Name: use of a battery of chemical and ecotoxicological methods for the assessment of the efficacy of wastewater treatment processes to remove estrogenic potency
Uploaded: 2016-09-11T14:00:00
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Projects presented in this paper were funded by Severn Trent Water and Brunel University London. The authors would like to thank Alan Henshaw and John Churchley for providing field and laboratory assistance. T.J.C. thanks the Heinz Endowments for support. M.R.M. thanks the Steinbrenner Institute for a Steinbrenner Doctoral Fellowship and Carnegie Mellon University for a Presidential Fellowship.

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	<li>Bergman, &. #. 1. 9. 7. ;., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-science+of+endocrine+disrupting+chemicals.">State-of-the-science of endocrine disrupting chemicals.</a> Toxicol. Lett. 211, (2012).</li><li>Rodgers-Gray, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+juvenile+roach+(Rutilus+rutilus)+to+treated+sewage+effluent+induces+dose-dependent+and+persistent+disruption+in+gonadal+duct+development.">Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development.</a> Environ. Sci. 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The authors have nothing to disclose.

废水处理厂是用EDC地表水污染的主要途径。去除常规的，先进的或新出现的治疗过程的内分泌活性的效力的评估需要使用的各种化学和生物测定的。用非靶向和靶向分析化学分析提供了关于除去各组分的功效的定性或定量的数据，因此，允许对环境质量标准生产或预测分析的化合物或化合物的混合物无影响浓度的评估。 从下面的治疗和未知的生物活性成分的废水中存在的物质的不完全矿化所得转化产物的产生限制单独化学测试是有用的。 A 在体内和体外生物测定结合分析化学家组合RY筛选提供了一个有用的工具箱新兴废水处理过程，以确定的EDC去除的效力。这些测试时，除了传统的水质参数和其他毒理学和微生物学终点进行允许现有和新兴的废水处理技术的一个重要的评价。 要注意的是酵母基于雌激素的屏幕（ 例如 ，是）是很重要的并不是唯一的体外测定，以确定化学品和废水的雌激素效能。一些稳定转染基于哺乳动物细胞的测定法，已经开发过，对ER-CALUX 27和与人乳腺癌细胞或子宫颈肿瘤细胞hERα-的HeLa-9903 28分别为例子。的是已经相比类似哺乳动物基于细胞的测定法，并已发现具有可重复性的一个可比较的水平高，真阳性和真阴性雌激素的识别率29本书虽然啊它有时被认为是稍微较不敏感的27。基于酵母报告分析的一个优点是，在不与哺乳动物细胞培养显著经验的实验室的是，可以更容易地通过，因为它需要较少的严格的生物控制措施和无菌技术（可置于工作台顶部，如果必要，可以进行是） 。人细胞为基础的分析也需要的 CO 2孵化器和光度计相比，在是使用的标准培养箱和酶标仪。两个基于酵母的雌激素记者分析（YES， 酿酒酵母和A-YES，Arxula adeninivorans）的ISO 19040的认证目前正在实验室间的小径“水质-水和废水的雌激素潜在的测定”突出产业在这些技术的兴趣。 有一些所描述的方法的局限性，其中包括的潜在的污染的采样，样品存储和分析来自现场或实验室环境或人类污染（ 例如，增塑剂，表面活性剂，个人护理产品）始发雌激素作用物质中的样品。这种类型中的YES测定（或其他基于细胞的报告分析）污染将提升的背景和影响使用该测定的。存储在塑料瓶的水样或溶剂极易造成假阳性。假阴性也备受关注既是LCMS / MS和YES检测要求SPE到雌激素到集中检测水平。基质中，SPE吸附剂和洗脱溶剂的选择可影响萃取效率和类型洗脱化合物。使用C18 SPE柱，使用在此协议中描述的条件可以产生负偏压的提取，作为高极性和碱性化合物会通过吸附剂进行很差保留。此外，该协议要求从甲烷洗脱YES洗脱液重建醇通过蒸发乙醇至干产生挥发性化合物的损失出资者氮。其结果是该协议可以提供低估测试的样品的雌激素活性。考虑到是检测未知的或意外的化合物可能会被错过，因为他们没有被提取或他们因蒸发而丢失时，这些限制是特别重要的。此外，LCMS / MS技术利用了内标来校正恢复;这种方法不能与YES测定中使用。 体内流出物的测试显著局限性包括相比体外方法进行评估所需的高成本和时间。目前使用的鱼胚胎试验检测雌激素活性是有限的。然而，已经有了一些成功的生产雌激素反应转基因发光斑马鱼胚胎30，这可能会对未来的应用。黑头呆鱼（在此protoc使用醇）是一种常见的实验室物种和VTG诱导雄性鱼是雌激素暴露的证据充分的生物标志物和废水流出物雌激素22或其它的雌激素化合物或其混合物31的量化度量。对内分泌干扰物质的OECD测试规定已使用成人黑头呆鱼，青鳉日本和斑马鱼32,33验证，与VTG是在所有三种雌激素暴露的敏感生物标志物。然而，VTG感应不直接相关的生殖障碍，因此废水曝光的生态后果，如严重雌雄同体蟑螂3所示。在另一方面，蟑螂是不是生态毒理学研究的一个经典的“实验室物种，由于其大尺寸，长的生成时间（2 - 3年才能达到性成熟），生殖风格;组产卵（繁殖）发生一年一次，难识别从女性的男性（比在其他产卵季节）。然而，这通常雌雄异体物种已被很好的研究在英国，这是因为雌激素废水排放的下游，雄鱼展出扰动他们的内分泌（ 例如 ，在他们的血液女性特有的卵黄蛋白原的存在）和组织病理学（ovotestes发现-开发鸡蛋睾丸和/或女性生殖管道）5,6。因此，这些协议的应用前景，罗奇（或类似物质）可能是一个有益的野生物种定点显示，如果废水质量（并降低雌激素）真正的改善河流接受先进的污水处理被看见。它们也可以在配管系统的端部来监视从试验规模的工厂7技术上改进的废水。当考虑在体内废水评估要使用的物种有相对快速和受控的测试用实验室物种之间的折衷相比长场为主，但更多的环境有关​​，使用本地物种进行测试。然而，这种在体内的评价是成本高，只应视为最后一组使用以下化学分析评估，试验和体外试验。 所述的协议中的关键步骤包括制备和样品和玻璃器皿的处理（ 即，瓶和取样设备应用适当的表面活性清洁剂预先处理），以避免从环境污染物包括限制样品接触与塑料和样品的污染能产生误报的其他材料。设计和构建水族馆鱼曝光系统时，这是非常重要的。理想的情况是水族馆（住宅存量和期间暴露）应从材料建成具有低吸附32以最小的污染风险。不锈钢可以用于流出物或水储水槽。而一个玻璃结构的坦克是优选的鱼缸（因为这也提供了鱼便于观察）。使用低等级塑料管或管道的，应避免32，PVC 34和ABS可以当&#39;适当调味&#39;被使用， 即，留在运行稀释水中至少12小时，使用前以浸出任何污染物。医用级硅管已经在我们的蠕动泵输送化学品和废水/稀释水的坦克工厂成功应用。除了考虑建筑雌激素污染和养殖系统的运行，它考虑鱼的饮食也很重要;许多鱼类礼仪食品已被认为是雌激素对鱼类。因此它来测试任何食物为活动（ 例如 ，在酵母雌激素屏幕，查看贝雷斯福德等人 14）在这些类型的研究使用它们之前是重要的。 故障排除的描述，如果质量保证样本，包括多个行程，实验室和溶剂空白分析一起阳性对照和实际样品，以消除假阳性和假阴性结果是简化了化学分析或YES测定协议。正（ 例如 ，EE2）和负极（稀释仅水）控制应也总是在体内测定可用于证实预期生物标志物或端点（ 即 ，VTG或组织病理学）的灵敏度，并且允许任何意外污染待检测（ 例如，从实验装置，饮食，或稀释水域）。在协议的任何修改之前应进行任何研究来验证。 与进入通过污水处理厂的污水对环境的雌激素化合物的更严格的法规它是设想更有效的污水处理技术将需要开发。在这个手稿中描述的测试电池恭维生态毒理学和化​​学评估测试通常用于污水处理厂的污水排放。因此，这种类型的测试应使废水技术开发商与设备操作员，整体的电池的应用前景实行最生态安全设计考虑的最佳方法同时删除特定的调节雌激素类化学和整体的生物活性。

关于内分泌干扰物对野生动物的生殖健康产生不利影响的担忧已导致欧盟在水框架指令（WFD）“观察名单”上放置两个雌激素物质（雌二醇和炔雌醇）。 EDC包括各种化学类，包括天然和合成的类固醇的雌激素，药物，杀虫剂和工业化学品和消费产品上的野生动物已知的不利影响的成分的。这些化合物的一些可能潜在地影响人类健康1。 有研究表明，污水处理厂的污水是雌激素对鱼类2并因此很多受纳水体也雌激素对鱼类3。这是首先通过在英国的全国调查表明，野生雄鱼的血液和前期高位表明卵黄蛋白原增加浓度（女卵黄蛋白前体4）阴阳的价（发展雄鱼睾丸鸡蛋和/或女性生殖管道）的正常雌雄异体鱼种5,6。 传统的污水处理通常是由经过初步筛选后一级和二级处理从而消除溶解和悬浮有机物的一个三阶段的过程。除去个别的EDC的功效依赖于物质的物理化学性质和所采用的治疗方法的有效性。对于通过吸附和生物降解许多EDC去除可以显著，但不完整的。三级处理，如砂滤，可在采用先进的氧化（例如臭氧）增加，而先进的治疗EDC拆除7有效或活性炭能有效地接近完全去除7实现。 任何新技术的污水处理NEE评估DS确定EDC除去所提出的方法的功效。测试，包括有针对性的化学分析毒理学一起测试， 使用体内和体外生物测定的电池，为此提供了全面的数据。虽然监管是非常有用的，有针对性的化学分析只能提供有关监测化合物（和具体的代谢物）数据。生物测定另外允许的副产品代谢物和治疗产生的废水变换的不利影响，否则将被未被发现-8,9-“检测”。本文介绍了使用化学和生态毒性实验室检测的电池的评估除去原油的雌激素效力和处理后的污水和受纳水体的一些先进和新兴的污水处理工艺的功效。

use of a battery of chemical and ecotoxicological methods for the assessment of the efficacy of wastewater treatment processes to remove estrogenic potency

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in a watch list of environmental pollutants under the European Water Framework Directive. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. Much of the estrogenic potency of wastewater treatment plant (WWTP) effluents can be attributed to the discharge of steroid estrogens including estradiol (E2), EE2 and E1 due to incomplete removal of these substances at the treatment plant. An evaluation of the efficacy of wastewater treatment processes requires the quantitative determination of individual substances most often undertaken using chemical analysis methods. Most frequently used methods include Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS/MS) or Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM). Although very useful for regulatory purposes, targeted chemical analysis can only provide data on the compounds (and specific metabolites) monitored. Ecotoxicology methods additionally ensure that any by-products produced or unknown estrogenic compounds present are also assessed via measurement of their biological activity. A number of in vitro bioassays including the Yeast Estrogen Screen (YES) are available to measure the estrogenic activity of wastewater samples. Chemical analysis in conjunction with in vivo and in vitro bioassays provides a useful toolbox for assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to estrogenic endocrine disrupting compounds. This paper utilizes a battery of chemical and ecotoxicology tests to assess conventional, advanced and emerging wastewater treatment processes in laboratory and field studies.

试图了解的改进废水处理过程的影响或确定最合适的技术在现有污水处理厂相对于除去排出废水的内分泌干扰活性的功效加装设备作为三级处理，不仅需要键化学的测定即进入工作，但需要分解产物也可以具有内分泌干扰活性的分析组件。在生活污水流出物，目前最雌激素物质是类固醇激素，雌酮（E1），17β雌二醇（E2）和17α炔雌醇（EE2）5,8。类固醇的雌激素主要从体内排出作为非活性结合物16,17的混合物。这些结合雌激素基本上在污水处理系统由细菌活动deconjugated和污水处理厂发生进一步退化。该deconjugated AR类固醇e。通过吸附从废水流中去除污泥或导致形成二次处理过程中降解，首先改造的副产品，并最终完全矿化可能发生的初始​​活性组分。的流出流中的所有单个化合物的化学分析将是困难的，耗时的和昂贵的，并且不会涵盖存在于样品中未知的活性成分。此外，各成分的雌激素贡献的总和将只提供所分析的化合物的样品的累积雌激素效力的指示。这是转化过程产生未知的雌激素物质或者其中流入是工业来源的风险。 在体内 和体外生态毒理学生物测定组合化学分析提供了在混合物如处理过的污水中的溶液到未知的雌激素组分的存在， 在体外测定，如酵母雌血肌酐EEN（YES），已被广泛用于确定污水流出物的雌激素活性，并帮助识别处理的样品8,18,19的活性成分。然而， 在体内的体外试验比较可以显著11，新工艺相对于治疗内分泌干扰效能的综合评估，需要化学和生态毒理学测试电池。 可使用随后的样品的提取，浓缩和分析前提取物的清理化学分析来实现的个别处理厂或过程是否从废水流中除去活性化合物A的确定，使用LCMS（/ MS）或GCMS最多进行（/ MS）的方法。从化学分析获得的数据可以被用来确定是否符合个别预测无影响浓度（PNEC）20或环境质量标准S（EQS）特定个人化合物21，因此这种方法对于法规遵从数据至关重要。此外，定位或非靶向化学分析方法允许用生物学方法，它提供了一个总的响应相比单个化合物或异构体的鉴定和定量。因此化学分析方法允许进行离散化合物的评估，以满足和解决个别处理厂的基础上，这些废水处理的挑战。有研究表明，虽然除去合成激素的EE2趋于较少有效的常规废水处理（ 例如，活性污泥处理厂）可能是在去除天然类固醇激素的高度有效的。使用利用的技术，如臭氧先进的治疗领域的研究中，颗粒活性炭（GAC）和膜已经证实，尽管成本高，它们可以作为尾管的溶液以除去EE2至低于预计值icted效果水平和低于检测限。 图3显示了EE2的使用GAC在中试规模的城市污水处理厂的拆除。在中试规模在用管GAC治疗结束市政污水处理厂进行的研究还显示以下的GAC在雌激素效力减少使用如图4中可见的酵母雌激素屏幕（是）进行测定。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig3.jpg" /> 图3.实例字段数据显示以下高级三级处理去除炔雌醇（A）样品是从污水处理厂以下为以下保存样品描述的步骤常规（活性污泥）处理收集。 （B）样品固相萃取，净化后用正相SPE去除干扰物质提取，凝胶渗透色谱法。 （C）的清洁浓缩提取物浓缩至小体积并在MRM模式使用负离子电LCMS / MS进行分析。结果是使用采用同位素标记的内标内部标准化计算。在所示的例子中，EE2是在0.1纳克/升的预测没有影响水平（PNEC）以上的浓度存在于最终的ASP流出物并用活性炭和臭氧去除（O 3），以对环境安全的浓度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig3large.jpg" target="_blank">请按此查看该图的放大版本。</a> <img alt="图4" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig4.jpg" /> 图4.照片一个酵母雌激素屏幕（是）试验板（A）中示出从黄色到红色的颜色变化，与该样品的雌激素活性。从YES分析板显示创建的图形校正吸光度（540雌二醇标准（B）的纳米），活性污泥处理的流出物（ASP）和粒状活性炭（GAC）处理过的废水流出物的样品（C）将每个样品一式两份进行测试。 ASP和GAC废水提取和使用第1节中列出的SPE方法集中<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a> 臭氧也是从常规治疗的污水处理厂去除类固醇雌激素和雌激素活性高效。臭氧是能够氧化多种有机污染物和溶解的有机物质的废水样品中，并提供消毒性能。臭氧化的有效性取决于水的特性如pH，有机物量和臭氧的施用剂量。由常规处理除去不良的雌激素可以是从废水0.8和2毫克O 3 /毫克之间DOC去除剂量。臭氧是一种选择性的氧化剂，其与富电子网站（不饱和碳 - 碳键，芳族化合物，包括芳族醇），这使得适用于一个号码的EDC的击穿臭氧反应。然而，单独的化合物的消除并不必然导致对原始化合物的完全矿化。有机物质以下臭氧可能的副产物，其中包括一些低分子量的转化产生的中间体或转化氧化，极性类型的化合物如醛，酮，羧酸，酮基羧酸，和溴化的化合物。实例包括溴酸盐，甲醛，乙醛和羧酸。 采用体内 和体外生物测定已经表明，尽管臭氧仅部分氧化一些化学物质，将得到的主要转变产物具有较低estrogENIC效力并因此臭氧在一个较高的去除雌激素活性的适当剂量的结果的应用程序。 一个废水处理额外的主要优点是在受纳水雄鱼女性化的减少;产生不利影响，可导致减少的生育3。使用鱼体内研究（ 例如 ，蟑螂或黑头呆鱼）暴露于废水显示雌性生殖细胞或卵母细胞的雄性鱼的精巢（ 例如，如在图5中看到）。阴阳或男性VTG缺席或鱼类以下先进的治疗，如海关总署7或臭氧22显著减少。这些研究表明，臭氧化过程中产生的变换的产品没有雌激素，然而，这并没有解决所产生的流出物的毒性。此问题已在其他研究中得到解决，例如通过马格德堡等的研究。 <s达&gt; 23这表明副产品臭氧氧化是有毒的虹鳟鱼，但这种毒性可以通过下游砂滤以下臭氧被删除。 <img alt="图5" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig5.jpg" /> 图5.正常男性（A）和阴阳的显微照片（B，C）从成年罗奇（ 拟鲤 ）性腺在基于实地评估。显微照片-A 暴露于废水 ，描绘了正常男性睾丸的组织切片。显微照片-B和-C，描绘了阴阳公鱼的组织切片，被暴露在活性污泥法处理废水排放六个月。箭头指示存在于睾丸组织卵母细胞。比例尺为100μm在每个显微照片。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a> 12,24在有机微双氧水氧化- 26。 TAML与H 2 O 2活化剂，有效地降解EE2和其他类固醇雌激素在纯实验室用水，以及在城市污水处理厂的污水和尖刺尿样12英寸实验室的研究，示出TAML / H 2 O 2的处理提供了高类固醇的雌激素去除包括EE2去除和实质上降低使用是生物测定和质体外测定雌激素活性LLY减少鱼女性化在使用VTG生物测定（ 图1和图6）测量体内 。 <img alt="图6" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig6.jpg" /> 图6.平均EE2浓度和雌激素活性处理和未处理的罐水域（A）和基线血浆卵黄蛋白原并暴露雄鱼（B）的A）EE2浓度（ng / L，深蓝色条）通过LCMS / MS测量，雌激素活性（EE2当量纳克/升，深绿色条）通过体外酵母雌激素屏幕测量（YES）。B）血浆卵黄蛋白原（毫微克/毫升，淡蓝色的条）浓度男性黑头呆鱼通过定量酶测定 - 连接的免疫吸附测定（ELISA）。报告为EE2化学分析结果&lt;0.03纳克/升EE2（ 即，高于检测限（LOD）低级）被视为具有一半的LOD（即 </青霉&gt; 0.015纳克/升EE2），用于在平均值，标准误差和统计分析的计算中使用。 EE2和雌激素活性是测得的平均浓度在取样21天的暴露。等离子VTG是之前曝光（基线），并在21天后曝光测量。治疗制度包括的;阴性对照组（仅稀释水），EE2 + H 2 O 2 + TAML，EE2 + H 2 O 2和EE2只。在图-A误差棒代表平均值的标准误差，在图-B误差棒代表标准偏差。以上图-B条字母代表统计相似。这个数字已经从米尔斯等人修改。12 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig6large.jpg" target="_blank">，请点击这里查看本图的放大版本。</a>

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Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency

内分泌干​​扰物（EDC）构成重大风险到水生环境。城市污水处理厂的主要贡献者，以地表水的雌激素效力。本文提供的方法允许疗效和污水处理工艺的适用性相对于EDC去除的评估。

对污水处理工艺的疗效评估利用化学和生态毒理学方法的电池，以消除雌激素潜能

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