Name: nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury
Uploaded: 2016-07-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH Zuschusses DP2OD008470 unterstützt. Zusätzlich RAM wurde von Fonds, die von der University of Notre Dame Graduate School zur Verfügung gestellt teilweise unterstützt. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften, das Zentrum für Zebrabärblinge Forschung, und das Zentrum für Stammzellen und regenerative Medizin an der University of Notre Dame. Wir danken vor allem den Mitgliedern des Labor für Diskussionen über Nieren Biologie und ihre hilfreichen Feedback zu dieser Arbeit engagieren.

Die Verfahren für die Arbeit mit Genaktivität in diesem Protokoll beschrieben wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Notre Dame genehmigt. 1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Machen Sie eine 50x Stammlösung von E3 Embryo Medium durch Mischen von 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl 2 und 9,95 g MgSO 4 in 5 l destilliertem Wasser, und lagern bei RT. </li><li> Für die Kultivierung von Genaktivität verdünnen 50x Stammlösung von E3 Embryo Medi...

Eine vielfältige Anzahl von therapeutischen Wirkstoffen wurden mit AKI 29 verbunden. Es wurden von vielen einzelnen Verbindungen, wie das Aminoglycosid Gentamicin 30 und dem weit verbreiteten chemotherapeutischen Cisplatin induzierte Schäden beim Verständnis 31,32 signifikante Fortschritte in der Forschung gewesen. Einige pathologische Veränderungen dieser Bedingungen beteiligt sind, bleiben jedoch Gegenstand der laufenden Studie. Ein entstehender Herausforderung bleibt das Verständ...

AKI ist ein abrupter Verlust der Nierenfunktion , die 1 bis verheerenden gesundheitlichen Folgen führen kann. AKI ist ein bedeutendes Gesundheits Problem weltweit aufgrund seiner hohen Inzidenz von etwa 20% bei Patienten im Krankenhaus, mit noch höheren Raten von 30-50% in kritischen Pflegefälle und ältere Menschen, und die Sterblichkeitsrate von 50-70% 1-3. Leider hat sich die Prävalenz von AKI zugenommen und wird voraussichtlich weiter über die nächsten zehn Jahre zu eskalieren, zum Teil aufgrund der Vielfalt der Faktoren, die AKI auslösen können, zu denen die postoperative Belastung, Ischämie und Exposition gegenüber Nephrotoxinen wie Antibiotika und chemotherapeutischen Arzneimitteln 4. AKI beinhaltet plötzliche Zellschäden in der Niere, die gemeinhin in Nephronen auftretenden, die die wesentlichen Funktionseinheiten sind, und aus einem Blutfilter und einer segmentierten tubule umfasst , die Urin in den zentralen Sammelrohre 1 entwässert. Wenn eine erhebliche Anzahl von Nephronen sindwährend AKI beschädigt, sind die unmittelbaren Auswirkungen einer Unterbrechung in der Abfall Clearance aus dem Kreislauf und reduziert oder außer Kraft gesetzt Fluidstrom durch Nephronen durch Obstruktion von toten und sterbenden Zellen 1. Im Laufe der Zeit können Rohr Behinderung zu einer Degeneration des gesamten Nephronen führen, die 1 Nierenfunktion reduziert dauerhaft. Physiologische Veränderungen in der Niere folgenden AKI beinhalten auch komplexe entzündliche Ereignisse , die zu chronischen Vernarbung 1 führen kann. Trotz dieser Ergebnisse haben Nephronen gewisse Fähigkeit Regeneration nach AKI zu unterziehen, die die Tubulusepithel 5,6 rekonstituiert. Zwar gibt es eine wachsende molekulare Verständnis von nephron Regeneration gewesen ist, bleiben die Mechanismen schwer in vielerlei Hinsicht und erforderlich machen Untersuchung 7 fortgesetzt. Das Ausmaß, in dem AKI führt zu einer dauerhaften Nierenschädigung bleibt ebenfalls unbekannt. Die aktuelle Forschung deutet darauf hin, das regenerative Potenzial für die Niere ist diehöchste folgenden weniger schwere Fälle von AKI, während ausgeprägter oder wiederholte Episoden zu einer chronischen Nierenerkrankung (CKD) führen und in Nierenerkrankung im Endstadium (ESRD) , die lebensrettende Transplantation oder Dialyse erfordert 8,9 gipfeln. Darüber hinaus Personen , die bereits von CKD leiden , sind zu einem noch höheren Risiko von 8,9 eine schwere Folge von AKI Vertrags. Zusammengenommen ist es klar, dass die weitere Grundlagen- und klinische Forschung zu verstehen, von entscheidender Bedeutung ist, zu behandeln und AKI verhindern. Forschung mit Tiermodellen hat in Würdigung der Progression der lokalen und ökologischen Veränderungen beigetragen , die während der AKI 10 auftreten. Um dieses Verständnis zu erweitern sowie die Entwicklung neuer Therapien, die Zebrabärbling Tiermodell wurde in einer Vielzahl von Möglichkeiten 11,12 eingesetzt. Die Nephronen der Zebrabärbling Niere, sowohl im Embryo und Erwachsenen zeigen einen hohen Grad an Konservierung bei Säugetieren 13-16. Ferner nephron epithelialen Verletzungen in zeFisch - ähnelt dem Prozess bei höheren Wirbeltieren, wobei die lokale Zerstörung von röhrenförmigen Zellen durch intratubulären Proliferation und Wiederherstellung der nephron Architektur 17-19 folgt. Im Embryo ist jedoch umfangreiche Röhrchens Schaden von den Nephrotoxinen wie Cisplatin im Zusammenhang mit Letalität 20,21. Zum Vergleich: überleben Zebrabärbling Erwachsene AKI und zeigen materielle regenerative Fähigkeiten in der Niere. Zum Beispiel, um das Aminoglykosid - Antibiotikum Gentamicin nach der Exposition, Zebrabärbling Röhrchens Epithelschädigung regenerieren und neue Nephron - Einheiten sowie 22-24 wachsen. Während diese Gentamicin-induzierten AKI Studien wertvolle Informationen zur Verfügung gestellt haben, Nierenschäden aus verschiedenen Nephrotoxinen Verständnis bleibt entscheidend , um die Auswirkungen und die Reaktion auf verschiedene Arten von Schäden 25 zu schätzen. Der Zebrafischembryo, aufgrund seiner Größe, Transparenz und genetische Lenkbarkeit, hat viele Vorteile für Nephrotoxin Studien &lt;sup&gt; 25, wobei das Verfahren der Mikroinjektion 20,21 verwendet, um das Molekül (e) für die Untersuchung zu verabreichen. Nephron werden von 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und beginnen zu filtern Blut von etwa 48 HPF 26,27 gebildet. Somit erleichtert die schnelle Bildung und Funktion der embryonalen Nieren experimentellen Analyse. Allerdings hat der Prozess der Mikroinjektions technischen Herausforderungen, und es kann eine steile Lernkurve zu Beherrschung der Technik sein. In diesem Video-Artikel beschreiben wir, wie Mikroinjektionen durchführen und Tipps zur Fehlerbehebung, um die Rate der erfolgreichen Injektionen bieten zu verbessern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:129px;">AB01915</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;(microinjection tray) 150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micrometer</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>2280-24</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

Die Nieren sind anfällig von der Exposition zu schädigen zu Chemikalien, die sie aus dem Blut zu filtern. Dies kann mit einem raschen Rückgang der Nierenfunktion und die Entwicklung des klinischen Syndrom bekannt als akute Nierenschädigung (AKI) in Verbindung zu Organschäden führen. Pharmakologischer Mittel verwendet, um medizinische Bedingungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen zu Krebs reichen, wenn sie einzeln verabreicht werden oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen, kann AKI initiieren. Zebrabärbling sind ein nützliches Tiermodell die chemischen Wirkungen auf die Nierenfunktion in vivo zu untersuchen, da sie eine embryonale Niere Nephron Funktionseinheiten besteht bilden , die mit höheren Vertebraten konserviert sind, einschließlich Menschen. Ferner kann Zebrabärbling genetische und chemische Bildschirme auszuführen verwendet werden, die Möglichkeiten bieten, um die zellulären und molekularen Facetten AKI aufzuklären und therapeutischen Strategien wie die Identifizierung von Molekülen nephroprotektive entwickeln. Hier zeigen wir, wie die Mikroinjektion in dieZebrafischembryo kann als Paradigma für Nephrotoxin Studien genutzt werden.

Ein Mikroinjektionsstation eingerichtet umfasst eine Stereo, Mikromanipulator und Druckregler (1A). Durchleuchtung der Einspritzplatte ist bevorzugt , Proben während dieses Verfahrens (1B) anzuzeigen. Herstellung der Injektionsnadel umfasst das Ziehen des entsprechenden Borsilikatglas, gefolgt von der Kante der Vorbereitung mit Schneiden und schließlich die Nadel Backloading. Optimalerweise wird die Nadelspitze abgeschrägt anstatt stumpf (1C),...

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Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury (Video) | JoVE

Renal Verletzungen von Nephrotoxinen entstehen, die Medikamente im Bereich von Antibiotika zu Chemotherapeutika gehören, können in komplexen Erkrankungen, deren Pathogenese zur Folge bleibt unvollständig verstanden. Dieses Protokoll zeigt, wie Zebrabärbling für Krankheitsmodelle dieser Bedingungen verwendet werden, die zur Identifizierung von renoprotektive Maßnahmen angewendet werden können.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Research

JoVE Journal

Biology

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish (Video) | JoVE

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Forschung

Biologie

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. (Video) | JoVE

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function (Video) | JoVE

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury (Video) | JoVE

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish (Video) | JoVE

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c (Video) | JoVE

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney (Video) | JoVE

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle (Video) | JoVE

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult Zebrafish (Video) | JoVE

Gavaging Adult Zebrafisch

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney (Video) | JoVE

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...