Name: combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches at JoVE.com

La proyección de imagen se llevó a cabo en el centro de Indiana para microscopia biológica en la Universidad de Indiana, dirigido por el Dr. Ken Dunn. El dispositivo estereotáctica es un prototipo diseñado y realizado por Mark Soonpaa, Wells Center for Pediatric Research. Este trabajo fue financiado por NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), la investigación MPN Fundación (NC) y la colaboración de CTSI proyecto íntimamente/Notre Dame (NC).

Se realizaron todos los procedimientos que implican el uso de animales con autorización de cuidado Animal y Use Comité de Indiana University School of Medicine. Asegurar que se adhieran a la legislación sobre experimentación animal del país donde se realiza el trabajo.
1. preparación de Mx1CreRBPJ- / - ratones receptores
<ol><li>Cruzar ratones RBPJlox/lox ratones10 para obtener Cre Mx1 Mx1-Cre+ positivo RBPJ...

<ol>
	<li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. 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M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision.">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner.">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment.">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li><li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential.">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li><li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation.">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li><li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons.">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li><li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow.">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683 (2014).</li></ol>

Este protocolo describe un diseño optimizado para estudiar la cinética del engraftment de células hematopoyéticas por microscopia Intravital de fluorescentes. En este estudio, la expansión de las células progenitoras mieloides en un BM de WT o en una muesca señalización defectuosa BM fue localizada en la bóveda ósea por células mieloides positivas siguientes de Lys-GFP después de BMT en recipientes RBPJWT o RBPJKO. Este enfoque se propone como un modelo que puede aplicarse para responder preguntas similares, ...

La microscopia intravital de fluorescencia multifotón (IVFM) es una técnica de imagen de gran alcance que permite la alta resolución y en tiempo real la proyección de imagen de tejidos con profundidad hasta 1mm, dependiendo del tejido. Cuando se aplica a la bóveda del ratón, permite observar el comportamiento de las células hematopoyéticas en el BM en una manera no invasiva hasta 60-100 μm11. Aquí se utiliza este enfoque para determinar la cinética del engraftment de progenitores mieloides normales en los ratones knock-out de BM de RBPJ falta de señalización de Notch canónica.
Trabajos recientes de nuestro grupo demostraron defectuosa señalización canónica de muesca en el BM microambiente conduce a una Enfermedad mieloproliferativa como12. Pérdida de la señalización de Notch se obtuvo por supresión condicional del dominio de unión de ADN de RBPJ, el factor de transcripción crítico aguas abajo de la muesca canónica de señalización, utilizando Mx1-Cre inducida por recombinación10. En este estudio, se utilizó el modelo de ratones de Mx1-Cre/RBPJlox/lox . Supresión condicional adorno DNA-obligatorio del RBPJ de resultados en la pérdida de la señalización de los receptores Notch. En el modelo Mx1-Cre Cre expresión es conducida por el promotor de Mx1 activado tras la administración de polyI:C dando por resultado la inducción específica de canceladura del gene en células de la sangre así como en componentes stromal de múltiples órganos, incluyendo el BM, el bazo y el hígado.
MX1-Cre+/RBPJlox/lox y Mx1-Cre–/RBPJlox/lox ratones inducidos con polyI:C (aquí en adelante denominadas RBPJKO y RBPJWT, respectivamente) fueron irradiados letalmente y trasplantados con las células hematopoyéticas normales, tipo salvaje. A partir de la 4 semana después del trasplante, los receptores RBPJKO desarrollaron leucocitosis significativa seguido por esplenomegalia. Aunque ratones RBPJKO presentaron mayor porcentaje de progenitores mieloides en el BM en la semana 8 después del trasplante y en momentos más adelante, el análisis de BM en las semanas 4 y 6 no reveló diferencias llamativas en su contenido de células mieloides en comparación con el control RBPJWT destinatarios. Esta observación, junto con el hecho de que Cre Mx1 se expresa en diferentes órganos hematopoyéticos, planteó la cuestión de si el microambiente del BM tuvo impacto directo en la iniciación del fenotipo mieloproliferativo.
Para determinar si el BM era un sitio crítico inicial de desarrollo de la enfermedad, IVFM de la bóveda de ratón se usa en combinación con BM trasplante el modelo knock-out RBPJ y un sistema de seguimiento de linaje. Ratones transgénicos que expresaban EGFP bajo el control del promotor (Lys-GFP) lisozima específico9 fueron utilizados para obtener células de un donante que podrían visualizarse durante BM imagen después de BMT. Expresión de lisozima es específica de las células mieloides y Lys-GFP marca células del progenitor mieloide común (CMP) para los granulocitos maduros13.
IVFM del BM en diferentes puntos temporales demostró que las células GFP Lys alojados de manera similar a los destinatarios BM de RBPJWT y RBPJKO, pero ampliaron y engrafted rápidamente en los receptores de la BM de RBPJKO. Esta diferencia fue dramática en el momento anterior (semana 2) y disminuye con el tiempo (semanas 4 y 6). Sin embargo, en estos momentos más adelante, evaluación del compartimiento hematopoyético en el mismo recipiente demostró un aumento constante del número de células mieloides circulantes en la PB y localizados en el bazo de los ratones RBPJKO, lo que indica un aumento de la producción de células del BM en la circulación. Análisis de localización de células Lys-GFP en el BM de ratones trasplantados a las 6 semanas reveló que las células mieloides residían más lejos de la vasculatura en el microambiente de la RBPJKO que en el control.
Colectivamente, la combinación de IVFM con estos modelos animales específicos proporciona penetraciones en la dinámica del engraftment de células mieloides en el microambiente RBPJKO BM. El diseño experimental y el enfoque cuantitativo que se descrito aquí se propone como un paradigma que puede ser aplicado para hacer frente a preguntas similares. Por ejemplo, puede permitir el uso de otro linaje específico celular seguimiento de modelos, tales como GFP RAG114 o Gata1-GFP15 ratones, siguiendo el comportamiento de linfoide o progenitores eritroides, respectivamente, en el BM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine cocktail</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:511px;">Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TRITC dextran</td>
			<td style="width:167px;">Tdb Consultancy</td>
			<td style="width:139px;">TD150-100mg</td>
			<td>Other color dextran may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andis hair trimmer</td>
			<td style="width:167px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:139px;">CLP-323 75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze sponge</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">PK224</td>
			<td>4-ply, 2X2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair depilatory cream</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saline</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">RXSAL-POD1LT</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride poly bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">14-826-79</td>
			<td>28g, 1/2cc</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">00108-11, 00109-11</td>
			<td>straight forcep, angled forcep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissor</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle holder</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">MV-682</td>
			<td>Other non-absorbable suture may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">WillCo- glass bottom dish</td>
			<td style="width:167px;">WillCo</td>
			<td style="width:139px;">GWSt-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optical microscope oil</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereotaxic stage insert&#160;</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;">Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus FV1000 confocal microscope system&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small heating pad</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Zoo Med reptile heating pad</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Imaris 8.1 imaging software</td>
			<td style="width:167px;">Bitplane</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>3/4 D Image Visualization and Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches

Creciente evidencia indica que la hematopoyesis normal está regulada por distintas señales microambiental en el BM, que incluyen nichos celulares especializadas modulación crítica de células madre hematopoyéticas (HSC) funciones1,2. De hecho, un cuadro más detallado del microambiente hematopoyético ahora surge, en el cual los endoóseos y los nichos endoteliales forman unidades funcionales para la regulación de HSC normal y su progenie3,4,5 . Nuevos estudios han revelado la importancia de las células perivasculares, adipocitos y células neuronales en el mantenimiento y regulación de la función HSC6,7,8. Además, hay evidencias de que células de diferentes linajes, es decir, las células mieloides y linfoides, hogar y residen en nichos específicos dentro del microambiente de BM. Sin embargo, una asignación completa del microambiente del BM y de sus ocupantes aún está en progreso.
Cepas de ratón transgénico que expresan marcadores fluorescentes específicos de linaje o ratones genéticamente modificados para carecer de las moléculas en células específicas del nicho BM están ahora disponibles. Knock-out y linaje seguimiento de modelos, en combinación con métodos de trasplante, proporcionan la oportunidad de perfeccionar el conocimiento sobre el papel de específicas "niche" células para poblaciones hematopoyéticas definidas como HSC, de células B, células T, células mieloides y células eritroides. Esta estrategia puede ser potenciada aún más combinando el uso de la microscopía de dos fotones de la bóveda craneal. Proporcionando en vivo imágenes de alta resolución y 3D Render de la bóveda de BM, ahora podemos determinar precisamente el lugar donde subconjuntos hematopoyéticos específicos Inicio en el BM y evaluar la cinética de su expansión en el tiempo. Aquí, Lys-GFP ratones transgénicos (marcando las células mieloides)9 y RBPJ ratones knock-out (falta de señalización de Notch canónica)10 se utilizan en combinación con IVFM determinar el engraftment de células mieloides en un microambiente de BM defectuoso de muesca.

Cohortes de 2 RBPJKO y 2 RBPJWT beneficiarios se reflejada en una sesión de imágenes individual en diferentes puntos temporales: 24 h y 2, 4 y 6 semanas después del trasplante de las células del BM Lys-GFP (flujo de trabajo se ilustra en la figura 1A).
En cada ratón, se adquirieron imágenes de 6 regiones estándar de la bóveda de la BM, identificados por su posición en relación con la bifurcación de la...

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Research

JoVE Journal

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

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