Name: combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches at JoVE.com

L’imagerie a été réalisée dans le centre de l’Indiana pour microscopie biologique à l’Université de l’Indiana, dirigé par le Dr Ken Dunn. L’appareil stéréotaxique est un prototype conçu et réalisé par Mark Soonpaa, puits Center for Pediatric Research. Ce travail a été soutenu par le NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), la recherche MPN Foundation (NC) et la collaboration de l’ILEC IUSM/Notre Dame (NC) du projet.

Toutes les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été effectuées avec l’autorisation des utiliser Comité d’Indiana University School of Medicine et animalier. S’assurer qu’elle respecte la législation sur l’expérimentation animale du pays où le travail est exécuté.
1. préparation des Mx1CreRBPJ- / - souris destinataire
<ol><li>Traverser la souris Mx1-Cre+ avec RBPJlox/lox souris10 pour obtenir Mx1-Cr...

<ol>
	<li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li><li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche.">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li><li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment.">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li><li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues.">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision.">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner.">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment.">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li><li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential.">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li><li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation.">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li><li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons.">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li><li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow.">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683 (2014).</li></ol>

Ce protocole décrit un modèle expérimental optimisé pour étudier la cinétique de prise de greffe de cellules hématopoïétiques de la microscopie intravitale fluorescentes. Dans cette étude, l’expansion des cellules myéloïdes progénitrices dans un BM WT ou dans une encoche de signalisation défectueux BM a été suivie dans la voûte crânienne osseuse de cellules myéloïdes de Lys-GFP positives suivantes après les OGEC dans RBPJWT ou RBPJKO destinataires. Cette approche est proposée comme un modèle qui ...

La microscopie intravitale fluorescence multiphotonique (IVFM) est une puissante technique d’imagerie qui permet l’imagerie haute résolution, en temps réel de tissus avec la profondeur jusqu'à 1mm, selon le tissu. Lorsqu’elle est appliquée à la voûte crânienne de souris, il permet d’observer le comportement des cellules hématopoïétiques au sein de la BM de manière non invasive vers le haut à 60-100 μm11. Cette approche est utilisée ici pour déterminer la cinétique de prise de greffe des progéniteurs myéloïdes normales dans les souris knock-out BM de RBPJ manque de signalisation canonique de Notch.
Des travaux récents de notre groupe a démontré cette signalisation Notch canonique défectueux dans le microenvironnement BM entraîne une maladie myéloproliférative semblable à12. Perte de la signalisation Notch a été obtenu par suppression conditionnelle de la domaine obligatoire d’ADN de RBPJ, le facteur de transcription critique en aval de la protéine Notch canonique, de signalisation, à l’aide de Mx1-Cre induite par recombinaison10. Dans cette étude, on a utilisé le modèle de souris delox/lox de Mx1-Cre/RBPJ. Suppression conditionnelle du motif de liaison à l’ADN de RBPJ entraîne la perte de la signalisation de tous les récepteurs Notch. Dans le modèle de Mx1-Cre, Cre expression est entraînée par le promoteur de Mx1 activé par voie de c résultant dans l’induction de la délétion de gène ciblé en cellules de sang ainsi que dans composants stromales d’organes multiples, y compris les BM, rate et le foie.
MX1-Cre+/RBPJlox/lox et Mx1-Cre–/RBPJlox/lox souris induite avec c (indiqué sur le connaissement comme RBPJKO et RBPJWT, respectivement) ont été mortellement irradiés et transplantées avec cellules hématopoïétiques normales, type sauvage. À partir de la semaine 4 après la transplantation, destinataires RBPJKO développé leucocytose importante suivie d’une splénomégalie. Bien que souris RBPJKO présenté augmentation du pourcentage des progéniteurs myéloïdes dans le BM en semaine 8 après la transplantation et à des moments plus tard, analyse de la BM aux semaines 4 et 6 n’ont pas révélé de différences marquantes dans leur contenu cellulaire myéloïde par rapport au contrôle RBPJWT bénéficiaires. Cette observation, combinée au fait que Mx1-Cre est exprimé dans les différents organes hématopoïétiques, a demandé si le microenvironnement de la BM avait un impact direct sur l’initiation du phénotype syndromes myéloprolifératif.
Pour déterminer si la BM a un site critique initial du développement de la maladie, IVFM de la voûte crânienne de souris a été utilisé en combinaison avec la BM transplantation (BMT), le modèle de knock out RBPJ et une lignée de système de suivi. Des souris transgéniques exprimant EGFP sous le contrôle du promoteur (Lys-GFP) lysozyme spécifique9 ont été utilisés pour obtenir des cellules du donneur qui pourraient être visualisés au cours de la BM d’imagerie après BMT. Expression de lysozyme est spécifique aux cellules myéloïdes et Lys-GFP marque cellules du progéniteur myéloïde commun (CMP) pour les granulocytes mature13.
IVFM de la BM à des moments différents a démontré que les cellules de Lys-GFP Hébergement de la même façon aux destinataires BM de RBPJWT et RBPJKO, mais développé et implanté plus rapidement chez les receveurs de BM de RBPJKO. Cette différence a été dramatique au point antérieur dans le temps (semaine 2) et diminuait avec le temps (semaines 4 et 6). Cependant, à ces moments plus tard, évaluation du compartiment hématopoïétique chez le receveur même a montré une augmentation constante du nombre de cellules myéloïdes circulant dans le PB et localisée dans la rate des souris RBPJKO, indiquant une augmentation de la production de cellules de la BM dans la circulation. Analyse de la localisation de cellules Lys-GFP dans le BM de souris transplantées à 6 semaines a révélé que les cellules myéloïdes résidaient plus éloigné de la vascularisation dans le microenvironnement de la RBPJKO que dans le contrôle.
Collectivement, la combinaison de IVFM avec ces modèles animaux spécifiques fournies aperçus dans la dynamique de la prise de greffe de cellules myéloïdes dans le microenvironnement RBPJKO BM. La conception expérimentale et l’approche quantitative décrit ici est proposé comme un paradigme qui peut être appliqué pour répondre à des questions similaires. Par exemple, l’utilisation d’une autre lignée de cellule spécifique suivi de modèles, tels que RAG1-GFP14 ou15 souris Gata1-GFP peut permettre à la suite du comportement de lymphoïdes ou progéniteurs érythroïdes, respectivement, à la BM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine cocktail</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:511px;">Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TRITC dextran</td>
			<td style="width:167px;">Tdb Consultancy</td>
			<td style="width:139px;">TD150-100mg</td>
			<td>Other color dextran may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andis hair trimmer</td>
			<td style="width:167px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:139px;">CLP-323 75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze sponge</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">PK224</td>
			<td>4-ply, 2X2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair depilatory cream</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saline</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">RXSAL-POD1LT</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride poly bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">14-826-79</td>
			<td>28g, 1/2cc</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">00108-11, 00109-11</td>
			<td>straight forcep, angled forcep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissor</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle holder</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">MV-682</td>
			<td>Other non-absorbable suture may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">WillCo- glass bottom dish</td>
			<td style="width:167px;">WillCo</td>
			<td style="width:139px;">GWSt-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optical microscope oil</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereotaxic stage insert&#160;</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;">Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus FV1000 confocal microscope system&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small heating pad</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Zoo Med reptile heating pad</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Imaris 8.1 imaging software</td>
			<td style="width:167px;">Bitplane</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>3/4 D Image Visualization and Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches

Augmentant la preuve indique que l’hématopoïèse normale est régulée par des signaux micro-environnementales distinctes dans le BM, incluent des niches cellulaires spécialisés modulant critique de cellules souches hématopoïétiques (CSH) fonctions1,2. En effet, un tableau plus détaillé du microenvironnement hématopoïétique est maintenant émergents, où les endostéale et les niches endothéliales forment des unités fonctionnelles pour la réglementation des HSC normale et leurs descendants3,,4,5 . De nouvelles études ont révélé l’importance des cellules périvasculaires, les adipocytes et les cellules neuronales dans le maintien et la régulation HSC fonction6,7,8. En outre, il y a des preuves que les cellules de lignées différentes, c'est-à-dire des cellules myéloïdes et lymphoïdes, accueil et résident dans des créneaux précis dans le microenvironnement de la BM. Toutefois, une cartographie complète du microenvironnement de la BM et de ses occupants est toujours en cours.
Des lignées de souris transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents spécifiques de lignée ou des souris génétiquement modifiées pour manque de molécules sélectionnées dans des cellules spécifiques de la niche de la BM sont maintenant disponibles. Knock out et lignée suivi de modèles, en combinaison avec des approches de transplantation, fournissent l’occasion d’affiner les connaissances sur le rôle particulier « niche » cellules pour des populations hématopoïétiques définies, telles que HSC, lymphocytes B, lymphocytes T, cellules myéloïdes et cellules érythroïdes. Cette stratégie peut encore être potentialisée par la fusion de l’utilisation de la microscopie biphotonique de la voûte crânienne. En fournissant en vivo imagerie à haute résolution et rendu 3D de la voûte crânienne BM, nous pouvons maintenant déterminer précisément l’emplacement où des sous-ensembles spécifiques hématopoïétiques maison dans le BM et évaluer la cinétique de leur expansion au fil du temps. Ici, Lys-GFP souris transgéniques (marquage des cellules myéloïdes)9 et RBPJ souris knock out (manque de signalisation canonique de Notch)10 sont utilisés en association avec IVFM pour déterminer la prise de la greffe des cellules myéloïdes à un micro-environnement encoche de la BM défectueux.

Cohortes de 2 RBPJKO et 2 RBPJWT bénéficiaires ont été photographiés dans une session individuelle d’imagerie à des moments différents : 24h et 2, 4 et 6 semaines après la transplantation de cellules BM Lys-GFP (flux de travail est illustré dans la Figure 1 a).
Dans chacune des souris, les images ont été acquises de 6 régions standards de la voûte crânienne BM, identifiées par leur position par...

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

La microscopie intravitale fluorescence (IVFM) de la voûte crânienne est appliquée en combinaison avec des modèles animaux génétiques pour étudier la domiciliation et la greffe de cellules hématopoïétiques dans la moelle osseuse (BM) niches.

Combinant la microscopie intravitale Fluorescent (IVFM) avec des modèles génétiques pour étudier la dynamique de la prise de greffe de cellules hématopoïétiques à des Niches de la moelle osseuse

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Research

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

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