Name: combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches at JoVE.com

Imagem latente foi realizado no centro de Indiana para microscopia biológica na Universidade de Indiana, dirigido pelo Dr. Ken Dunn. O dispositivo estereotáxica é um protótipo projetado e feito por Mark Soonpaa, centro de poços de pesquisa pediátrica. Este trabalho foi financiado pelo NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), a pesquisa do MPN Foundation (NC) e o CTSI Collaborative projeto Importantíssima/Notre Dame (NC).

Todos os procedimentos que envolvem a utilização de animais foram realizados com autorização do cuidado Animal e usar o Comité da Indiana University School of Medicine. Certifique-se para aderir à legislação na experimentação animal do país onde o trabalho é realizado.
1. preparação dos ratos de destinatário Mx1CreRBPJ- / - 
<ol><li>Cruzar os ratos Mx1-Cre+ com RBPJsalmão/salmão ratos10 para obter Mx1-Creneg...

<ol>
	<li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. 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M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision.">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner.">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment.">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li><li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential.">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li><li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation.">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li><li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons.">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li><li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow.">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683 (2014).</li></ol>

Este protocolo descreve um delineamento experimental otimizado para estudar a cinética da enxertia de células hematopoiéticas por microscopia Intravital fluorescente. Neste estudo, a expansão de células progenitoras mieloides em um BM WT ou em um entalhe sinalização defeituoso BM foi controlada a calvária óssea por células mieloides positivas seguintes de Lys-GFP após TMO em destinatários RBPJWT ou RBPJKO. Esta abordagem é proposta como um modelo que pode ser aplicado para responder a perguntas semelhantes, ...

Microscopia de fluorescência do multiphoton intravital (IVFM) é uma poderosa técnica de imagem que permite para o de alta resolução, em tempo real de imagens de tecidos com profundidade de até 1mm, dependendo do tecido. Quando aplicado a calvária de rato, permite observar o comportamento das células hematopoiéticas dentro da BM de forma não-invasiva acima de 60-100 μm11. Esta abordagem é usada aqui para determinar a cinética de enxertia de progenitores mieloides normais nos ratos nocaute BM de RBPJ falta canônica de sinalização Notch.
Trabalho recente do nosso grupo demonstrou que defeituoso sinalização de entalhe canônico na BM microambiente conduzem a uma doença mieloproliferativa, como12. Perda de sinalização Notch foi obtida pela exclusão condicional do domínio de ligação do DNA de RBPJ, o fator de transcrição crítica a jusante de entalhe canônico, sinalização, usar Mx1-Cre induzida por recombinação10. Neste estudo, utilizou-se o modelo de ratos desalmão/salmão Mx1-Cre/RBPJ. Exclusão condicional do motivo do DNA-ligando de RBPJ resulta na perda de sinalização de todos os receptores Notch. No modelo de Mx1-Cre, Cre expressão é conduzido pelo promotor Mx1 ativado após administração de polyI:C resultando na indução de supressão do gene alvo em células do sangue, bem como em componentes estromais de múltiplos órgãos, incluindo a BM, o baço e o fígado.
Mx1-Cre+/RBPJsalmão/salmão fumado e Mx1-Cre–/RBPJsalmão/salmão ratos induzida com polyI:C (aqui indicado como RBPJKO e RBPJWT, respectivamente) foram letalmente irradiados e transplantado com células hematopoiéticas normais, de tipo selvagem. A partir da semana 4 após transplante, destinatários RBPJKO desenvolveram leucocitose significativa, seguido por esplenomegalia. Apesar de ratos RBPJKO apresentaram aumento percentual de progenitores mieloides no BM na semana 8 após transplante e nos pontos de tempo mais tarde, análise do BM em semanas 4 e 6 não revelou diferenças marcantes em seu conteúdo de células mieloides em relação ao controle RBPJWT destinatários. Esta observação, juntamente com o fato de que a Mx1-Cre é expresso em diferentes órgãos hematopoiéticos, levantou a questão se o microambiente BM teve impacto direto sobre a iniciação do fenótipo mieloproliferativa.
Para determinar se a BM foi um crítico site inicial do desenvolvimento da doença, IVFM da calvária de rato foi usado em combinação com BM transplante (BMT), o modelo de mata-mata RBPJ e uma sistema de rastreamento de linhagem. Ratos transgênicos expressando EGFP sob o controle do promotor (Lys-GFP) lisozima específica9 foram usados para obter células de doador que podem ser visualizadas durante a BM de imagem após TMO. Expressão de lisozima é específico para células mieloides e Lys-GFP marca células do progenitor mieloide comum (CMP) para os granulócitos maduros13.
IVFM do BM em pontos diferentes do tempo demonstrou que células de Lys-GFP homed da mesma forma para os destinatários BM de RBPJWT e RBPJKO, mas expandido e incorporada mais rápido em destinatários BM de RBPJKO. Esta diferença foi dramática no ponto anterior de tempo (semana 2) e diminuiu ao longo do tempo (semanas 4 e 6). No entanto, estes pontos de tempo mais tarde, avaliação do compartimento hematopoiética do receptor, mesmo mostrou um aumento constante no número de células mieloides circulantes em PB e localizadas no baço de ratos RBPJKO, indicando um aumento da produção de células partir do BM na circulação. Análise de Lys-GFP células localização na BM de ratos transplantados com 6 semanas revelou que células mieloides residiam mais longe da vasculatura no microambiente RBPJKO do que no controle.
Coletivamente, a combinação de IVFM com estes modelos animais específicos fornecidos introspecções na dinâmica das células mieloides no microambiente BM RBPJKO enxertia. O delineamento experimental e abordagem quantitativa descrita aqui é proposto como um paradigma que pode ser aplicado para resolver questões semelhantes. Por exemplo, o uso de outra linhagem de células específicas rastreamento modelos, tais como RAG1-GFP14 ou15 ratos Gata1-GFP pode permitir seguindo o comportamento linfoide ou eritroide progenitores, respectivamente, no BM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine cocktail</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:511px;">Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TRITC dextran</td>
			<td style="width:167px;">Tdb Consultancy</td>
			<td style="width:139px;">TD150-100mg</td>
			<td>Other color dextran may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andis hair trimmer</td>
			<td style="width:167px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:139px;">CLP-323 75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze sponge</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">PK224</td>
			<td>4-ply, 2X2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair depilatory cream</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saline</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">RXSAL-POD1LT</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride poly bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">14-826-79</td>
			<td>28g, 1/2cc</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">00108-11, 00109-11</td>
			<td>straight forcep, angled forcep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissor</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle holder</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">MV-682</td>
			<td>Other non-absorbable suture may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">WillCo- glass bottom dish</td>
			<td style="width:167px;">WillCo</td>
			<td style="width:139px;">GWSt-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optical microscope oil</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereotaxic stage insert&#160;</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;">Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus FV1000 confocal microscope system&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small heating pad</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Zoo Med reptile heating pad</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Imaris 8.1 imaging software</td>
			<td style="width:167px;">Bitplane</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>3/4 D Image Visualization and Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches

Aumentando a evidência indica que hematopoiese normal é regulada por distintas pistas microenvironmental na BM, que incluem especializados nichos celulares modulando funções de células-tronco hematopoiéticas crítico (HSC)1,2. De fato, uma imagem mais detalhada do microambiente hematopoiético está a emergir, no qual o endosteal e nichos endoteliais formam unidades funcionais para a regulação da HSC normal e sua progênie3,4,5 . Novos estudos têm revelado a importância das células perivasculares, adipócitos e células neuronais para manutenção e regulamenta HSC função6,7,8. Além disso, há evidências de que células de linhagens diferentes, ou seja, células mieloides e linfoides, lar e residam em nichos específicos dentro do microambiente BM. No entanto, um mapeamento completo do microambiente BM e seus ocupantes ainda está em andamento.
Cepas de rato transgênicas expressando marcadores fluorescentes específicos de linhagem ou camundongos geneticamente modificados para falta de moléculas selecionadas em células específicas do nicho BM estão agora disponíveis. Mata-mata e linhagem rastreamento modelos, em combinação com abordagens de transplante, proporcionam a oportunidade de aperfeiçoar o conhecimento sobre o papel dos específicos "nicho" de células para populações hematopoiéticas definidas como HSC, células B, células T, células mieloides e eritroide de células. Esta estratégia pode ser ainda mais potencializada, mesclando-se o uso da microscopia de dois fotões da calvária. Fornecendo imagens de alta resolução na vivo e renderização 3D da calvária BM, agora podemos determinar precisamente o local onde subconjuntos específicos hematopoiéticos para casa em BM e avaliar a cinética de sua expansão ao longo do tempo. Aqui, Lys-GFP ratos transgénicos (marcação de células mieloides)9 e RBPJ mata-mata ratos (falta de sinalização de entalhe canônico)10 são usados em combinação com IVFM para determinar a enxertia das células mieloides de um microambiente BM defeituoso de entalhe.

Coortes de 2 RBPJKO e 2 RBPJWT de destinatários foram fotografadas em uma sessão individual de imagens em pontos diferentes do tempo: 24h e 2, 4 e 6 semanas após o transplante de células de BM Lys-GFP (fluxo de trabalho é ilustrado na figura 1A).
Em cada rato, imagens foram adquiridas de 6 regiões padrão da calvária BM, identificado por sua posição em relação a bifurcação da veia central (F...

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Microscopia de fluorescência intravital (IVFM) da calvária é aplicada em combinação com modelos de animais geneticamente para estudar o homing e enxertia das células hematopoiéticas em nichos de medula óssea (BM).

Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

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