Name: combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches at JoVE.com

이미지는 닥터 켄 던 감독 하는 인디애나 대학에서 생물학 현미경에 대 한 인디애나 센터에서 실시 되었다. Stereotaxic 장치 설계 및 마크 Soonpaa, 웰 스 소아 연구 센터에 의해 만들어진 프로토 타입 이다. 이 작품은 NIH/R01DK097837-09 (NC)에 의해 지원 되었다, NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN 연구 재단 (NC)와 CTSI 공동 프로젝트 IUSM/노 틀 담 (NC).

동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 동물 관리 및 사용 위원회의 인디애나 대학의과의 인증 수행 했다. 확인 작업을 수행 하는 국가의 동물 실험에 법안을 준수 합니다.
1. Mx1CreRBPJ-/- 받는 사람 마우스의 준비
<ol><li>Mx1-Cre+ RBPJlox/lox 쥐10 Mx1-Cre를 얻을 마우스를 크로스 RBPJlox/lox 쥐12 양수와 M...

<ol>
	<li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Calvi, L. 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M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision.">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner.">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment.">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li><li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential.">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li><li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation.">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li><li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons.">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li><li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow.">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683 (2014).</li></ol>

이 프로토콜 Intravital 형광 현미경 검사 법에 의해 최적화 engraftment 조 혈 모 세포의 활동을 연구 하는 실험 설계를 설명 합니다. 이 연구에서는 골수성 조상 세포 WT BM 또는 노치 신호 결함이 있는 BM의 확장 했다 추적 뼈 calvarium에서 다음 리스 GFP 긍정적인 골수성 세포 BMT 후 받는 사람 RBPJWT 또는 RBPJKO로. 이 접근은 주소 비슷한 질문에 예를 들면 적용 될 수 있는 모델로 제안: 나) 확장과 다른 계보의 ...

Intravital multiphoton 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 강력한 이미징 기술을 고해상도, 실시간 이미징 조직 깊이의 최대 허용 하는 조직에 따라 1 mm. 마우스 calvarium에 적용 하면, 그것은 60-100 μ m11을 비-침략 적 방법으로 BM 내의 조 혈 모 세포의 행동을 관찰을 허용. 이 방법은 여기 engraftment 정식 노치 신호 부족 BM의 RBPJ 녹아웃 쥐에 있는 정상적인 골수성 창시자의의 활동을 결정 하기 위해 사용 됩니다.
우리 그룹에서 최근 작품 그 결함이 정식 노치 신호 myeloproliferative 같은 질병12BM microenvironment 리드에서 설명 했다. 노치 신호 손실 RBPJ, 하류 신호, 재결합10유도 Mx1-Cre를 사용 하 여 정식 노치의 중요 한 녹음 방송 요인의 DNA 묶는 도메인의 조건부 삭제에 의해 얻은. 이 연구에서는 Mx1-Cre/RBPJlox/lox 마우스 모델 사용 되었다. RBPJ의 DNA 묶는 주제의 조건부 삭제에서 모든 노치 수용 체 신호 손실 발생 합니다. Mx1-Cre 모델, Cre 식 polyI:C 여러 기관의 stromal 구성 요소에서 뿐만 아니라 혈액 세포에서 타겟된 유전자 삭제의 유도에 결과의 관리에 따라 활성화 Mx1 발기인에 의해 구동 됩니다 포함 한 BM, 비장 및 간.
Mx1-Cre+/RBPJlox/lox ,lox/lox 마우스 Mx1-Cre-/RBPJ polyI:C (hereon 표시 된 RBPJKO와 RBPJWT, 각각)와 유도 방사능 치명적 이었고 정상, 야생 타입 조 혈 모 세포 이식. 이식 후 4 주부터 시작 해 서, RBPJKO 받는 사람 상당한 leukocytosis로 선행 개발. RBPJKO 마우스 골수성 창시자의 증가 비율에에서 제시는 BM 주 8에서 이식 후 고 나중 시간 지점에서 비록 4-6 주에 BM의 분석 그들의 골수성 세포 콘텐츠 제어 RBPJWT에 비해 눈에 띄는 차이 공개 하지 않았다 받는 사람. BM microenvironment myeloproliferative 표현 형의 개시에 직접적인 영향을 미쳤다 Mx1-Cre 다른 조 혈 기관, 표현 된다 사실 함께이 관찰, 질문을 발생 합니다.
BM 질병 개발의 중요 한 초기 사이트 였는 지 여부를 확인 하려면 마우스 calvarium의 IVFM와 BM 이식 (BMT), RBPJ 노크 아웃 모델 계보 추적 시스템 조합에 사용 되었다. 유전자 변형 마우스 특정 lysozyme 발기인 (리스-GFP)9 의 통제 EGFP 표현 BM BMT 후 이미징 동안 구상 될 수 있는 기증자 세포를 얻기 위해 사용 되었다. Lysozyme 식이 골수성 세포 특정 고 리스-GFP 성숙한 granulocyte13일반적인 골수성 조상 (CMP)에서 셀을 표시 합니다.
다른 시간 지점에서 BM의 IVFM는 리스 GFP 셀 BM의 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람에 게 마찬가지로 홈 하지만 확장 및 BM의 RBPJKO 받는 사람에서 빨리 engrafted 시연 했다. 이 차이 이전 시간 시점 (주 2) 극적인 되었고 시간이 지남에 따라 감소 (주 4 및 6). 그러나, 이러한 나중 시간 지점에서 동일한 받는 사람에 조 혈 구획의 평가 골수성 세포는 샌드위치에 순환 수에 꾸준히 증가 보였다 고 셀의 증가 출력을 나타내는 RBPJKO 마우스의 비장에 순환에 BM. 리스-GFP 셀 지역화는 BM에 이식된 생쥐의 6 주에의 분석 컨트롤에서 보다 RBPJKO microenvironment에 골수성 세포는 맥 관 구조에서 거주 했다 밝혔다.
샨 다, 이러한 특정 동물 모델 IVFM의 조합 RBPJKO BM microenvironment 골수성 세포의 engraftment 역학에서 통찰력 제공. 실험 설계 및 여기서 설명 하는 양적 접근 비슷한 질문을 해결 하기 위해 적용할 수 있는 패러다임으로 제시 된다. 예를 들어 모델, RAG1 GFP14 또는 Gata1 GFP15 마우스 추적 다른 셀 특정 계보를 사용 하 여 림프의 동작에 따라 수 또는 erythroid 창시자는 BM에 각각.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine cocktail</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:511px;">Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TRITC dextran</td>
			<td style="width:167px;">Tdb Consultancy</td>
			<td style="width:139px;">TD150-100mg</td>
			<td>Other color dextran may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andis hair trimmer</td>
			<td style="width:167px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:139px;">CLP-323 75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze sponge</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">PK224</td>
			<td>4-ply, 2X2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair depilatory cream</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saline</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">RXSAL-POD1LT</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride poly bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">14-826-79</td>
			<td>28g, 1/2cc</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">00108-11, 00109-11</td>
			<td>straight forcep, angled forcep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissor</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle holder</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">MV-682</td>
			<td>Other non-absorbable suture may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">WillCo- glass bottom dish</td>
			<td style="width:167px;">WillCo</td>
			<td style="width:139px;">GWSt-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optical microscope oil</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereotaxic stage insert&#160;</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;">Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus FV1000 confocal microscope system&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small heating pad</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Zoo Med reptile heating pad</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Imaris 8.1 imaging software</td>
			<td style="width:167px;">Bitplane</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>3/4 D Image Visualization and Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches

증거를 증가 일반 조 전문된 세포 벽 중요 한 조 혈 줄기 세포 (HSC) 기능1,2변조를 포함 하는 BM, 뚜렷한 microenvironmental 신호에 의해 규제 됩니다 나타냅니다. 실제로, 조 혈 microenvironment의 더 상세한 그림은 이제 신흥에 endosteal와 내 피 틈새 형성 정상 HSC와 그들의 자손3,4,5의 규칙에 대 한 기능 단위 . 새로운 연구는 adipocytes, 유지 하 고 HSC 기능6,,78조절에 신경 세포, 혈관 주위 세포의 중요성을 계시 했다. 또한, 다른 계보, 즉 골수성과 림프 성 세포, 가정에서 세포 및 BM microenvironment 내의 특정 틈새에 있는 증거가 있다. 그러나, BM microenvironment 및 그것의 거주자의 완전 한 매핑 진행 중에서입니다.
계보 특정 형광 표식 또는 부족 BM 틈새의 특정 셀에 선택한 분자 유전자 조작 생쥐를 표현 하는 유전자 변형 마우스 긴장 지금 사용할 수 있습니다. 노크 아웃 및 혈통 추적 모델, 이식 방법, 함께에서 제공 기회 "틈새" 특정의 역할에 대 한 지식을 구체화를 세포 HSC, 같은 정의 된 조 혈 인구에 대 한 B-세포, T 세포, 골수성 세포와 erythroid 셀입니다. 이 전략은 calvarium의 2 광자 현미경의 사용을 병합 하 여 더 potentiated 될 수 있습니다. 제공 함으로써 고해상도 이미징 vivo에서 및 BM calvarium의 3 차원 렌더링, 우리가 지금 정확 하 게 위치 특정 조 혈 하위 집합은 BM에 가정과 평가 시간이 지남에 그들의 확장의 활동을 확인할 수 있습니다. 여기, 리스-GFP 유전자 변형 마우스 (골수성 세포 표시)9 , RBPJ (정식 노치 신호 부족 한) 녹아웃 쥐10 사용 됩니다 IVFM와 함께에서 노치 결함이 BM microenvironment 골수성 세포 engraftment 결정 하.

2 RBPJKO 및 2 RBPJWT 받는 사람의 동료 다른 시간 지점에서 개별 이미징 세션에 몇 군데 있었다: 24 h와 2, 4 및 6 주 (워크플로 그림 1A일러스트) BM 리스-GFP 세포의 이식 후.
각 마우스에서 이미지 (그림 2A,)중앙 정 맥 그리고 관상 봉합 (그림 2A, b)의 분기점에 관하여 그들의 위치에 의?...

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

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연구

발생학

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