Name: human placental and decidual organ cultures to study infections at the maternal-fetal interface
Uploaded: 2016-07-21T15:00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface at JoVE.com

We are grateful to Cristina Faralla and David Lowe for helpful discussions. We acknowledge Mark Weinstein and San Francisco General Hospital Pathology Department for expert advice. This work was supported by National Institute of Health grants R01AI084928 and Burroughs Wellcome Fund 41259 to A.I.B; G.A.R. was supported by F32AI108195, Society for Pediatric Pathology Young Investigator Research grant, and University of California Partnerships for Faculty Diversity President's Post-doctoral Fellowship.

<ol>
	<li>Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+host+specificity+in+human+pathogenic+bacteria.">Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria.</a> Emerging microbes &amp; infections. 3, e23 (2014).</li><li>Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+syncytiotrophoblast+constitutes+a+major+barrier+to+vertical+transmission+of+Listeria+monocytogenes.">Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes.</a> PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).</li><li>Zhang, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polymeric+immunoglobulin+receptor+translocates+pneumococci+across+human+nasopharyngeal+epithelial+cells.">The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells.</a> Cell. 102, 827-837 (2000).</li><li>Ngampasutadol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+C4b-binding+protein+selectively+interacts+with+Neisseria+gonorrhoeae+and+results+in+species-specific+infection.">Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).</li><li>Pishchany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+for+human+hemoglobin+enhances+Staphylococcus+aureus+infection.">Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection.</a> Cell host &amp; microbe. 8, 544-550 (2010).</li><li>Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology of the Human Placenta. , (2012).</li><li>Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+barriers+of+the+human+placenta+to+infection+with+Toxoplasma+gondii.">Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii.</a> Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.+Nature+reviews.">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).</li><li>Hazan, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-leukocyte+interactions:+mechanisms+of+human+decidual+spiral+artery+remodeling+in+vitro.">Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro.</a> The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).</li><li>Dunk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+trophoblast-mediated+decidual+blood+vessel+remodeling.">A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).</li><li>Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+12.+Placental+remodeling+of+the+uterine+vasculature.">Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature.</a> Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+safe+work+practices+in+human+and+animal+medical+diagnostic+laboratories.+Recommendations+of+a+CDC-convened,+Biosafety+Blue+Ribbon+Panel.">Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel.</a> MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).</li><li>Lash, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentrations+inhibit+trophoblast+cell+invasion+from+early+gestation+placental+explants+via+alterations+in+levels+of+the+urokinase+plasminogen+activator+system.">Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system.</a> Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).</li><li>Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bacterial+load+and+immune+responses+in+mice+infected+with+Listeria+monocytogenes.">Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+analysis+of+degeneration+and+regeneration+of+syncytiotrophoblast+in+first+trimester+placental+villi+during+organ+culture.">Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture.</a> Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods in enzymology. 236, 405-420 (1994).</li><li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-embedded+and+frozen+sections+of+Drosophila+adult+muscles.">Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li><li>Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Laboratory+Techniques.+Histological+Sample+Preparation+for+Light+Microscopy.">General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy.</a> JoVE. , (2016).</li><li>Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+paraffin+sections+of+mouse+epidermis+using+fluorescent+antibodies.">Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li><li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry:+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs.">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).</li><li>Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+defense+and+tolerance:+unique+challenges+in+the+placenta.">Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta.</a> PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).</li><li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome.">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515, 355-364 (2014).</li><li>Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogens+and+the+placental+fortress.">Pathogens and the placental fortress.</a> Current opinion in microbiology. 15, 36-43 (2012).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li><li>Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+anti-listerial+responses+in+deciduoma+of+pseudopregnant+mice.">Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice.</a> The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).</li><li>Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+functions+are+regulated+by+the+substratum+of+murine+decidual+stromal+cells.">Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells.</a> The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).</li><li>Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+traffics+from+maternal+organs+to+the+placenta+and+back.">Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back.</a> PLoS pathogens. 2, e66 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Инбредные трансгенные и нокаутных мышей штаммы могут служить в экспериментальных системах, чтобы проверить механизмы робастно. Тем не менее, несмотря на общее сохранение основного генетического материала, функциональные геномы мышей и людей демонстрируют существенные различия в регуляторных элементов 23. Не удивительно поэтому, что перспективные доклинические исследования на животных моделях иногда не обобщено больных людей. Плацента показывает очень высокое разнообразие межвидовой, таким образом делая модели на животных менее чем идеально подходит для изучения человеческой болезни 24. Признавая как заметные различия в человеческой и мышиной иммунология 25, а ярко выраженный расходящуюся эволюцию в плацентарной анатомии, целесообразно рассмотреть вопрос об использовании бывших естественных культур органов гестационного тканей человека для экспериментального исследования. Описания, фотографические изображения, а также обучающее видео в этом протоколе проинструктировать исследователей накак установить ворсинок и децидуальной органных культур на ECM-покрытием вставками культуры Transwell ткани. Преимущества этого метода включают относительную простоту микро-рассечение и механической системы поддержки Transwell, особенно по сравнению с альтернативными методами, такими как 3D-встроенных матриц или срез органа культур. Приостановление органной культуры на поддержку мембраны позволяет для обмена питательных веществ на всех поверхностях тканей и жизнеспособность поддерживается для кратковременной культуры (96 ч для ворсинок культур, 72 ч для децидуальных культур) .Этот метод позволяет изучать человеческую плацентарную биологии в ткани уровень, несомненно, более биологически значимым, чем модели монослойной клеточной культуры. Самым важным шагом в этом протоколе является микро-рассечение соответствующих ворсинок и децидуальных пьес для органа культуры. Оптимальные кусочки ткани демонстрируются фотографическим способом (рис 2А и 3А) , чтобы помочь ученым , для которыхвизуализация гестационного образцов нового. Особенно важно, чтобы выбрать ворсинчатых деревья, ветви которых заканчиваются в EVT столбцах, так как эти клетки будут мигрировать в ECM и помогают закрепить ворсинки к мембране. Для обоих типов культур органов полезно свести к минимуму нарушения в ткани во время смены носителя пипеткой в ​​тщательной и неспешной манере. Этот метод представляет только минимальные трудности. В некоторых случаях, образцы показывают загрязнение. Заражение, как правило, бактериальную (изредка поли-микробные), и только становится очевидным после 1-2 дней в культуре. После того, как загрязнение наблюдается, отбеливатель должен быть применен, культура отбрасывается, и в тканевой культуре инкубаторе стерилизовать, чтобы предотвратить долгосрочную проблему. Есть несколько возможных путей могут возникнуть загрязнение: внутриутробная инфекция, во время операции, во время уборки урожая / SPECIMEN обработки, или во время технического обслуживания органа культуры. Сбор урожая и обработки шаги являются наиболее вероятное времяи место загрязнения будут введены. Таким образом, важно, чтобы уменьшить количество времени, в течение образец манипулируют во время сбора и микро-диссекции. Это приведет к снижению образца воздействия окружающей, нестерильной среды. В зависимости от лабораторной установки, рассекает микроскоп может быть расположен внутри стерильной капот культуры ткани. Гистопатологическая анализ органных культур после заражения с медицинской точки зрения соответствующего патогена L. моноцитогенес, показан здесь в качестве одного из возможных применений протокола. Иммунофлуоресценции локализация бактерий и иммунных клеток хозяина после инфицирования Урожайность новое понимание человеческой реакции хозяина к патогенам. Децидуальных культуры орган может служить в качестве дополнительного метода экс естественных условиях эксперимента , чтобы изучить данные , полученные от инфекций в естественных условиях мыши, в том числе интригующих отчеты , показывающие дефекты в мышиных децидуальных функций макрофагов обороны 26,27. Кроме того, человек оргН. культуры могут быть использованы в стратегиях смешанных инфекций, таких как конкурентное инокулята , состоящего из нескольких изогенных штаммов L. моноцитогенес. Конкурентное инфекция органных культур является чувствительным способом проверить актуальность факторов вирулентности в организме человека. Одним из ограничений этого метода является жизнеспособность ткани, которая ограничивается кратковременной культуры (96 часов для ворсинок культур, 72 ч для децидуальных культур). Это идеальный вариант для заражения быстро растущих микробов , таких как L. моноцитогенес, но более длинные культуры могут быть необходимы для патогенных микроорганизмов , которые занимают больше времени , чтобы установить и распространять через ткань. Для того, чтобы уменьшить глобальное бремя осложнений беременности, исследования должны сосредоточиться на понимании патофизиологии человека материнской плода интерфейс. Бактериальные, грибковые и вирусные патогены, которые пересекают от матери к плоду причиной разрушительных осложнений беременности и внутриутробной инфекции. Контролируемые в естественных условиях заражения лабораторных аниMals , как правило , считается золотым стандартом для адресации , как патогены колонизировать и транзита между органами 28. Поскольку плацентарная анатомия заметно различается у разных видов млекопитающих, это крайне важно, чтобы включить ткани человека в исследовательских стратегий. Человеческие ворсинчатые и децидуальной органных культур весьма соответствующие модельные системы для расследования хозяин-патоген взаимодействий. Для изучения этого жизненно важного еще плохо изучены орган, исследователи могут воспользоваться изобилием иначе отбрасываются плаценты человека и децидуальных образцов, используя стратегии органной культуры, такие, как описано здесь.

Инфекция и воспаление на границе раздела матери и плода представляет собой основной источник заболеваемости и смертности среди женщин и детей. Понимание того, как патогены заражают этих тканей имеет решающее значение для разработки новых стратегий для профилактики и лечения заболеваний, таких как преждевременные роды и смерть плода. Тем не менее, высокая межвидовая изменчивость интерфейса материнской плода затрудняет экспериментальное исследование. Кроме того, большинство микробные патогены показывают специфичность хозяина, поэтому многие животные модели не могут в полной мере перепросматривать инфекционных заболеваний человека. Некоторые организмы (гемофильная палочка, сальмонеллы брюшного тифа, холерный вибрион, и многие другие) являются строго патогенные для человека, в то время как другие, такие как листерий, показывают более промежуточный уровень принимающей специфичности 1. Принимающая специфичность была зарегистрирована во многих аспектах патогенеза, в том числе колонизации 2, 3, распространение иммунного уклонения от 4 </sвверх&gt;, а также питательных веществ приобретение 5. Таким образом, крайне важно, чтобы выбрать оптимальные модельные системы хоста. Состоящий из клеток плода и материнской крови, плацента является органом , который быстро развивается в течение беременности 6. Проще говоря, человеческая плацента изготовлен из фетальных &quot;ворсинок&quot; древовидных структур купались в крови матери. Газ и питательных веществ происходит обмен через специализированные слои эмбриональных клеток, называемых трофобласта, что линия на поверхности ворсинок деревьев. Матки слизистой оболочки матери, называется эндометрий в небеременных самок, превращает структурно и функционально в децидуальной для размещения фетоплацентарной единицы. Ворсинок деревья закрепляются в матку с помощью extravillous трофобласта (EVT), которые мигрируют из анкерных колонн клеток в децидуальной. Интерфейс матери плоду, поэтому, состоит из децидуальной и плаценты. Техника органной культуры, описанный здесьбыл использован для изучения , где и как клинически значимых человеческих патогенов, включая L. monocytogene s и токсоплазма, проникают через плацентарный барьер 2,7. Эти ех VIVO органных культур репликации в естественных условиях архитектуры ткани, и, возможно , являются физиологически весьма соответствующие модельные системы для человеческого плацентации. Дополнительные методы культуры включают в себя целые эксплантаты органа, дольки органа и ткани или стволовых клеток органоиды, встроенные в 3D-матрицу. Для получения дополнительной информации об этих параметрах, пожалуйста , обратитесь к всеобъемлющему недавнем обзоре 8. Обратите внимание, что этот протокол для отдельной культуры децидуальной и плацентарный ворсинок. Для изучения взаимодействия плацентарных клеток и децидуальными клетками, может быть предпочтительным метод совместного культивирования. Мы отсылаем заинтересованного читателя к ранее описанным ворсинок-децидуальный техники совместного культивирования, используемой исследователей , изучающих трофобласта опосредованной децидуальных ремоделирования сосудов 9-11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Sterilization pouches</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">01-812-54</td>
			<td style="width:167px;">For autoclaving individual dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Fine mesh strainer</td>
			<td style="width:71px;">Cuisinart (Amazon.com)</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Carboy with spigot</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-007-647</td>
			<td>For large volume preparation of Wash buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ice packs</td>
			<td style="width:71px;">Nortech labs</td>
			<td style="width:119px;">GB8818</td>
			<td>These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">V1001</td>
			<td>70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">10% Bleach</td>
			<td style="width:71px;">Waxie Sanitary Supply</td>
			<td>CLO 30966</td>
			<td>10% solution made by adding dH20.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Light Box</td>
			<td style="width:71px;">Litebox Lumina (dickblick.com)</td>
			<td style="width:119px;">55305-2009&#160;</td>
			<td>Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Micro dissecting forceps&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Stoelting&#160;</td>
			<td style="width:119px;">52102-43</td>
			<td>4in, 1x2 0.5mm, Slight Curve</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Micro dissecting forceps</td>
			<td style="width:71px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">52102-06</td>
			<td>4in, Straight Fine, Sharp</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Micro dissecting vannas spring scissors</td>
			<td style="width:71px;">Stoelting&#160;</td>
			<td style="width:119px;">52130-01P</td>
			<td>McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5cm, 0.33 Tip, Slight Curve</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">MZ16 or M60</td>
			<td>We have had success with the listed models.&#160; External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">CLS4558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:71px;">Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">10010023</td>
			<td>We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:71px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">P0195</td>
			<td>For preparation of Wash buffer we use 10X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham&#39;s) with GlutaMAX</td>
			<td style="width:71px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">10565-018</td>
			<td>We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:71px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15710072</td>
			<td>1000X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 &#176;C to avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100X stock.&#160; Recommend to prepare and store aliquots at -20 &#176;C to avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:71px;">Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td>500X stock.&#160; Recommend to prepare and store aliquots at -20 &#176;C to avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">progesterone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8783</td>
			<td>A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 mL Ethanol and adding 34.3 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17&#946;-estradiol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2758</td>
			<td>A 10 &#956;M stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 mL ethanol and adding 40 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Bottle-top vaccum filter (0.22 &#956;m)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">CLS430769</td>
			<td>For sterile filtration of Collection media after preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">6-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:71px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353224</td>
			<td>Polystyrene, Tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">6-well transwells&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PICM03050</td>
			<td>Insert - 30mm diameter, 0.4&#956;m pore size hydrophilic PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix)</td>
			<td style="width:71px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354234</td>
			<td>We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 &#176;C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 &#176;C, and prepare ~300&#956;L aliquotsin the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 &#176;C.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">30525-89-4</td>
			<td>For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Tissue culture incubator, maintained at 37 &#176;C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For some experiments, hypoxia may be preferred.&#160; This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bench top centrifuge</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human placental and decidual organ cultures to study infections at the maternal-fetal interface

Плацента показывает большую степень межвидовых анатомической изменчивости. Чтобы лучше понять биологию и патофизиологии плаценты человека, крайне важно разработать эксперименты с использованием человеческих клеток и тканей. Преимуществом органной культуры является обеспечение трехмерной (3D) структурной организации и внеклеточного матрикса. Цель метода , описанного здесь успешное создание бывших естественных культур органов гестационный тканей человека и их поддержания здоровой культуры в течение 72-96 часов. Протокол детализирует немедленную обработку исследований-дал согласие, плацентарного и децидуальных образцов свежей из операционной. Это обильные образцы, которые в противном случае будут отброшены. Подробные инструкции по стерильного сбора этих образцов, в том числе морфологическими подробную информацию о том, как выбрать подходящие ткани для создания 3D культуры органов, обеспечивается. Плацентарные ворсинчатые и децидуальной ткани микродиссекции на 2-3 мм 3 шти размещены отдельно на матричных подкладке Transwell фильтров и культивировали в течение нескольких дней. Ворсинок и децидуальной органных культур хорошо подходят для изучения взаимодействия хозяин-патоген человека. По сравнению с другими модельных организмов, эти человеческие культуры являются особенно предпочтительными для изучения механизма инфекции патогенов, демонстрирующих вариабельные паттерны принимающей специфичности. В качестве примера, мы демонстрируем инфекцию плацентарных и децидуальных культур органов с клинически значимых, факультативных внутриклеточных бактериальных патогенов листерий.

Рисунок 1 (модифицированный от Зельдовича &amp; Бакырджиева 22) диаграммы соответствующей плацентарного и матки анатомии. Рисунок 2 показывает репрезентативную брутто и гистологические изображения плацентарной ворсинок, а на рисунке 3 демонстрирует децидуальной ткани. Этот протокол описывает первый сбор свежей плацентарного и децидуальной ткани в больнице или клинике. Собранный образец представляет собой смесь плода плацентарного (ворсинки) и компонентов материнской матки (децидуальной). После промывки буфером, содержащим антибиотики широкого спектра действия и имидазола, весь образец проверяется на глаз с помощью светового короба. Вили и децидуальной помещены в отдельные пробирки и транспортируют на льду в лабораторию. В лаборатории рассекает микроскоп используется, чтобы оценить тонкие Морфологические особенности здоровой ткани. Типичные фотографииворсинок (рис 2А) и децидуальной ткани (Рисунок 3A) , которые были приобретены с рассекает микроскопом с двумя внешними источниками света гусиная приведены для справки. Ворсинок культуры органов формируются из первых образцов триместра. Культуры состоят из маленьких концевых ворсинок деревьев с 2-6 ветвями. Важно, чтобы рассекать ворсинчатых ветви, которые оканчиваются в extravillous колонках трофобласта и хорошо развитую сосудистую сеть. Эти функции рассматриваются как &quot;пушистые&quot; или &quot;пушистых&quot; концах ветвей (наконечники стрел) и слабый розовый к красный оттенок линейного , которая проходит через ветви дерева слева на рисунке 2А. В противоположность этому, васкулатура и extravillous трофобласты не легко визуализированы дереве справа от этого образа, который был бы неоптимальным для культуры. За первый день культуры, extravillous трофобласты мигрируют в ECM, тHUS якорь ворсинчатого деревья в матрицу на Transwell. Децидуальных культуры органов формируются из первого и начале второго триместра образцов. Весь слизистую оболочку матки превращается в децидуальной вскоре после имплантации. Более конкретно, децидуальной базального определяет слизистой оболочки матки непосредственно лежащие в основе сайта плацента / имплантации, децидуальной capsularis определяет слизистая оболочка, закрывающая плод, и децидуальной parietalis относится к остальной части слизистой оболочке матки. Визуализация под рассекает микроскопом показывает , что ранний гестационный образец состоит в основном из децидуальной parietalis и децидуальной capsularis (слева и фрагменты тканей правого, соответственно, на фигуре 3А). Децидуальной capsularis легко отличается своим тонким мембранным природы. Для культур органов, децидуальная parietalis обрезается до 3 мм 3 фрагменты с микро-рассечение ножницами и адгезиваренда сгустками крови удаляется пинцетом. После инкубации в течение ночи, ткани заражены L. моноцитогенес. Протокол инфекция , описанный выше, основан на анализе защиты гентамицина используется для изучения внутриклеточного роста и распространения факультативных внутриклеточных бактерий 16. Органные культуры в среде с антибиотиком бесплатно инкубируют с L. моноцитогенес в течение 5 часов. Культуры промывают стерильной PBS для удаления бактерий из среды. После этого Гентамицин добавляется устранить внеклеточные микроорганизмы. До литературы из нашей лаборатории использовали иммунофлюоресценции и конфокальной микроскопии для определения локализации бактериальной ткани в различные моменты времени после заражения 2. Органные культуры ополаскивают в PBS, фиксировали в 4% параформальдегида, и замороженном встраиваемый в ОСТ среде и хранили при -80 &amp; deg; С, или парафин и хранить при комнатной температуре. Срезы ткани могут быть STAIned для иммунофлуоресценции (IF) или иммуногистохимического (IHC) анализа бактерий и локализации эукариотических клеток. Рисунок 2B является представителем IF изображение замороженных срезов , полученного из 8,3 недели ворсинок органной культуры в 72 часа после заражения. Обратите внимание на тяжелую бактериальную нагрузку (зеленая флуоресценция) в EVTs на концах ветвей ворсинок, а также относительное отсутствие бактерий внутри (красная флуоресценция) слоя дерева подкладка syncytiotrophoblast. В предыдущей работе мы использовали аналогично IF окрашивания для локализации L. моноцитогенес в ворсинчатыми органных культурах в разные моменты времени после заражения. В течение 72 ч, распространения инфекции от ЭВТ в суб-синцитиальный cytotrophoblasts и подстилающей ворсинок стромы. Следует отметить, что synyctiotrophoblast слой был устойчив к инфекции 2. Типичные легкие микроскопические изображения H &amp; E-окрашенные срезы децидуальной ткани залитых парафином получают из 14,3 недели specimeнс, показаны на фигурах 3B и 3C. Этот ЕСМ покрытием Transwell мембрану погружали , чтобы показать органной культуры на месте (фигура 3В). Изображение показывает эпителиальные подкладке железы (звездочка) и эндотелиальной подкладке васкулатура (алмаз) расположены гетерогенно в децидуальной стромальных клеток отсека. Кроме того, существуют материнские иммунные клетки, разбросанные по всей децидуальной стромы с переменной плотностью. ВВК и ЕСЛИ окрашивание может быть использовано для определения локализации бактериальной микроанатомической, по отношению к иммунных клеток, специфических резидентных. В качестве примера, CD14 + макрофаги (зеленая флуоресценция) локализуются в подкладке и сосудистую разбросаны в строме (рис 3D), в то время как крупные агрегаты L. моноцитогенес (красная флуоресценция) наблюдаются преимущественно в децидуальной стромы через 48 часов после заражения (рис 3D). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"ВОК: Keep-с-next.within-странице = &quot;всегда&quot;&gt; <tbody><tr><td> буфер Wash </td><td> Коллекция среда </td><td> ворсинок среда </td><td> децидуальных среда </td></tr><tr><td> PBS </td><td> DMEM / F-12 с GlutaMAX </td><td> DMEM / F-12 с GlutaMAX </td><td> DMEM / F-12 с GlutaMAX </td></tr><tr><td> Пенициллин 100 МЕ / мл </td><td> Фетальной бычьей сыворотки 2,5% </td><td> Фетальной бычьей сыворотки 20% </td><td> Фетальной бычьей сыворотки 2,5% </td></tr><tr><td> Стрептомицин 100 мкг / мл </td><td> Пенициллин 100 МЕ / мл </td><td> Пенициллин 100 МЕ / мл </td><td> 17β-эстрадиол 300 пг / мл </td></tr><tr><td> Гентамицин 50 мкг / мл </td><td> Стрептомицин 100 мкг / мл </td><td> Стрептомицин 100 мкг / мл </td><td> Прогестерон 20 нг / мл </td></tr><tr><td> Амфотерицин 1,25 мкг / мл </td><td> Гентамицин 50 мкг / мл </td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;<html> / TD&gt; <td> Амфотерицин 1,25 мкг / мл </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 1:. СМИ рецепты Компоненты и концентрации для приготовления промывочного буфера, среды сбора, ворсинок среды и децидуальной среды. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54237/54237fig1.jpg" /> Рисунок 1. Структура плацентарный. (А) Структура фетоплацентарного единицы в материнской утробе, (B) Увеличение в окне (A) подчеркивает , что фетальный трофобласт (Т) на подкладке плацентарные ворсинки купаются в материнской крови и закреплены в децидуальной путем extravillous трофобласты (EVT). Содержится в ворсинки являются эмбриональные сосуды (FV), фибробласты и макрофаги плода. Модифицированный от Зельдовича и Бакырджиева 22.<html> &quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54237/54237fig2.jpg" /> Рисунок 2: ворсинок органных культур - представитель Гросс и микроскопические изображения (A) Два концевых ворсинчатые деревьев с гестационного возраста 6 недель, как видно под микроскопом рассекает.. Обратите внимание на &quot;пушистые&quot; концы (наконечники стрел) и видную плода сосудистую пронизала ветвей дерева слева, которые делают этот кусок подходит для органной культуры. (B) Иммунофлуоресценции микроскопия органной культуры (гестационный возраст 8,3 недели) 72 ч после заражения листерий, выделяя тяжелую бактериальную нагрузку [зеленый] в extravillous трофобласта. DAPI показаны синим цветом, и βHCG + syncytiotrophoblasts в красном цвете. Масштабные полоски = 1 мм (A), 250 мкм (Б).7 / 54237fig2large.jpg &quot;целевых =&quot; _blank &quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54237/54237fig3.jpg" /> Рис . 3: децидуальных органной культуры - представитель грубых и микроскопических изображений (A) децидуальной parietalis [Влево] и децидуальной capsularis [право] на гестационного возраста 6 недель, как видно под микроскопом рассекает. (B) H &amp; E-окрашенных раздел 14.3 за неделю гестационный возраст децидуальной parietalis органной культуры показывает железы и сосудистую сеть организованных неоднородно на протяжении децидуальной стромы. (Алмаз, ◆) и (звездочка, *) выделить представительную сосуд и железу, соответственно. Коричневый цвет линии на нижнем крае является Transwell мембрана, на краю. (C) H &amp; E-окрашенных участок 14,3 недели гестации децидуальной parietalis органной культуры при большем увеличении гemonstrates мышечной слойных спиральных артериол, внедренных в децидуальной стромы. Материнские клетки иммунной системы маленькие с темными круглыми ядрами и неравномерно распределены по всей строме. (D) Иммунофлуоресценции микроскопия органной культуры 48 ч после инфицирования L. моноцитогенес, выделяя большие зоны бактерий [красный] в децидуальной стромы, а материнская CD14 + макрофаги [зеленый] подкладка извилистый сосудистое пространство и разбросанные в строме. Масштабные полоски = 1 мм (А), 250 мкм (В), 50 мкм (C и D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54237/54237fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54237/54237fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54237/54237fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface at JoVE.com

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Простой метод для установления первичной плацентарной (ворсинок) и децидуальной культуры органа описано. Ворсинок и децидуальной органных культур являются бесценными инструментами для изучения патогенеза у человека материнской плода интерфейс. Инфекция с факультативным внутриклеточным бактерий листерий демонстрируется.

Человеческие Культуры плацентарной и децидуальной Орган по изучению инфекций на материнской плода интерфейс

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Экспериментальная модель для изучения Туберкулез-малярией Коинфекция на естественной передачи Микобактерии туберкулеза И Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanized мышь моделью для изучения Бактериальные инфекции Ориентация микрососудов

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Выделение моноцитов человека, дважды градиентного центрифугирования и их дифференциации с макрофагами в тефлоновым покрытием культуре клеток Сумки

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Выделение лейкоцитов из интерфейса человека матери и плода

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Выделение лейкоцитов из мышиного тканей на матери и плода интерфейс

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Методы для изучения липидных изменений в нейтрофилах и последующее образование нейтрофильных внеклеточных ловушек

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Методика изучения горизонтальных генного переноса в<em&gt; Стафилококк</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Модель WinCF - недорогой и увлекательный микрокосм слизистой бронхиолы для изучения микробиологии легких

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Сверхэкспрессия и очищение человека<em&gt; Cis</em&gt; -пренилтрансфераза в<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...