Name: high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00
Duration: 10 min 25 s
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特别感谢克莱尔M.沃特曼博士指导和讨论，米歇尔·贝尔德和迈克·戴维森提供许多在这些研究中所使用的荧光cDNA构建的，而凯瑟琳阿普尔盖特和Gaudenz Danuser发展plusTipTracker MT分析软件。这项工作是支持的，一部分是通过从授予KAM国家心肺血液研究所（NHLBI）和美国国立卫生研究院（NIH）。 （格兰特：4K22HL113069）。

1. HUVEC文化和维护<ol><li>通过将内皮细胞生长培养基补充包和5％青霉素/链霉素抗生素混合物的全部内容准备完整的内皮细胞基础培养基无酚红内皮细胞基础培养基（详见材料/设备列表）。至37℃的水浴中温暖完整的内皮基础培养基。 </li><li>除去从液氮存储的一个的HUVEC离心管，并在37℃水浴中快速解冻2分钟。当〜80-90％解冻，加入500μl温暖完整的内皮基础培养基的离心管，吹打混匀，均匀分配到细胞含15毫升温暖完整的内皮基础培养基100毫米的塑料组织培养皿。 </li><li>位置细胞成37℃培养箱，用5％ 的 CO 2。使细胞附着过夜。不要删除或改变细胞培养基。 </li><li>当100毫米的菜&gt; 90％汇合，转移我的HUVECn要一个75cm 2的组织培养物处理的烧瓶并保持在任何时候都在&gt; 60％汇合（见步骤1.5）。 注意：当维持在一个密度&gt; 60％，血管内皮细胞倍增时间是一致的18-20小时。 <ol><li>对于其中传代细胞是没有必要的情况下（ 即密度为&lt;90％），吸出培养基并用每48小时的新鲜完全内皮基础培养基替换。 </li></ol></li><li>当内皮细胞达到&gt; 90％汇合时，冲洗2次，用10ml 1×PBS中，然后通过处理它们1.5毫升0.25％胰蛋白酶在37℃下除去从组织培养皿的细胞1-2分钟。注意：内皮细胞的生存力通过延长胰蛋白酶暴露的长度大大减少。 </li><li>救援细胞通过以4:1的比例加入8.5毫升完整内皮细胞基础培养基中胰蛋白酶/ HUVEC混合物：1内皮基础培养基完成：胰蛋白酶（最小比），并在一个15毫升锥形管收集。 </li><li>离心在1400 XG 4分钟。吸气上清液。 </li><li>重悬沉淀在2ml完全内皮细胞基础培养基中，将细胞加入到含有25 ml完全内皮细胞基础培养基的新225厘米2组织培养烧瓶中。 </li></ol> 2.盖玻片准备在此之前HUVEC文化<ol><li>涂层盖玻片与纤维连接蛋白底物。 <ol><li>制备吱吱清洁22毫米号1.5盖玻片39并存储在100％乙醇室温（RT）。 </li><li>使用本生灯火焰盖玻片并将其置于用镊子35毫米的培养皿。 </li><li>通过用990微升的PBS混合10微升纤连蛋白的库存（1毫克/毫升）制备纤连蛋白/ PBS混合物。 </li><li>吸取250微升纤维连接蛋白/ PBS混合物拖到35毫米的菜盖玻片。扩散均匀覆盖盖玻片的表面上。 </li><li>孵育至少3小时的培养皿在37℃下并在使用前2毫升1×PBS中漂洗3次。 </li></ol></li><li&gt;涂层盖玻片聚丙烯酰胺（PA）衬底。 <ol><li>盖玻片激活<ol><li>放在50％的3 aminopropyltrimethyloxysilane 22毫米1.5号盖玻片上搅拌盘10分钟。每次温育后，洗涤10次2分钟在双蒸H 2 O（DDH 2 O的）。 </li><li>孵育0.5％戊二醛盖玻片上的轰动板30分钟。温育后，洗涤10次2分钟在DDH 2 O </li></ol></li><li>制备聚丙烯酰胺<ol><li>通过加入3.75毫升40％的丙烯酰胺制得的PA凝胶0.7千帕（kPa）的的合规性，0.3毫升的2％双-丙烯酰胺，和0.95的DDH 2 O中的溶液</li><li>制备过硫酸铵（APS）的10％的工作溶液，并在冰上储存直至使用。 </li><li>为1盖玻片（总体积= 166.7微升）制备的PA溶液中，添加0.83微升DDH 2 O的的，41.7微升双丙烯酰胺溶液（步骤2.2.2.1制造），124微升10％的APS，和0.25微升TEMED的。 </li><li>立即吸管15微升的PA溶液到疏水载玻片（参见试剂列表）并与活化的22毫米号1.5盖玻片覆盖。允许PA聚合在室温20分钟。 </li><li>取下盖玻片，并转移到35毫米的菜。用2ml 1×PBS中洗涤3次。存储&lt;2周4℃。 </li><li>要绑定纤连蛋白的聚丙烯酰胺凝胶，暴露聚丙烯酰胺涂层盖玻片2毫米磺SANPAH 7500Ĵ紫外光（254nm）下。用的DDH 2 O冲洗一次</li><li>通过用990微升的PBS混合10微升纤连蛋白的库存（1毫克/毫升）制备纤连蛋白/ PBS混合物。 </li><li>吸移管将250μl纤连蛋白/ PBS混合物到在35毫米培养皿盖玻片（多个）。扩散均匀覆盖盖玻片的表面上。 </li><li>孵育至少3小时的培养皿在37℃下并在使用前2毫升1×PBS中漂洗3次。 </li></ol></li></ol></li></ol><p<html>类=“jove_title”&gt; 3。基因转染和HUVEC文化盖玻片<ol><li>完成步骤1.5-1.6。 </li><li>使用血球，计数细胞数量，并收集含有10万个细胞/盖玻片（非迁移实验）或500,000细胞/盖玻片（迁移实验）的卷。沉淀通过离心将细胞于1400 xg离心4分钟。 注：迁移协议在第9如下所述，。 </li><li>以用100μl电穿孔缓冲液被转染悬浮细胞。用1μg的cDNA结合并放入电穿孔杯中。电穿孔细胞：使用指定的HUVEC电方案（A-034 如程序＃）DNA混合物。 </li><li>救援转用500微升完整的内皮细胞培养基和板细胞细胞到纤维连接蛋白包22毫米1.5号盖玻片（见2.1协议，上文）。孵育在37℃下3-4小时，以便有时间的cDNA构建体的表达。 </li></ol>标本乐“&gt; 4。准备成像<ol><li>切双面胶带成2.5厘米点¯x0.65厘米条。 </li><li>获得干净的载玻片上。取双面胶带的两个条和沿滑动的顶部和底部边缘它们水平地固定。注意：允许的带和滑动边缘之间空间少量用于如在步骤4.5）中描述的密封的腔室是重要的。 </li><li>安装盖玻片（来自步骤3.4;细胞侧朝下）在磁带上的盖玻片其余使得2边。使用镊子轻轻按下，以确保盖玻片。 </li><li>用微量，添加40微升成像介质（补充有25微米的HEPES完整内皮细胞基础培养基）盖玻片与载玻片之间。确保盖玻片与载玻片之间的空间完全充满成像介质。抽吸过量成像介质（如果需要的话）。 </li><li>密封用温水VALAP所有边缘（1：1：1凡士林：羊毛脂：石蜡）。检查通过推gentl泄漏Ÿ在玻璃盖玻片。 </li><li>地点安装并密封盖玻片到预热（37℃）显微镜阶段。 </li></ol> 5.显微镜<ol><li>使用装有60X，1.40数值孔径（NA）的微分干涉对比（DIC）油浸物镜，一个自动聚焦监控系统（PFS），用于发射照明电子快门的旋转盘共聚焦显微镜中，X和-Y联动阶段，容纳在一个电子滤波器轮带通滤波器，和一个单片激光器组合器模块，聚焦显微镜在细胞/盖玻片的接口，并使用显微镜阶段操纵杆来定位一个单细胞。 </li><li>单击图像软件程序的“摄像头设置”面板上。在相机设置面板中的“曝光时间”下拉列表窗口中，选择400毫秒。 注意：曝光时间可能会发生变化，并应根据经验确定。 </li><li>点击了“ND收购”面板图像软件程序。内ND采集板的拉姆达（λ）选项卡，点击复选框以选择488和561 nm激光。内ND采集面板的“时间”选项卡，设置采集时间为2秒，总时间为2分钟。 </li><li>点击ND采集面板中的“立即运行”按钮，使用400毫秒的曝光时间为488和561 nm的照明无论是在2秒的间隔收购获得一个2分钟的时间推移图像序列。 </li><li>在图像处理软件程序的“光学配置”面板，并使用步骤5.2中所述的相机设置，点击405 nm激光按钮，然后单击“获取”捕捉到蓝色荧光蛋白的单个图像（BFP）标记的蛋白质。 注意：通常建议以限制细胞暴露于405nm的激光照射作为该波长可以随时间破坏细胞（图像捕获和/或曝光时间的频率）。 <ol><li>对于MCAK-shRNA的研究中，cquire单个405nm的图像，以验证BFP标记的shRNA的表达。 </li></ol></li><li>在图像处理软件程序的“光学配置”面板，并使用步骤5.2中所述的相机设置，点击DIC按钮，然后单击“获取”捕获细胞的单一DIC形象分支形态分析（见第10 ，下文）。 </li><li>以下图像采集，使用“亮度/对比度”功能的图像的软件程序对图像信号进行数字增加。 </li><li>导出的亮度和对比度调整的图像。点击“文件”，然后点击“另存为”，然后单击以选中图像文件类型“。TIF”。 注意：这通常从一个单一的2分钟时间推移收购按步骤描述5.4捕获时产生61的.tif图像文件。 </li></ol> 6. MT动力学分析<ol><li>对于EB3跟踪，使用plusTipTracker软件35，一个开源的，基于Matlab计算软件设计用于自动探测，跟踪，分析和荧光标记的EB的可视化。 </li><li> plusTipGetTracks图形用户界面（GUI） <ol><li>要访问plusTipGetTracks GUI，类型plusTipGetTracks。 </li><li>对于EB3彗星检测，使用GUI浏览和选择包含.TIF图像的父目录。 </li><li>内plusTipGetTracks GUI的跟踪参数面板中，输入以下值：搜索范围半径= 5 - 10;最低子轨道长度= 3;最大间隙长度（帧）= 12;最大收缩率= 1.0;最大角度正向= 25;最大角度向后= 10;波动半径（像素数）= 2;帧速率（秒）= 2;像素尺寸（微米）= 110。 注意：首先检查使用plusTipParamSweepGUI上一组有代表性的.tif图像文件的最优跟踪参数。为像素尺寸的输入值是特定于用于获取隔时图像的物镜S（见步骤5.1-5.2，以上）。 </li><li>利息率（ROI）的选择区域，通过手动跟踪使用的小区的DIC图像，以形成一个多边形小区边缘创建整个细胞的二进制掩码。 </li><li>利息（子ROI）选择的子区域，创建前导和通过使用改良的plusTipTracker子的ROI选择工具手动绘制横跨感兴趣的伤口边缘单元的2点粗线后缘口罩。 注意：行应平行于其中感兴趣的细胞延伸超出邻近伤口边缘单元31的位置被吸引到伤口边缘。 </li></ol></li><li> plusTipSeeTracks GUI <ol><li>验证并通过点击目视检查存储在“投资回报率”文件夹中的照片的.tif的轨道覆盖的轨道覆盖列“情节曲目”按钮。重复所有曲目覆盖。 </li><li>通过单击可选设置栏中的“创建组”按钮，执行数据分组。选择experim通过点击上的数据文件属于同一个数据集ental数据。通过给“团”，可以很容易识别（例如，“对照组”）的名称保存选择。 </li><li>为子的ROI的MT生长动力学测量，输入的最小数目的图像帧，一个EB3彗星轨道必须子ROI中，以将前缘和后缘的ROI内资格作为一个“跟踪”和提取的MT生长偏移来检测由GUI的“子的ROI”面板中点击“手动选择”。 注意：例如，使用3帧（6秒）的最低检测长度要被提取作为“轨道”。从子的ROI中提取音轨的每个小区中的原始的ROI文件夹中存储的一个子项目文件夹内。 </li><li> MT生长子轨道和亚群分析<ol><li>计算平均值MT的增长速度，意味着“群”数据集（见步骤6.3.2），每个ROI MT增长寿命（见STEp 6.2.4），并为每个子的ROI（步骤6.2.5）。 </li></ol></li><li>内plusTipSeeTracks GUI的象限散点图列中，单击“选择组”并点击组（在步骤6.3.2创建）进行比较。 <ol><li>选择“增长速度”为x轴选项，并键入增速（从步骤6.3.4），成箱的平均值。选择“成长一生”为y轴选项，并键入生长寿命（从步骤6.3.4），成箱的平均值。 </li></ol></li><li>勾选“删除在开始/结束曲目”和旁边的盒子“批量处理上的组。”点击“制作自留地”生成MT增长轨道为整个细胞，导致边缘分布曲线，和后缘子的ROI。 注意：对于这里所描述的研究中，对MT生长轨道分布分为四个亚群：慢和短命的，缓慢的，长寿命，快速和短暂的，并快速和长寿命。 </li><l我&gt;步骤6.3.4平均值复制到一个电子表格软件程序并保存扩展的.xls文件。 <ol><li>单击“数据”，然后点击“数据分析”，从下拉列表中的数据窗口。选择“t检验：两样本等方差假设”来比较的意思是MT的增长速度和增长MT寿命。突出，其中t检验比较导致的p值&lt;0.001在电子表格内的数据信元。 </li></ol></li></ol></li></ol> 7.共定位分析<ol><li>背景扣除，使用成像软件程序的“行工具”，通过点击屏幕上创建一个正方形形状为10微米2绿色通道图像（488 nm激发）绘制感兴趣区域（ROI）的区域的位置处不存在细胞荧光（背景）。重复此使用图片来自步骤5.8红色通道图像（561 nm激发）。 </li><li>使用图像处理软件PRogram，右击ROI步骤7.1，选择“设置为背景的投资回报率。”点击“图像”，然后点击“扣除背景”，从下拉列表窗口，从整个减去平均背景值（从步骤7.1）图片。对细胞的共表达的Em-极光，要么mCherry-MCAK，马普尔-EB3，或马普尔微管蛋白进行背景减除。 </li><li>在背景中减去红色通道图像只，点击二进制丝带，然后选择“定义阈值”，然后选择“每通道”功能，以排除指定的荧光标记。 注意：无论是mCherry-MCAK，马普尔-EB3，或马普尔微管蛋白的图像进行阈值处理的步骤，让绘图专门标记为共定位分析（见步骤7.4）的阈值对象的行。 </li><li>在成像软件使用直线工具画一个2点粗线超过阈值的图像中排除的对象。 </li><li>选择在步骤7.4绘制的线条对象。复制并从红色通道的线对象粘贴到其相应的绿色通道（EM-极光A）的图像。 </li><li>衡量线下物体从摄像软件程序中的下拉窗口中选择“测量”，然后“强度分布”来计算的共定位和总EM-极光-A值，每个单元格中的灰度像素亮度值。 <ol><li>通过导出到电子表格软件程序和保存文件类型的.xls（例如，“control_grayscale_intensity.xls”）组织由实验性治疗和亚细胞区域中的数据。 注意：在这种方式给出的数据表示总测量每个子蜂窝区域Em-极光-A的共定位级分。 </li></ol></li><li>从步骤7.6，重复步骤6.3.7使用的测量值采用P &lt;0.05为分界的意义来计算统计学意义。 </li></ol><p类=“jove_title”&gt; 8。免疫荧光<ol><li>修复细胞（参见步骤3.4）与多聚甲醛/戊二醛共萃取/固定缓冲液（PGF-PHEM; 4％多聚甲醛，0.15％戊二醛，0.2％的洗涤剂在60毫摩尔PIPES，27.3毫米的HEPES，10mM的EGTA和8.2毫硫酸镁4，pH 7.0）中，在室温10分钟。 </li><li>冲洗3次，每次5分钟，用2ml 1×PBS中。 </li><li>治疗2次15分钟0.01微克/毫升的NaBH 4在1×PBS中以淬灭反应性醛。 注意：加入NaBH 4形成的气泡可导致盖玻片浮动。至关重要的是，盖玻片保持这些孵化过程中淹没。如果盖玻片开始浮起，使用镊子提升盖玻片的一个边缘，以允许气泡逸出。 </li><li>在摇摆平台上在1×PBS中的5％无脂牛奶阻断在RT 1小时之前漂洗2次用1×PBS。 </li><li>孵育主要抗体细胞（兔抗pT288极光A（1：1000））和大鼠抗α微管蛋白（1：500）在1×PBS溶液制备。在4℃孵育摇摆平台过夜。 </li><li>在5％无脂牛奶制备2小时用二级抗体孵育之前除去初级抗体和冲洗3次在1×PBS中的5分钟（1,000）的驴抗兔（1：1000）和山羊抗 - 鼠（1）在37℃。 </li><li>在荧光优化的安装介质的载玻片盖玻片山。在4℃下密封盖玻片边缘用透明指甲油店在黑暗中的幻灯片，。 </li></ol> 9.细胞迁移实验<ol><li>执行HUVEC培养如上所述迁移测定（协议3：上盖玻片的cDNA转染和HUVEC培养，步骤3.2-3.3）。 </li><li>继细胞转染，转救援细胞80微升完整的内皮基础培养基。移液器80微升样品作为单一落到干燥纤连蛋白涂覆的22毫米圆形1.5号盖玻片的中心。不要传播80μl的DRO页。孵育在37℃下3-4小时，以便有时间细胞粘附到汇合单层。 注意：干燥盖玻片是必要防止80μl的一滴直接从盖玻片接触传播。该方法允许将盖玻片的小区域内浓缩的HUVECs，从而促进细胞的汇合单层的快速形成。 </li><li>冲洗完全内皮基础培养基2次，以除去未贴壁细胞。 </li><li>以创建“伤口边缘，”通过在HUVEC单层轻轻拖曳干净的刀片（来自步骤9.2）刮去用无菌刀片盖玻片。用钳子轻轻握住盖玻片，以防止刮期间刀片的打滑。 </li><li>允许细胞在37℃培养箱中恢复3小时。组装和安装成像盖玻片（S）（见协议4）。 </li><li>获得以10分钟的间隔相衬和488纳米的图像12小时上使用的显微镜10×0.45的NA相物镜和使用该图像采集软件程序中的“ND习得”面板0.52的NA LWD冷凝器（在步骤5.3中所述）。 </li></ol> 10. HUVEC分支和迁移的量化<ol><li>分支分析，并允许甚至细胞照明和偏量化，获得转染的HUVEC细胞的显微镜图像（参见步骤3.3）和表达MAPPLE-C1的cDNA构建体，细胞体积标记。 </li><li>使用成像软件程序中，打开MAPPLE-C1图像并标记上，其中所述膜显示曲率最大角度分支的两侧的位置。这两个点用直线连接。此行是“分支来源。” </li><li>使用图像处理软件的行工具，在视觉上识别测量长度&gt; 10微米从“分支来源”步骤10.2确定的分支。从日测量的距离计算分支长度e“的分支来源”的分支末端的最远侧点（参考图4）。 </li><li>算该测量长度，得到&gt; 10微米支凸起数“小区分支数”。 </li><li>迁移分析，使用在步骤9.6中收集的图像，在视觉上识别伤口边缘的HUVEC基于物理位置（ 即在伤口的边缘细胞物理）和表达谱（ 即 ，选择一个绿色伤口边缘细胞如果实验涉及GFP的表达）。 </li><li>利用细胞的相衬图像，在视觉上表示核（靠近小区中心的半透明的球形结构），然后在视觉上识别核仁（核内小，深色，球状结构）在时间推移图象的第一时间点。点击核仁的位置来标记核仁的x和y坐标。 </li><li>使用图像处理软件，手工追踪核仁在连续时间推移图像通过点击核仁的位置标记核仁的X和Y坐标的时间推移电影（ 图4）每一帧。 </li><li>使用图像处理软件，点击“文件”，然后点击另存为“，然后单击以选中图像文件类型是”.xls“。 </li><li>开使用电子表格软件程序的手跟踪数据文件（来自步骤10.8）。计算平均移动速度和平均原点迁移距离。 </li><li>使用电子表格软件程序中，点击“数据”，然后点击“数据分析”，从下拉列表中的数据窗口。选择邦费罗尼校正，单向有&gt; 95％的置信作为截止为统计显着性差异检验的分析。 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

使用在形态和迁移实验内皮细胞。 内内皮细胞EB3标记MT生长动态活细胞成像需要适当的和可重复的细胞培养条件，以衡量和评价MT增长和HUVEC形态的变化，这样它们就可以被分配给ECM的信号提示。代表内皮细胞为研究细胞形状和运动的优秀典范。它们与荧光标记的cDNA高度服从转染，他们表现出响应可溶性和物理信号暗示戏剧性的形态，并与其保持提供了适当的细胞培养条件时65-70把自己组织成血管管的能力。原代细胞培养，如内皮细胞，需要小心处理和细胞传代次数的监测，以确保细胞是健康的，它们将在实验过程中，通常表现。例如，在进行实验调查cytoskele时吨和/或细胞的形态，内皮细胞不应该被用于超出第十细胞培养通道的实验，如内皮细胞通常会开始显示围绕通道12的非均匀形貌15个。 细胞密度也HUVEC健康和增殖的关键调节剂。 HUVEC支调查（见上文协议10.1-10.4，）用相对低的细胞密度培养物中以提供对细胞的物理空间与他们的ECM相互作用并延伸支的突起。与此相反，在伤口边缘迁移研究（见协议10.5-10.8），血管内皮细胞是在伤人之前的单层培养。因此，伤口边缘的HUVECs显示相对未被分支的形态，延伸前缘突出部，并显示出细胞 - 细胞相互作用与其近邻因为它们迁移到伤口。 警告和跟踪MT动力学内皮细胞生存的优势。 旋转盘显微镜是一个极好的方法测试要求共聚焦图像清晰度高时间分辨率的实验假设。用适当的相机和激光器模块，该显微镜的方法就是将低发射荧光敏感，并且可以降低漂白帮助相对于其他类型的荧光显微镜。重要的是，这种方法也以及需要用于产生使用EB3标记方法的MT生长动力学全面测量，在各种不同的细胞类型的适合用于中度到高时间分辨率的成像。 而标记的EB3方法生长的MT加两端有超过荧光标记的MT的其它方法明显的优点，它也有独特的缺点。例如，存在对MT阵列的未活跃生长在任何给定时间，包括拆卸MT的两个人口和稳定的，非动态的MT 71-74的人口比例。 EB3不会标注的MT这两个人口和因此这两个群体的贡献将不包含在实验数据的分析。评估整个MT阵列的替代方法都集中在荧光标记的微管蛋白，它合并到MT的所有人群，并允许增长，萎缩的识别，以及稳定的微管的表达。然而，由于在MT阵列邻近的小区的中心，并邻近于微管组织中心（微管组织中心），标记整个MT阵列的相对高密度的创建中执行的MT端的图像分析的缺点是不属于细胞附近外围75-77。在活细胞中使用MT的双色共标记有荧光微管蛋白和荧光EB3实验已揭示，定性，绝大多数的微管蛋白-标记的MT的是也EB3标记78。此外，还有尚未标有荧光的微管蛋白的MT的自动跟踪的有效方法。这意味着，数据COLLEC重刑和表达荧光微管蛋白细胞MT的动态测量要求单独的MT专人跟踪，这个过程很容易出错和繁琐。其结果是，EB3标记MT的自动计算分析已成为用于测量的MT动力学，因为它可以在众多细胞类型以及多种试验制度35,79的内应用于MT动力学实验的首选方法。 链接MT生长动态，以HUVEC形态和迁移。 从细胞骨架研究者的角度来看，plusTipTracker自动跟踪分析之一极其有用的适应是测量和评估的MT生长动力学都全细胞和区域的变化的能力。为一个单元，成为偏振光的要求是一个重要的先决条件定向细胞迁移。因此，极化信号提示人们早就知道的关键驱动因素进行定向细胞迁移30,31,51,54,56,80,81 </SUP&gt;。例如，如VEGF可溶性信号分子诱导肌动蛋白聚合和MT生长朝向内皮细胞类型2,82-87 VEGF的线索。此外，响应于与ECM物理相互作用（例如，合规性和维mechanosensing），内皮细胞通过局部调节的MAP，以促进内延伸的支链突起MT生长调节它们的MT动力学，并且这用于引导的HUVEC迁移的方向提示5,31,88。因此，极化响应于细胞外信令线索突出了的细胞骨架动力学局部变化实验评估的需要。 的MT生长动力学（使用EB3的方法）和HUVEC细胞迁移的同时活细胞成像是非常难以进行，因为微管上的秒的时间尺度成长，而在细胞形态和定向迁移的改变上的小时的时间尺度发生。然而，这两个过程是密切临客ð。此外，在第二个时间刻度荧光标记EB3的连续，快速成像导致EB3信号的光漂白。试图通过导电短成像系列EB3（1-2分钟采集系列），每30分钟获得了成功的克服这个问题，但只能在内皮细胞中的一小数量的有EB3的最佳表达来实现，并且不显示不良效果反复激光照射5。 另一种方法是允许的MT增长动力如何有助于细胞形态和迁移变化的解释是利息率（ROI）工具35（见协议6.6）的plusTipTracker地区。这个方法允许对于全细胞的MT生长跟踪对被细分成用户定义的区域，从其中的MT生长磁道然后可以提取和分析。例如，“支链”与小区的“非支”区域的比较揭示，MT的生长多个S低，更持久支链区域内相比，非支化细胞周5。在偏光伤口边缘内皮细胞，前缘和后缘MT增长动力的对比表明，MCAK诱导MT拆卸前缘内特异性抑制，但不是在尾端。的开头和结尾的内皮细胞边缘MT生长动态表达Rac1和/或MCAK磷酸化突变体区域评价进一步透露，极光激酶Rac1的诱导激活明确，并在本地抑制前缘内MCAK活动，以推动HUVEC极化和定向迁移31。因此，MT生长动态的分支突起和/或伤口边缘内皮细胞的前缘内MT生长动态区域评价自动跟踪相结合，使我们能够MT生长动态链接到血​​管内皮细胞形态和迁移。 所描述的协议是designed可提供HUVEC文化和实​​验研究比较直接和高度可重复的方法。然而，许多的协议细节是复杂的和耗时的，这反过来，提供了用于在进行实验方法的错误或困难的机会。当试图在整个协议解决潜在的问题，在这里提供的是不常见的或以其他方式缩写为内的方法的协议笔记潜在问题的其他，详细的故障排除。 涉及与聚丙烯酰胺基质涂层盖玻片（协议2.2），即产生是激活盖玻片，耦合聚丙烯酰胺的玻璃，激活聚丙烯酰胺，然后耦合的ECM的聚丙烯酰胺的复杂性的常见问题。一个特别困难和有潜在问题的步骤培养内皮细胞上纤维连接蛋白/聚丙烯酰胺凝胶继聚腺苷酸曝光crylamide涂层盖玻片2毫米磺酸基SANPAH（步骤2.2.2.6，上文）。它是对培养在这些基板上该内皮细胞的成功至关重要磺基SANPAH完全从以下的ECM结合实验系统中除去。这可以通过使用DDH 2 O的清洗并在培养摇床在DDH 2 O盖玻片一夜之间最好完成。如果对聚丙烯酰胺的ECM培养细胞不存活，或者生存能力不及预期，增加，结合到纤连蛋白（步骤2.2.2.9）经过反复磺酸基SANPAH洗涤建议可能缓解这一问题。 相关协议3（基因转染和HUVEC文化上盖玻片），到电手术成功产生重大影响的是血管内皮细胞的无论是在细胞的胰蛋白酶处理从塑料瓶中取出它们，下面的结论在电（步骤3.3-3.4，以上）。这是关键的关心充分监视的HUVECs而在胰蛋白酶，并且不超过所需的细胞“舍入”的烧瓶（通常为1-2分钟）的表面上的时间。在胰蛋白酶过度时间的HUVEC死亡，通常没有实现直至细胞铺板到纤连蛋白包被的盖玻片（步骤3.4）中，然后不附着到所述衬底的一大原因。 同样重要的是，内皮细胞（和大多数主要细胞类型）悬浮在电缓冲时间较长时，不会活得很累。在较大规模的实验，例如，在用户具有五个或更多的条件，需要电穿孔，最好是保持在各个管沉淀的细胞（每转1管），并将它们混合，一在一次一在电之前，立即电缓冲区。这种方法可以减少在电缓冲区和最大化HUVEC生存培养时间。此外，在完全培养基立即抢救也是CRitical下电。一分钟或更多以下电穿孔的救援延迟可导致几乎完全的HUVEC死亡，因此应该避免。 相关的细胞迁移测定（协议9），以非常高的密度培养的HUVECs的技术依赖于需要的纤连蛋白涂覆的盖玻片干燥临界修改传统的HUVEC细胞培养方法（在协议3所述）的（在步骤9.2中所述）为了使HUVEC培养到盖玻片的一个非常小的区域。很多时候，如果盖玻片没有完全干燥，或如果盖玻片与纤连蛋白的现有涂层（步骤2.1或2.2）是效率不高，这被放置在盖玻片含媒体单元将失去其表面张力和扩大到盖玻片的边缘，从而减少了对盖玻片细胞的密度。解决这一潜在的问题的一种方法是从盖玻片，然后吸媒体放置盖玻片（在其35毫米菜仍然）进入生物安全柜的5-10分钟回来。这种适应可以帮助允许机柜内的空气的流动，以协助在干燥皿中。如果任何可见液体残留在空气干燥后的盖玻片，吸出液体斑点和再次风干在生物安全柜5-10额外分钟。需要注意的是，没有办法完全避免这种潜在的问题是很重要的，但它确实变得不那么与协议的反复实践中的问题。这也是一个故障排除建议，准备在细胞迁移实验（或任何化验，一般来说）盖玻片时，准备额外的盖玻片，并有额外的内皮细胞随时可以走在前进的道路问题的情况下。 考虑到这些故障排除注意事项，同样重要的是要突出讨论的协议及其在今后的细胞生物学研究意义的效用。适用于被polyacr基酰胺的方法是广泛，并且不仅包括细胞-ECM接合（如上所述）的二维研究，但也三维调查5。这个应用是增加我们的内皮细胞如何调节细胞形态和迁移在生理环境的理解至关重要，应提供调查人员如何形态变化与细胞骨架的变化是协调的一个基本的了解。而这里所述的协议都集中在MT的生长动力学的测量，大部分的协议可以并且应该适于测量任何数目的细胞-ECM相互作用的其它显微镜可测量方面。对于MT的动态，有无数的地图，包括驱动蛋白89的至少14个家庭，每个在促进血管内皮细胞极性和定向迁移的潜在作用，以及所有可使用给出的协议进行调查。 未来的调查应一LSO可以在细胞与细胞外基质参与在正常与疾病状态的目标。这里提出的HUVEC协议也适用于正常的血管稳态工艺的调查，以及疾病状态，包括心脏疾病，视网膜病变，肿瘤生长和转移，仅举几例。缀合服从遵守微观研究明显透明的ECM和聚丙烯酰胺基质将允许细胞-ECM接合的研究，使得内皮细胞的血管的血管生成能够以高空间和时间分辨率来监测。这些类型的实验方法已经开始揭示在内皮细胞形状，极性，迁移重要的差异，并且调节这些过程5,31,90蛋白的影响。今后努力的目标应该是，以确定ECM合规性和维mechanosensing的组合怎么可以用来针对和调节细胞骨架的动态控制本地蛋白质。

血管生成是由促进内皮细胞（EC）极化，带定向特异性迁移，并在需要的血液供应的组织形成新的血管系统外信号线索触发。以为驱动的血管生成起作用的因素是来自细胞外基质（ECM）的信号。为了应对物理线索，内皮细胞具有定向特异性扩展新的分支机构，以指导形成血管网1,2定向运动。 EC形态和支化结构是通过在该协调与雅图肌球蛋白收缩3的调节方式的微管（MT）细胞骨架的局部调节限定。为了EC分支形成，肌球蛋白II必须在本地下调，造成局部膜突起4。在同一时间，并在细胞内的同一位置，MT增长动力被修改后导致缓慢而持续的增长MT促进分支伊隆gation和稳定性5。这种协调细胞骨架法规允许内皮细胞极化其形态，以方便定向迁移。 极化细胞形态的发展需要偏光MT组装6。在迁移上皮细胞，微管在细胞7-9的前缘缓慢而持续具体成长;而在神经元，轴突或树突的起始和延长需要的MT不仅存在，但它们被动态地进行组装和拆卸10-15的处理。以这种方式，MT的生长动力学局部控制确定单元的结构，并且允许细胞形态的快速重构作为内皮通过他们的ECM导航。 MT的增长动力是由分子马达蛋白和非马达蛋白的家庭规范，被称为微管相关蛋白或微管相互作用蛋白（以下referred为地图）。的MAP可以局部激活或失活的，典型地通过信令在细胞-ECM接口16,17发起级联。通过结合到MT和改变的MT组装和拆卸的动力学一旦激活，MAP的功能;从而发挥调节本地MT动力，以促进细胞形状和极性18-20。有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（MCAK）是驱动蛋白13家MAP结合MT结束，夫妇ATP水解MT拆卸21-23。 MCAK的这个功能作用是已知的相间29,30中有丝分裂纺锤体24-28中的关键，以及。在相间内皮细胞，MCAK介导的MT拆卸由局部极光A诱导MCAK磷酸化响应调节伤口边缘的Rac1的小GTP酶的诱导激活。此信号传导级联的结果是MCAK的在内皮细胞的前缘的抑制，导致偏振MT生长朝向乐ading边缘和MCAK诱导MT拆卸在迁移的EC 31的后缘。 用于测量MT增长动力的传统方法通常有两种使用荧光标记的微管蛋白或最近，荧光标记的MT结束结合蛋白1或3（分别为EB1或EB3，）的专人跟踪。荧光微管蛋白的方法具有标注的整个MT阵列的优点。然而，因为大多数的有丝分裂的细胞类型的相间8,32,33期间保持MT的径向阵列，所述中心体附近的MT非常密集，并且作为结果，跟踪MT生长和拆卸用荧光微管蛋白通常仅限于周边小区的区域。由于这些限制，荧光标记的EB蛋白（EB1或EB3）利用已测量MT动力较为常见的做法。因为只有EB中的MT标签的日益加结束时，显示为小（1-3微米），明亮的荧光来TS，从而提供MT聚合的容易辨别的标记具有非常有限的背景荧光34-37。而EB的标签仅在MT阵列的子集表示的EB方法的一个主要优势的事实，同时也突出其中一个重要的限制，即非生长的MT不被EB3方法进行标记。然而，衡量和跟踪一段时间EB3彗星和可视化的亚细胞区域内MT生长的能力使这种方法非常适用于需要MT组织区域评价的应用程序。 传统方法的测量MT增长动力的另一个关键限制是非常大的数据集和数据分析所需的时间。这种限制从需要数百EB彗星在高时间分辨率的专人跟踪茎。此外，这些测量需要在细胞的统计学显著号码来完成，并还根据多种控制和experime的执行ntal条件。最近，这些限制是通过使用时间推移显微镜在活细胞中35专门针对跟踪EB3彗星计算分析技术克服。当适当地使用，这种计算方法用来既限制用于与手跟踪除了提供用于测量的MT聚合的高通量方法相关联的人为错误的可能性。使用基于Matlab的软件包MT动力学的计算分析，plusTipTracker，允许通过跟踪荧光标记EB3彗星5,31,35,38吨增长的测量。此外，plusTipTracker软件允许的基础上不断增长的MT轨道内EB3彗星消失MT灾难事件（ 又名拆卸）的计算，并允许感兴趣的用户自定义区域内的MT生长动态亚细胞（ 又名区域）分析。对于我们的研究，MT生长动态进行了比较内支链区域与非支化的区域，或在导致与尾随小区边缘。从plusTipTracker软件数据输出也可以用于产生单个细胞和亚细胞区颜色编码轨道重叠。 在这里，我们描述了用于研究MCAK在调节MT增长动力，这MT解聚酶欧共体的分支形态和定向迁移的调节的贡献作用的方法。我们的方法中使用的原代人细胞系，人脐静脉内皮细胞（HUVECs），这是很容易培养和高度适合于质粒的cDNA的电穿孔诱导的瞬时转染。然后，我们使用的高分辨率，与MT结束转脐静脉内皮细胞结合蛋白3（EB3）和有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（MCAK）特异性cDNA的时间推移荧光显微镜结构，以评估对MT的动态影响血管内皮细胞转染。 EB3基于PlusTipTracker，计算图像分析标记的MT加两端是衡量MT的增长速度和增长MT在寿命时间推移图像，测量和比较的MT增长动力实验操作的影响。这种方法允许MT动力学的研究和亚细胞区域内MT动力学的本地化调控如何促进欧共体分支和迁移的血管生成过程的鉴定。这些技术适用于可荧光标记，并表示在活细胞中的任何MAP的调查。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aurora A Inhibitor I</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>99462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;mouse IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-1688-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-7788-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET455/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET525/36m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET605/70m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET605/70m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET700/75m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET700/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>RPI Products</td>
			<td>A30075-100.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clara cooled charge-coupled device camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>77026010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyelight 649 goat anti-rat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112-496-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-MV SingleQuot Supply &#38; Growth Factors (contents shown below)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum 25 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine brain extract 2.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL)&#160; 10.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic shutter</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>77016099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-036-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8006-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TiE</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI Technologies</td>
			<td>MS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>CS70330-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MCAK</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS310000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>Contains the electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2021854-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plusTipTracker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti&#8211;pT288&#8211;Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti&#8211;&#945;-tubulin</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA78G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>678-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk&#160;</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Yokagawa CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

HUVEC培养活细胞显微镜 表达荧光蛋白的HUVECs活细胞成像需要内皮细胞保持在适合于正常细胞生长和维持，以及正常的蛋白质表达和功能的环境。 图1示出了协议的示意图用于制备缓冲和封闭的系统，保持最佳的光学特性，用于收集活细胞的时间推移的图像。双面胶带的细条放在载玻片上（ 图1A）和然后将含有培养的内皮细胞的盖玻片倒置上，使得细胞被面对滑动（ 图1B）的带的顶部。以这种方式，在磁带提供了两个玻璃表面之间的小的间隙，并创建在其中细胞可以在适当的细胞培养介质中沐浴的空间（ 图1C;见协议4，段）。一世呐最后步骤中，玻璃盖玻片密封到使用凡士林载玻片：羊毛脂：石蜡（1：1：1的混合物VALAP; 图1D），以建立一个封闭的系统。用于EB3彗星的两个较短的时间序列成像和分支较长的时间顺序和迁移实验，这种细胞培养方法。此外，VALAP的蜡样稠度允许从载玻片和盖玻片在成像结束时容易除去实验，使得辅助方法，包括固定和免疫标记（参见议定书8），可在同一盖玻片和细胞样品来进行这是使用活细胞成像的方式可视化。 <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> 图1：HUVEC培养活细胞显微成像方法研究 （ 一 ）切2个双面胶带成0.65厘米×2。50厘米矩形条和保护双面带的一个片沿着滑动的顶边水平地，另一块，沿着滑动的底部边缘。它允许的带和滑动边缘之间空间少量用于如（D）中所描述的密封的腔室是重要的。 （B）中使用镊子除去含内皮盖玻片并反转在磁带上的多条顶部的盖玻片（细胞面朝下）。 （C）使用微量吸管，加入盖玻片与载玻片之间的成像介质的40微升（完整内皮基础培养基补充有25微米HEPES）。确保盖玻片与载玻片之间的空间完全充满成像介质，并避免气泡。使用吸气器沿盖玻片边缘如果需要除去多余的介质。 （D）用温水VALAP（1：1：1凡士林：羊毛脂：石蜡），以密封围绕盖玻片的边缘。检查成像介质泄漏S按轻轻推动各地盖玻片上。使用其他VALAP补救。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a> 荧光标记EB3的自动跟踪使得整个细胞和地区MT增长动力的综合分析。在EB3蛋白质的清晰，层次分明，具有很强的时间和空间分辨显微图像的采集是在细胞内EB3走势的分析是必不可少的。荧光标记EB3的HUVEC表达从细胞广泛变化到细胞和荧光强度通常在一段hr的同一小区内增加。因此，审议并以识别MT生长动态EB表达增加的潜在影响监测表达谱这些变化是很重要的。这最好通过评估灰阶荧光intensit完成Ÿ型材每个成像单元格，然后限制数据分析，那些显示在规定的灰度表达谱范围的单元格。的表达谱的数据集的初始评价是至关重要的，并且应该与由plusTipTracker软件为每个小区得到的MT生长动力学数据进行比较。表达谱可以针对MT的生长速度和对实验组中的每个细胞的MT生长寿命被绘制，以确定灰度表达的所需范围，并确定潜在异常值。 图2亮点HUVEC纤维连接蛋白基质上培养（见上文协议2.1），并表示近马普尔标记EB3的最佳水平。荧光EB3彗星示于一段12秒（ 图2A）的时间推移一系列图像。使用plusTipTracker软件EB3彗星分析涉及的自动化，一帧一帧的EB3彗星DETEction（绿色和黄色点， 图2B）。每帧中检测的彗星被链接，取决于它们在适当的位置从帧到帧的变化，以产生EB3轨道和一个视觉EB3轨道覆盖（ 图2C-F）。轨道覆盖的彩色编码和颜色的区分可以通过用户输入的参数来确定。通常，这些区分使用的MT生长速度和MT增长寿命5,31的全 ​​球平均从而将数据分成四组：缓慢和短命（红色），缓慢和长寿命（黄色），快速，短期住（绿色），以及快速和长寿命的MT生长（蓝色; 图2G）。 EB3的标记MT增长动力PlusTipTracker介导的跟踪也使得利息（投资回报）​​的用户自定义的区域。 PlusTipTracker从用户定义的ROI（ 图2A，B和F）中提取的MT增长的轨道数据，从而允许MT生长DYNAM的比较同一小区的不同区域内的IC。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> 图2：EB3 彗星探测，跟踪和plusTipTracker数据输出 （A）一HUVEC表达马普尔EB3的时间推移电影。左侧面板显示demarking小区边界的全细胞观点和全细胞面膜（白线）。红色框代表在时间推移的图像（右图）中所示的放大的区域。右面板显示在连续的影像帧（T = 0秒 - T = 12秒）EB3彗星的原始灰阶时间推移图像。 （B）EB3彗星plusTipTracker检测从（A）中所示的图像。左侧面板显示检测彗星（黄点）的全细胞图。红色框代表在时间推移的图像（右图）中所示的放大的区域。右面板突出显示五行检测EB3彗星（红色箭头）和跟踪这五个彗星在12秒的成像周期。绿色<html>点代表检测到没有在以前的时间间隔存在（或者没有检测到）EB3彗星。 （C）在（A）中所示的EB3彗星的61帧（2分钟的电影）的最大强度投影。 （D）（C）中所示的相同的61帧（2分钟的电影）的plusTipTracker MT轨道覆盖。最大强度投影（E）变焦（在C红色框）。最大强度投影plusTipTracker MT轨道覆盖的（F）变焦（在D中红色框）。 （G）彩色编码为（D）所示的轨道覆盖和（F）的传说。被指定为慢，快，短期或长期居住是基于一组十个马普尔-EB3内皮细胞表达在测量的所有曲目增长的平均值。为了更容易的可视化，使用（A）中所示的单元图像的反转像素强度产生在（D）和（F）的轨道重叠。比例尺= 20微米。/files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg“目标=”_空白“&gt;点击此处查看该图的放大版本。 HUVEC分支和迁徙模式是机械性物理从ECM的信号敏感。 内皮细胞是公知的响应到各种类型的信令线索，并且在这样做时，要经历听写到特定信令线索（多个）36,40-42适当的细胞应答形态学改变。内皮细胞纤连蛋白涂覆的玻璃基板（ 图3A）中培养，或在硬2-维聚丙烯酰胺的ECM（55千帕）典型地显示圆形或细长的形态与几个不同的支链突起（ 图3B）。然而，在培养非常柔软2维聚丙烯酰胺的ECM（0.7千帕）时，显示内皮细胞是已知的导致一个高度支化形态的合规性诱导下调肌球蛋白II收缩4,5,31（ 图3C）的规定。因此，血管内皮细胞调节通过ECM mechanosensing它们的细胞形态，并且这是通过MT动力学和雅图肌球蛋白收缩的局部调制来实现的。 因为内皮细胞显示多种形态的属性，以便测量的HUVEC分支关键是要首先定义的支链突起是什么，然后以定义如何支突起将被客观测量。一种技术使用通过由手跟踪使用表达的荧光量的标记来定义小区边缘（ 图 3D）的细胞的图像中的所述电池的边缘所产生的小区边界或“掩模”四步的方法。以下掩模生成，分支起源通过定位支突起和电池主体之间的曲率最大角度限定。一条线被吸引到德玛RK的“分支来源”（紫角度的线; 图3E）。分支数是通过用限定分支原点（ 图3F）计数分支数简单地进行测定。分支长度被从分支来源到远端分支尖端（ 图3G）的距离进行测定。为了避免夹杂物从数据分析小lamellipodial突起，附加的标准要求分支必须更长（“分支长度”），大于宽度（在“分支原点”），并且该分支的长度必须5至少十微米31。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> 图3：HUVEC分支形态分析 （A - C）内皮细胞的DIC图像的例子对纤维连接蛋白镀膜玻璃的ECM（A）硬（55千帕），聚丙烯酰胺的ECM（B）和软培养（0.7千帕），聚丙烯酰胺的ECM（C）。在分支血管内皮细胞急剧增加了0.7千帕聚丙烯酰胺的ECM（C）培养相比，更严厉的ECM（A，B）。 （D）。转染HUVEC的DIC显微图像（左图）表达马普尔-C1的cDNA构建（细胞体积标记;右图）。 （E）通过定位曲率最大角度定义分支来源（ 即 ，其中所述膜显示最大曲率的位置;紫色线）上的分支的两侧，然后用直线连接角（蓝线） 。 （ 六 ）确定和选择从“分支来源”（在电子商务中定义）延长&gt; 10微米的分支突起。算支突起的数目，以获得“分支数”。 （G）从“分支来源”的中心到莫测量的距离ST远端点使用NIS Elements软件的注释和测量应用程序，以获得该行工具的分支“分支长度。”比例尺= 20微米。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a> 除了传感ECM合规性，血管内皮细胞也感知和消除引起的划痕伤人相邻的细胞接触的回应。在迁移测定中，内皮细胞在单层培养经受划痕和迁移特性进行测试（见协议9，段）。由刮伤单层感应伤口后，伤口边缘的HUVECs极化通过开发延伸到伤口（ 图4A，T = 0小时），一个凸前缘。超过10-12小时的时间过程中，偏振伤口边缘的HUVEC迁移到伤口区域和填充伤口，建立一个新的融合单层（ 图4A，T = 11小时）。与HUVEC分支，目前的证据表明，极化和迁移是严重依赖于MT的协调重新组织和肌动蛋白细胞骨架43-49。做到这一点，在部分地通过在前缘MCAK诱导的MT拆卸的局部抑制，但不能在伤口边缘的HUVECs 31的后缘。 MT动力学的灵敏度伤口诱导的极化由Rac1的GTP酶，其靶向众多下游调节蛋白，包括极光A激酶是磷酸化并在前缘抑制MCAK，以及其它激酶，其能够抑制或激活MAP​​的发起局部调节MT增长和收缩18,31,36,48,50-53。大量的实验证据支持前沿突和后缘收缩协调是通过Rac1的激活周期管辖的概念以促进在前缘的MT组件和RhoA活化雅图肌球蛋白收缩在后缘处，从而驱动定向蠕动9,41,51,52,54-58。 迄今为止，还没有用于进行细胞迁移的自动跟踪的既定方法。这是在计算上分析细胞-ECM边界被一致地改变，因为伤口边缘单元极化和迁移困难的结果。虽然许多软件程序能够跟踪荧光标记细胞59-64的，荧光的在伤口边缘迁移实验标记内皮细胞群是总的HUVEC人口的约30％-40％，因此，大多数的伤口边缘单元的绝通过相衬或DIC成像可视化。此外，当测量伤口边缘迁移来评估同一伤口内的荧光和非荧光的细胞，以确定具体的是很重要的表达的影响都在实验研究组和实验研究组之间构建。目前，为了测量的HUVEC的迁移，最好的方法是使用其中一个伤口边缘单元被首先识别，然后将细胞核和核仁被识别（ 图4B）手跟踪的方法。核仁被用作细胞跟踪的位置决定，由于其高的光散射的密度和相对小的尺寸。核仁的这两个特点使其更易于识别和限制，用户可以将单个的轨道位置上的面积减小测量误差。的HUVEC迁移的轨道，然后通过点击在连续的时间推移图象帧核仁生成。最后，移动速度和移动距离，以原点被测量并用于控制和试验电池组（ 图 4B）进行分析。 <img alt="图4"SRC =“/文件/ ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg”/&gt; 图4： 伤口边缘内皮细胞迁移和跟踪分析的11小时时间推移成像系列划痕边缘内皮细胞（ 又名 “迁移实验”）的（A）20X相差图像。迁移的伤口和方向面板T = 0小时表示。内皮示越过伤口边缘和提前进入伤口直到形成细胞单层（T = 3.5小时 - T = 11小时）。 （B）迁移测定时间推移成像分析（如图A）中，首先需要基于小区位置的可追踪伤口边缘的HUVEC的识别（ 即细胞物理地在伤口的边缘）和表达谱（ⅰ.E。选择一个绿色的伤口边缘的细胞，如果实验涉及到GFP的表达）。使用相位对比图像，识别细胞核和核仁。手使用的跟踪在连续时间推移图像核仁符号及测量NIS Elements软件应用程序，确定移动速度和距离产地。比例尺= 100微米（A），20微米（B）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

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