by The China Scholarship Council. MAM was funded by The Saudi Arabian Cultural Bureau.

<ol>
	<li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+assembly+of+basement+membranes.">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li><li>Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+lateral+associations+in+the+EHS+tumor+matrix.+Comparison+with+amniotic+and+in+vitro+networks.">Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks.</a> Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).</li><li>Halfter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+biomechanical+properties+of+in+vivo-derived+basement+membranes.">Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes.</a> Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).</li><li>Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+the+structure,+composition+and+biophysical+properties+of+a+human+basement+membrane.">Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane.</a> Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).</li><li>To, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes-induced+morphological,+biomechanical,+and+compositional+changes+in+ocular+basement+membranes.">Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes.</a> Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+responsive+adult+human+prostatic+epithelial+cell+lines+immortalized+by+human+papillomavirus+18.">Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18.</a> Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).</li><li>Hayward, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+an+immortalized+but+non-transformed+human+prostate+epithelial+cell+line:+BPH-1.">Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).</li><li>Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+prostatic+carcinoma+cell+line+(PC-3).">Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).</a> Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels:+a+10-year+synthesis.">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).</li><li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGE-modified+basement+membrane+cooperates+with+Endo180+to+promote+epithelial+cell+invasiveness+and+decrease+prostate+cancer+survival.">AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival.</a> J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).</li><li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models.">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li><li>Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nonlinear+rheology+with+inertio-elastic+oscillations.">Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations.</a> J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).</li><li>Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+enzymatic+function+increases+stiffness+to+drive+colorectal+cancer+progression+through+FAK.">Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK.</a> Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).</li><li>Caley, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+Endo180+requires+stromal-derived+LOX+to+promote+metastatic+prostate+cancer+cell+migration+on+human+ECM+surfaces.">Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces.</a> Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).</li><li>Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPI-anchored+uPAR+requires+Endo180+for+rapid+directional+sensing+during+chemotaxis.">GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis.</a> J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).</li><li>Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+generate+localized+Rho-ROCK-MLC2-based+contractile+signals+via+Endo180+to+promote+adhesion+disassembly.">Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly.</a> J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).</li><li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+Outcome+and+EMT+Suppression+Mediated+by+a+Lectin+Domain+Interaction+of+Endo180+and+CD147.">Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147.</a> Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Carson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+characterization+of+ex+vivo+prostate+tissue+via+spherical+indentation+in+the+clinic.">Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic.</a> Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).</li><li>Hoyt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+elasticity+properties+as+biomarkers+for+prostate+cancer.">Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer.</a> Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).</li><li>Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+moduli+of+breast+and+prostate+tissues+under+compression.">Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression.</a> Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+viscoelastic+properties+of+human+prostate+correlated+with+histology.">Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology.</a> Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).</li><li>Corona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benign+prostatic+hyperplasia:+a+new+metabolic+disease+of+the+aging+male+and+its+correlation+with+sexual+dysfunctions.">Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions.</a> Int J Endocrinol. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ett protokoll för generering av 3D körtel acini från MEC i rena RBM geler 6 ändrades i en tidigare studie genom tillsats av 4 mg / ml typ I-kollagen till rbM matrisen. Tillsatsen av kollagen resulterade i elasticitetsmodul rbM gel ökar från 175 ± 37 till 1589 ± 380 Pascal. Denna 9,1-faldig ökning av styvheten modul tillväxt, överlevnad, migration och differentiering av MEC 21. Protokollet ändrades igen genom att inkludera en behandlingssteg med D - (-) - ribos för att främja icke-enzymatisk tvärbindning av typ I kollagen som hade lagts till rbM gel. Den resulterande ökningen 15-faldig i styvhet befanns samarbeta med onkogen transformation av MEC att främja deras invasiva beteende 22. Den experimentella tillvägagångssätt att lägga typ I-kollagen till RBM geler underlättar direkt interaktion av MEC med kollagenfibrer, som endast förekommer i mänsklig vävnad efter den fysiska barriären mellan stromaoch epitel från BM genomgår proteolytisk nedbrytning. Genom att generera 3D körtel acini från PEC i rena RBM geler förbehandlats med GLA, öppnar det nuvarande protokollet sättet att studera hur BM styvhet i sig kan utlösa sin invasiva beteende (Figur 3). Nivåerna av BM styvhet inducerade i detta protokoll har fysiologiska relevans. Inkubation med 50 mM GLA under 6 h och 14 h respektive ökade elasticitetsmodul för det rena rbM gel till 175 ± 90 och 322 ± 160 jämfört med 122 ± 55 Pascal i RBM-geler som behandlats med PBS (tabell 1). Detta 1,7-3,2-faldig ökning av rbM styvhet rekapitulerar den 2,5- till 3,4-faldig ökning av styvheten som observerats i malign jämfört med normal prostata eller BPH vävnad 23-26. Som beskrivs i en nyligen publicerad 13 morfologiska förändringar inducerade av ansamling av AGE och RBM stelhet i PEC acini kan kvantifieras för en statistiskt signifikant skifte från arounded till polygonal form, minskade luminal / total acinar område, och utskjutande celler migrerar från acina i AGE-rika rbM (Figur 3). Immunoblotting kan också användas för att bedöma markörer för EMT (t.ex. förlust av E-cadherin 13) och sammandragande beteende (t.ex. fosforylerad myosin lätt kedja-2, pMLC2 13) i Pecs odlas i normal kontra hård rbM (Figur 3). Ytterligare utvärdering med användning av immunofluorescerande färgning och konfokalmikroskopi kan appliceras för att visualisera BM (t.ex. laminin, kollagen IV och AGE ackumulation 13), cellulär apikala-till-basal polaritet (t.ex. apikal lokalisering av EEA1: tidiga endosomala antigen 1; och GM130: 130 kDa cis-Golgi markör 13) och cellulära mönster av adhesionsmolekyler (t.ex. E-cadherin lokalisering till cellcellkontakter 13) (Figur 3). <img alt = &quot;Bild 3&quot; src = &quot;/ filer / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; Figur 3:. Översikt över de olika protokollen som presenteras här Diagrammet visar hur man förbereder och stelna den färdigberedda basalmembranet (rbM) med glykolaldehyd (Maillard reaktion), hur man ympa celler på den styva rbM, hur man analyserar den styva rbM ( omfattningen av Maillard reaktion) och procedurer som kan användas för att analysera de cellulära och molekylära förändringar som induceras av AGE-rika rbM. AGE avancerade glykation slutprodukter; BM, basalmembranet; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindol; EEA1 tidigt endosomala antigen 1; GAPDH, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenas; GLA, glykolaldehyd; GEE, glycinetylester; GM130, 130 kDa cis-Golgi markör; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), myosin lätt kedja-2 fosforylerad vid platser treonin 18 och serin 19; rbM, rekonstruerad basalmembranet; SDS-PAGE, natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektrofores. För RWPE1 acini Scale bar = 10 | am; för PC3 tumörcellsfäroider Scale bar = 100 | j, m. Denna siffra har ändrats från referens 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Felsökningssteg kommer att vara nödvändiga om D - (-) - ribos väljs som tvärbindningsmedel för rbM. Under protokoll utveckling fann man att behandling med en M D - (-) - ribos i 72 h, som tidigare beskrivits för rbM / kollagengeler 22, resulterade i dehydratisering och krympning av RBM-geler. Utvärderingen av lägre koncentrationer av D - (-) - ribos och kortare behandlingstider kan bidra till att övervinna denna begränsning. En potentiell begränsning i framtida tillämpningar av protokollet kan påträffas där högre nivåer av rbM styvhet önskas. Om längre inkubationstider och högre koncentrationer av GLA används för att inducera högre nivåer av rbM gel styvhet kommer det att vara nödvändigt att<html> bedöma om dessa behandlingsförhållanden har en inverkan på cellöverlevnad och -proliferation, såsom tidigare beskrivits 13. Det bör också noteras att inkubation av RWPE-1-celler med serum inducerar en fenotypisk EMT liknande övergång och exponering för serum eller seruminnehållande material bör undvikas. Till exempel, om experiment involverar transfektion av kort interfererande RNA (siRNA) oligonukleotider, förfarandet bör optimeras med hjälp av RWPE-1-celler som odlas i KSFM, utan att växla cellerna låg serum transfektion media. Denna nackdel kan äventyra nivån av gen tysta uppnås vid användning av övergående siRNA strategier i modellen. För vissa målproteiner skulle det vara klokt att använda inducerbara shRNA vektorer för avstämbara geners uttryck och den önskade minskningen i proteinnivåer. Anpassningar som innehåller enzymatisk tvärbindning genom stromal cell eller tumörcell associerad lysyloxidas (LOX) 17 skulle också kunna införlivas i framtida modeller. jove_content &quot;&gt; Detta protokoll kommer att underlätta framtida studier av pro-invasiva mekanismer som utlöses av åldersberoende BM stelhet i Pécs (RWPE-1, BPH-1) och utvärdering av anti-metastaserande mål i invasiva PTC (PC3). Med tanke på att BPH anses vara en störning i ämnesomsättningen 27 protokollet banar också väg för vår förbättrade förståelse för sambandet mellan metabola sjukdomar och ökad risk prostatacancer. med tanke på att BM styvhet induceras av sin exponering mot AGE kan vara en utlösande faktor för invasiv i andra cancer typer, kommer det att vara av intresse att använda protokollet för att upprätta liknande modeller som innehåller normala epitelceller och tumörceller från andra organ (t.ex. bröst, tjocktarm, äggstockar, bukspottkörtel). Kritiska steg i protokollet, tillsammans med sin tidsplanering, sammanfattas i figur 4. Under det inledande steget är det viktigt att behålla stamlösningen av rbM vid 4 ° C medan den tinar att förhindra dess polymerization. Pipettspetsar bör inte placeras i rm stamlösning tills de har kylts till 4 ° C. För nästa steg är det också viktigt att se till kammarobjektglas har jämviktats till 4 ° C innan de beläggs med den rbM lösningen. Så snart som temperaturen hos rbM lösning ökas över 4 ° C kommer det att genomgå irreversibel polymerisation för att bilda en gel. Det viktigt att rbM inte störs under polymerisationssteget så att den bildar en jämn yta som är lämplig för cellodling och mikroskopisk analys. Längden på inkubation med GLA med eller utan hämmare av Maillard-reaktionen (natriumcyanoborohydrid och amingoguanidine) avgör hur styv rbM gelen blir. Det rekommenderas att använda en 6 timmars inkubation med GLA om halv styva villkor krävs, och 14 timmars inkubation om stela förhållanden krävs (tabell 1). Alternativa inkubationstider eller koncentrationer av GLA kan användas om olika nivåerav styvhet önskas. I detta fall reologisk analys av RBM geler måste införlivas som ett viktigt steg. Efter steget att släcka Maillard-reaktionen genom inkubering med GEE och de efterföljande tvättsteg med PBS, kan RBM geler användas omedelbart eller lagras vid 4 ° C i upp till 48 h före deras användning för cellodling. När cellkulturer sätts upp är det viktigt att ändra odlingsmediet (inklusive eventuella behandlingar) varannan dag. Det rekommenderas att hålla 3D cellkulturer för 3-12 dagar enligt parametrarna är föremål för undersökning. För 3D PEC acini rekommenderas att analysera kulturerna efter 6 dagar, och för 3D PTC sfäroider analys rekommenderas efter 3 dagars odling i första instans. <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> Figur 4:. Enkel översikt av protokollet med Kritiska steg och tider indikerade flow diagram visar hur man förbereder och stelna den färdigberedda basalmembranet (rbM) med glykolaldehyd (Maillard reaktion) med kritiska steg och tider som anges. Punkter där protokollet kan stoppas, och RBM geler lagrade, är också indikerade. rbM, rekonstruerad basalmembranet; GLA, glykolaldehyd; GEE, glycinetylester; ON, över natten; PBS, fosfatbuffrad saltlösning; RT rumstemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

The basement membrane (BM) is a sheet of specialized extracellular matrix (ECM) that maintains stable tissue borders by separating layers of epithelial cells from the stroma1. Covalent crosslinking between adjacent triple helices of collagen IV in the BM stabilizes their lateral association by establishing an irregular network of super-twisted helices2. These collagen IV lattices act as a scaffold for its interaction with laminin and other BM components1. The structural arrangement of the BM provides it with the mechanical strength and rigidity necessary for the normal development of glandular epithelia3. 
During aging and disease the BM progressively thickens and stiffens3,4. For example, a 3-fold increase in the elastic modulus (E) of the ocular BM occurs between the ages of 50 and 80 in the normal population, and this stiffening is further exacerbated in metabolic disorders like diabetes5. The structural and biomechanical changes in the BM that result in its increased stiffness occur when its ECM components, collagen IV and laminin, become non-enzymatically crosslinked following their exposure to advanced glycation endproducts (AGEs).
The purpose of the method described here was to establish a model for the investigation of how BM stiffness, due to AGE exposure, promotes prostate epithelial cell (PEC) and prostate tumour cell (PTC) invasiveness in the context of the switch to metastatic prostate cancer (PCa). To do this a previous method used for generating 3D glandular acini from mammary epithelial cells (MECs) in reconstituted rBM gels6 was adapted to include an additional step where the rBM gels are pre-treated with glycolaldehyde (GLA). Several techniques for assessing GLA induced crosslinking and stiffening of pre-treated rBM gels are described, including photometric analysis, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), confocal microscopy and rheometric analysis. The prostate cell types selected for culture on the pre-stiffened rBM include: RWPE-1, PECs derived from a normal prostate gland7; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by BPH8; and PC3, metastatic PTCs derived from a secondary tumor located in the vertebral bone of a prostate cancer (PCa) patient9. 
In addition to advancing the study of prostate gland pathology, the protocol for stiffening of rBM gels by their treatment with GLA can be adapted to investigate how BM stiffness contributes to other age-related pathologies and metabolic disorders. For example, the model can be directly applied to investigate how metastatic cancer is induced by BM stiffness in organs such as the breast, colon, ovary and pancreas by the incorporation of appropriate cell types. Furthermore, the protocol can be adapted to investigate how stiff BM promotes biomechanical mechanisms of disease progression in diabetes-related microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:628px;">I - Material for monolayer culture</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:401px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPH-1</td>
			<td>CaP Cell Line Database</td>
			<td>PCaCL-132</td>
			<td>Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete keratinocyte serum-free media&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005-075</td>
			<td>Do not warm at 37 &#186;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>First Link UK Ltd</td>
			<td>02-00-850</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC3&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5886</td>
			<td>warm in 37 &#186;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RWPE-1&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">II - Material for 3D culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminoguanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>396494</td>
			<td>Irritating to eyes, respiratory system and skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chamber slides, 8-well&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td>
			<td>TKT-210-816M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract&#160;</td>
			<td>AMS Biotechnology</td>
			<td>3445-005-01</td>
			<td>Store Basement membrane (BM) at -80 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanogen bromide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C91492</td>
			<td>Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50060</td>
			<td>Irritating to eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycolaldehyde dimer (GLA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium cyanoborohydride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71435</td>
			<td>Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filter 0.22 microns</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>BC680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">III - Material to quantify Maillard reaction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>light sensitive and store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cloning cylinders</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb</td>
			<td>TransGenic Inc</td>
			<td>KH012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1041</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-laminin A/C pAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td>
			<td>sc-7292</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis cassette Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IV - Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ARG2 controlled strain rotational rheometer</td>
			<td>T.A. Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiovert S100 (20x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Axiovert 200M (40x, 63x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">V - Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J 1.47v</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress</td>
			<td>Molecular Divices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases

Här beskriver vi ett protokoll som kan användas för att studera biofysiska mikro relaterade till ökad tjocklek och styvhet basalmembranet (BM) under åldersrelaterade sjukdomar och ämnesomsättningssjukdomar (t.ex. cancer, diabetes, mikrovaskulär sjukdom, retinopati, nefropati och neuropati) . Utgångspunkten för modellen är icke-enzymatisk tvärbindning av rekonstituerad BM (rbM) matrisen genom behandling med glykolaldehyd (GLA) att främja avancerade glykation slutprodukt (AGE) generation via Maillard-reaktionen. Exempel på laboratorietekniker som kan användas för att bekräfta AGE generation, icke-enzymatisk tvärbindning och ökad styvhet i GLA behandlade rbM beskrivs. Dessa innefattar framställning av nativt rbM (behandlade med fosfatbuffrad saltlösning, PBS) och stel rbM (behandlade med GLA) för bestämning av: dess AGE halt genom fotometrisk analys och immunofluorescerande mikroskopi, dess icke-enzymatisk tvärbindning genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektrofores (SDS PAGE) samt konfokalmikroskopi, och dess ökade styvhet med användning reometri. Det förfarande som beskrivs här kan användas för att öka styvheten (elasticitetsmodul, E) av rbM upp till 3,2-faldig, i överensstämmelse med mätningar som gjorts på friska kontra sjuk mänsklig prostatavävnad. För att återskapa den biofysiska mikro i samband med åldrande och sjuka prostatakörteln tre typer prostatacell infördes på inhemska rbM och stel rbM: RWPE-1, prostata epitelceller (PEC) som härrör från en normal prostatakörteln; BPH-1, PEC härrör från en prostatakörteln påverkas av godartad prostataförstoring (BPH); och PC3, metastaserande celler härledda från en sekundär bentumör härrör från prostatacancer. Flera parametrar kan mätas, inklusive storlek, form och invasiva egenskaper hos 3D glandulära acini bildas av RWPE-1 och BPH-1 på nativt kontra styv rbM, och medelcelllängd, migratory hastigheten och varaktigheten av cellrörelse av 3D spherOID bildas av PC3-celler under samma betingelser. Cellsignalvägar och subcellulära lokalisering av proteiner kan också utvärderas.

3D Prostata acini odlade på Stiff rbM Efter 6 dagar i kultur, PEC härrör från normal prostatavävnad (RWPE-1) (Figur 1A) och BPH vävnad (BPH-1) (Figur 1B) bildar acini på nativt (PBS-behandlade) rbM som är organiserade i enhetliga sfäroider av epitel celler. Dessa acini har också egenskaper starkt organiserade PEC med apikal till basala polaritet och en synlig luminalhåligheten 13,20. Den acini bildas av PEC härledda från normal prostatavävnad (RWPE-1) (Figur 1A) och BPH vävnad (BPH-1) (Figur 1B) på stelnade (AGE-rika) rbM (behandlade med GLA) har en störd arkitektur (skiftning från sfärisk till polygonal form och celler utskjutande / migrera från acini i AGE-rika rbM) (Figur 1A). Dessa<html> acini kännetecknas också av mycket oorganiserade PEC som har förlorat sin apikala till basala polaritet med en liten eller obefintlig luminala utrymmet 13. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> Figur 1:. Prostata epitelceller odlas som 3D Glandulär acini på Native och Stiff Utspädd Basement Membrane (rbM) (A) bright bilder av RWPE-1-celler som odlas för 12 timmar upp till 6 dagar på RBM geler som behandlats med PBS (native) eller 50 mM glykolaldehyd under 14 h (AGE-rika stel); Skalstreck = 50 | im. (B) BPH-1-celler, odlades såsom beskrivits i panel A; Skalstrecken = 50 pm; informationen representerar 3 oberoende experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <html> Tabell 1 &quot;src =&quot; / filer / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; Tabell 1:. Kännetecken för Prostate Epithelial RWPE-1 acini Grown på Native, Semi-Stiff och Stiff rekonstituerade basalmembran (rbM) RWPE-1 acini odlades på rbM förbehandlats med PBS under 14 h (nativ), glykolaldehyd (GLA ) under 6 h (halvstyv) eller GLA i 14 h (styvt). För acinar form, i procent (%) ± standardavvikelse (SD) av runda, var halv polygonal och polygonal acini beräknas från 5 oberoende experiment (50 acini kvantifieras per tillstånd). Relativ acinar storlek beräknades (native rbM = 100%) från 3 oberoende experiment. För invasivitet ades% ± SD acini med en eller flera utskjutande celler beräknades från 3 oberoende experiment. Faldig förändring beräknas genom att dividera medelvärdet som erhållits enligt semi-styva eller stela förhållanden med motsvarande värde för naturliga förhållanden. P-värden beräknades med användning av Students t-test (α = 0,05). INNEHÅLL &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; åldersberoende ökat rbM styvhet främjar PC3 prostatatumörcell migration PC3-celler odlade på infödda rbM migrera genom att upprätthålla en kontinuerlig cell-cellkontakt, medan PC3-celler odlas på AGE-rika (styvt) rbM drag oberoende av varandra (Figur 2A). Efter 72 timmar i odlings PC3-celler bildar foci (sfäroider) på native (PBS-behandlade) rbM, medan PC3-celler på styva (AGE-rika) rbM inte från sfäroider och migrera oberoende (Figur 2B). PC3-celler på styva (AGE-rika) rbM är mer långsträckt än PC3-celler odlade på nativt rbM (figur 2C). PC3-celler på styva rbM migrerar snabbare än PC3-celler odlade på nativt rbM (figur 2D). PC3-celler på hård rbM visar en minskning av uthållighet jämfört med PC3-celler odlade på nativt rbM (Figur 2E). <img alt = &quot;Bild 2&quot; src = &quot;/ filer / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2:. Prostatatumör Cell Migration på Native och Stiff Utspädd Basement Membrane (rbM) (A) bright bilder av PC3-celler odlade på RBM geler som behandlats med PBS (native) eller 50 mM glykolaldehyd under 14 h (AGE-rika, styvt) . Cellerna avbildas med en bright mikroskop (10X objektiv) och en upptagningshastighet av en bild per timme under 12 timmar följt av cell spårning för att generera banor. Bilderna motsvarar de tidpunkter efter 0, 3, 6, 9 och 12 timmar. Banor av enskilda celler visas för 12 timmar tidpunkt. Skalstreck = 100 | j, m. (B) PC3-celler odlades på nativt eller styv rbM i 72 h, och avbildas såsom beskrivits i panel (A). Skalstreck = 100 | j, m. Detalj visar markerade området vid 2X förstoring. (C) Medel ± SD cellängd (^ m); signifikant skillnad mellan nativt rbM och stel rbM (p = 1,2 x 10 -23). ( <strong&gt; D) Medelvärde ± SD hastighet (^ m / h) beräknas från cell banor; signifikant skillnad mellan nativt rbM och stel rbM (p = 0,004). (E) Medelvärde ± SD persistens av cellrörelse (förhållande D / T, där D = avståndet från början till slutet av cell bana, T = total längd av cell bana); signifikant skillnad mellan nativt rbM och stel rbM (p = 0,0007). För paneler CE&gt; 10 celler analyserades, är data som representerar 3 oberoende experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases at JoVE.com

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Här förklarar vi ett protokoll för att modellera den biofysiska mikro där tvärbindning och ökad styvhet av basalmembranet (BM) som induceras av avancerade glykation slutprodukter (AGE) har patologisk relevans.

Hur att studera Basement Membrane styvhet som en Biophysical Trigger vid prostatacancer och andra åldersrelaterade sjukdomar eller metabola sjukdomar

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser för att studera makrofager och mikroglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

hyperpolariserad<sup&gt; 13</sup&gt; C Metabolic magnetisk resonansspektroskopi och Imaging

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Colon-26 karcinom tumörbärande mus som en modell för studier av cancerkakexi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Påvisande av mitokondrier membranet Potential att studera CLIC4 Knockdown-inducerad HN4 Cell apoptos In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide anrikning tillsammans med etikett-fri kvantitativa masspektrometri att undersöka Phosphoproteome vid prostatacancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Jäst som chassi för att utveckla funktionella analyser för att studera humant p53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analys för att studera interaktion med tumör-makrofage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Prostata Organoid kulturer som verktyg för att översätta genotyper och Mutationella profiler till farmakologiska svar

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Använda Kyckling chorioallantoic Membrane In Vivo modell för att studera gynekologiska och urologiska cancerformer

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...