Name: combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches at JoVE.com

イメージングを行ったインディアナ センター博士ケン ・ ダン監督、インディアナ大学で生物顕微鏡用。脳定位固定装置は、設計、マーク Soonpaa、ウェルズ小児研究センターによって製作したプロトタイプです。この作品は NIH/R01DK097837-09 (NC) によってサポートされていた、NIH/R01HL068256-05 (NC)、NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC)、MPN 研究財団 (NC)、CTSI 共同プロジェクト IUSM/ノートルダム大聖堂 (NC)。

動物の使用を含むすべてのプロシージャを動物のケアおよび使用委員会のインディアナ大学医学部の承認を行った。行われる国の動物実験に関する法律を遵守することを確認します。
1. Mx1CreRBPJ-/-受信者のマウスの作製
<ol><li>Mx1-Cre+ RBPJlox/loxマウス10 Mx1 Cre を取得するマウスをクロス正RBPJlox/loxマウス<sup ...

<ol>
	<li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li><li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche.">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li><li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment.">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li><li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues.">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision.">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner.">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment.">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li><li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential.">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li><li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation.">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li><li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons.">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li><li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow.">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683 (2014).</li></ol>

このプロトコルでは、生体の蛍光顕微鏡による造血細胞移植の動力学を調査するように最適化実験デザインについて説明します。本研究では WT BM または欠陥のある BM をシグナリング ノッチ骨髄前駆細胞の拡張追跡された骨 calvarium で次 Lys GFP 陽性骨髄性細胞によって BMT 後 RBPJWT または RBPJKO の受信者に。たとえばアドレス同様の質問に適用できるモデルとしてこのアプローチが提案されて: ...

生体多光子蛍光顕微鏡 (IVFM) は、高解像度、リアルタイム イメージングの深さを持つ組織の最大のことができる強力なイメージング技術によって組織の 1 mm。マウスの calvarium を適用すると、60-100 μ m11を非侵襲的な方法で BM 内造血細胞の挙動を観察が許可されます。このアプローチは、正規 Notch シグナルに欠けている BM の RBPJ ノックアウト マウスで通常の骨髄前駆細胞の生着の動態を決定するここで使用です。
私達のグループからの最近の作品は、その欠陥正規 Notch シグナルのような骨髄増殖性疾患12BM 微小環境リードを示した。Notch シグナルの損失は、RBPJ、下流正規 Notch シグナル、組換え10を誘発 Mx1 Cre を使用しての重要な転写因子の DNA 結合ドメインの条件付き削除によって得られました。本研究では Mx1-Cre/RBPJlox/loxマウス モデルが使用されました。RBPJ の DNA 結合モチーフの条件付き削除すべてのノッチの受容体から信号の損失で起因します。式は複数の臓器の間質成分のだけでなく、血液細胞のターゲット遺伝子欠失の誘導の結果 polyI:C の管理時にアクティブ Mx1 プロモーターによる Cre Mx1 Cre モデルで BM、脾臓と肝臓を含みます。
Mx1-Cre+/RBPJlox/loxと Mx1 Cre-/RBPJlox/loxマウス (ここに至って示される RBPJKO と RBPJWT、それぞれ) polyI:C による致死的照射し、正常な野生型造血細胞移植されました。移植後 4 週目から始まって、RBPJKO の受信者は脾腫に続いて重要な白血球を開発しました。RBPJKO マウスでは、移植後およびそれ以降の時点で BM の 8 週目骨髄前駆細胞の増加割合を提示、週 4 と 6 で BM の分析はコントロール RBPJWT と比較して、骨髄球系細胞内容に顕著な違いを明らかにしなかった受信者。この観測は、一緒に実際に Mx1 Cre が異なる造血臓器の単位があること提起した BM 微小環境骨髄増殖性の表現型の発生に直接的な影響を持っていたかどうか。
BM が病気の開発の重要な最初のサイトであるかどうかを判断するには、マウス calvarium の IVFM は BM の移植 (BMT)、RBPJ ノック アウト モデル系列のシステムを追跡との組み合わせで使用されました。特定リゾチーム プロモーター (Lys GFP)9の制御の下で EGFP を発現するトランスジェニック マウスを用いて BM BMT 後の画像の中に可視化することができるドナー細胞を入手します。リゾチーム発現は骨髄細胞に固有、Lys GFP が成熟した顆粒球13(CMP) 一般的な骨髄前駆細胞をマークします。
異なる時点で BM の IVFM を示した、Lys GFP の細胞同様に BM の RBPJWT と RBPJKO の受信者にホーム拡大や高速 RBPJKO BM 受信者の中にしみ込んでいます。この違い以前の時点 (2 週目) で劇的だったし、時間の経過とともに減少 (週 4 と 6)。しかし、これらの後の時点で PB で循環する骨髄細胞数の着実な増加を示した同じ受信者の造血のコンパートメントの評価、細胞の高められた出力を示す RBPJKO マウスの脾臓でローカライズ循環に BM。Lys GFP の細胞における局在の解析 BM 移植マウスの 6 週間では、骨髄細胞がコントロールにより RBPJKO 微小環境で血管系から遠い寝泊まりしていたことを明らかにしました。
総称して、これらの特定の動物モデルと IVFM の組み合わせは RBPJKO BM 微小環境における骨髄系細胞の生着の動力学の洞察力を提供されています。同じような質問に対処するため適用することができますパラダイムとして実験的なデザインとここで説明する定量的な手法を提案する.たとえば、RAG1 GFP14または15 Gata1 GFP マウスなどのモデルを追跡他のセルの特定の血統を使用する次のリンパの動作許可可能性がありますや赤芽球系前駆細胞、BM のそれぞれ。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine cocktail</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:511px;">Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TRITC dextran</td>
			<td style="width:167px;">Tdb Consultancy</td>
			<td style="width:139px;">TD150-100mg</td>
			<td>Other color dextran may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andis hair trimmer</td>
			<td style="width:167px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:139px;">CLP-323 75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze sponge</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">PK224</td>
			<td>4-ply, 2X2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair depilatory cream</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saline</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">RXSAL-POD1LT</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride poly bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">14-826-79</td>
			<td>28g, 1/2cc</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">00108-11, 00109-11</td>
			<td>straight forcep, angled forcep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissor</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle holder</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">MV-682</td>
			<td>Other non-absorbable suture may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">WillCo- glass bottom dish</td>
			<td style="width:167px;">WillCo</td>
			<td style="width:139px;">GWSt-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optical microscope oil</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereotaxic stage insert&#160;</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;">Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus FV1000 confocal microscope system&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small heating pad</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Zoo Med reptile heating pad</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Imaris 8.1 imaging software</td>
			<td style="width:167px;">Bitplane</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>3/4 D Image Visualization and Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches

増加する証拠は、その正常造血が特殊な細胞ニッチ重要な造血幹細胞 (HSC) 機能1,2を調節することを含む、BM の個別のアイソレータケージ手がかりによって規制されてを示します。確かに、造血微小環境のより詳細な画像は今浮上して、骨と血管内皮のニッチが正常 HSC とその子孫3,4,5 の規制の機能ユニットを形成.新しい研究は、血管周囲細胞、脂肪細胞、神経細胞の維持と HSC 機能6,7、8を規制することの重要性を明らかにしました。さらに、異なる系統、すなわち骨髄性とリンパ性細胞、家から細胞、骨髄微小環境の内で特定のニッチに存在する証拠があります。しかし、BM 微小環境とその居住者の完全なマッピングは、まだ進行中です。
トランスジェニック マウス系統系統固有蛍光マーカーあるいは BM のニッチの特定のセルに選択した分子を欠いた遺伝子改変マウスの表現ができます。ノックアウトと系列移植アプローチとの組み合わせで、モデルを追跡、HSC などの定義済みの造血集団の固有の「ニッチ」の役割に関する知識を絞り込むこと細胞 B 細胞、T 細胞、骨髄細胞、赤芽球系細胞。この戦略は、マージ、calvarium の 2 光子顕微鏡を使用することによってさらに増強することができます。体内の高分解能イメージングと BM calvarium の 3d レンダリングを提供することにより造血の特定のサブセットが BM のホームし、時間をかけて彼らは拡張の動態を評価の場所正確に今判断できます。ここでは、Lys GFP トランスジェニック マウス (骨髄細胞マーキング)9と RBPJ (正規 Notch シグナルに欠けている) ノックアウト マウス10はノッチ欠陥 BM の微小環境に骨髄系細胞の生着を確認する IVFM との組み合わせで使用されます。

2 RBPJKO、2 RBPJWT 受信者のコホートを異なる時点で各撮像セッションでイメージしました: 24 h、2、(ワークフロー、図 1 aに示されている) BM Lys GFP の細胞移植後 4 〜 6 週間。
各マウスの画像に(図 2 a、)中心静脈と冠動脈縫合 (図 2 a、b) の分岐に関連して彼らの位置によって識...

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

ホーミングや骨髄 (BM) のニッチに造血細胞の生着を研究する遺伝的動物モデルとの組み合わせで、calvarium の生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) が適用されます。

骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

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