Name: high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells at JoVE.com

Særlig tak til Dr. Clare M. Waterman for mentorskab og diskussioner, Michelle Baird og Mike Davidson til at give mange af de fluorescerende cDNA-konstruktioner, der anvendes i disse undersøgelser, og Kathryn Applegate og Gaudenz Danuser til udvikling plusTipTracker MT analysesoftware. Dette arbejde blev støttet delvist af en bevilling til KAM fra National Heart Lung og Blood Institute (NHLBI) og National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

Brug HUVEC&#39;er i morfologi og Migration Eksperimenter. Live-cell imaging af EB3-mærket MT vækstdynamikken inden HUVEC&#39;er kræver passende og reproducerbare celle dyrkningsbetingelser for at måle og evaluere ændringer i MT vækst og HUVEC morfologi, således at de derefter kan tildeles til en ECM signalering cue. HUVEC&#39;er repræsenterer en fremragende model til undersøgelse celleform og motilitet. De er meget modtagelig for transfektion med fluorescens-mærkede cDNA, udviser de dramatiske morfologier som reaktion på både opløselige og fysiske signalsystemer signaler, og de ​​opretholder evnen til at organisere sig i vaskulære rør når opstilles passende celle dyrkningsbetingelser 65-70. Primære cellekulturer, såsom HUVEC&#39;er, kræver omhyggelig håndtering og overvågning af celle passage nummer for at sikre, at cellerne er sunde, og at de vil opføre sig normalt under eksperimenter. For eksempel når der udføres forsøg undersøger cytoskeleton og / eller cellemorfologi, bør HUVEC&#39;er ikke anvendes til forsøg ud over den tiende cellekultur passage, som HUVEC&#39;er typisk begynder at vise ikke-ensartede morfologier ved passage tolv til femten. Celledensitet er også et kritisk regulator af HUVEC sundhed og proliferation. HUVEC branching undersøgelser (se protokol 10.1-10.4, ovenfor) anvender kulturer relativt lave celletæthed for at give cellerne fysisk plads til at interagere med deres ECM og udvide forgrenede fremspring. I modsætning hertil sår-edge migrationsstudier (se protokol 10,5-10,8), HUVEC&#39;er er kultur på et monolag inden sårdannelse. Som sådan sår-edge HUVEC&#39;er vise en forholdsvis un-forgrenet morfologi, udvide forkant fremspring, og udviser celle-celle-interaktioner med deres umiddelbare naboer, når de trækker ind i såret. Forbehold og Fordele ved Tracking MT Dynamics i Living HUVEC&#39;er. Roterende skive mikroskopi er en fremragende tilgang tilafprøve eksperimentelle hypoteser, der kræver konfokal billede klarhed med høje tid-opløsning. Med den passende kamera og laser modul, denne mikroskopi tilgang er følsomt over for lav emission fluorescens og kan støtte i reduceret fotoblegning sammenlignet med andre typer af fluorescensmikroskopi. Vigtigere er denne tilgang også velegnet til moderat til høj tid-opløsning billeddannelse som er nødvendig for at generere omfattende målinger af MT vækstdynamik ved hjælp af EB3 tilgang mærkning, i en række forskellige celletyper. Mens EB3 metode til mærkning voksende MT plus-ender har forskellige fordele frem for andre metoder til fluorescens mærkning MTS, det har også unikke ulemper. For eksempel er der en del af MT-array, der ikke aktivt voksende på et givet tidspunkt, herunder både populationen af demontering MT&#39;er og populationen af stabile, ikke-dynamiske MT&#39;er 71-74. EB3 ville ikke mærke disse to populationer af MTS ogderfor bidraget fra disse to populationer vil ikke blive inkluderet i eksperimentel dataanalyse. Alternative metoder til evaluering af hele MT-array har fokuseret på ekspressionen af ​​fluorescens-mærkede tubulin, som inkorporerer i alle populationer MTS og giver mulighed for identifikation af dyrkning, faldende, og stabile MTS. På grund af den relativt høje tæthed af MT arrayet nær centrum af cellen og støder op til mikrotubulus organisere centrum (MTOC), mærkning hele MT arrayet skaber en ulempe i at udføre billedanalyse af MT ender, er ikke nær cellen periferien 75-77. Eksperimenter under anvendelse af to-farve co-mærkning af MT&#39;er med fluorescerende tubulin og fluorescerende EB3 med levende celler har afsløret, kvalitativt, at langt størstedelen af tubulin-mærkede MT&#39;er er også EB3-mærket 78. Derudover har der ikke været en effektiv metode til automatiseret sporing af MT&#39;er mærket med fluorescerende tubulin. Det betyder, at data Samlingernetion og målinger af MT dynamik i celler, der udtrykker fluorescerende tubulin kræver hånd sporing af individuelle MTS, en proces, der er risiko for fejl og kedelig. Som følge heraf er automatiseret beregningsmæssig analyse af EB3 mærkede MT&#39;er blevet den foretrukne metode til måling MT dynamik, som det kan anvendes til MT dynamics eksperimenter på tværs af forskellige celletyper og inden for en række eksperimentelle regimer 35,79. Sammenkædning MT Growth Dynamics til HUVEC morfologi og Migration. Set fra et cytoskelet investigator, en særdeles nyttig tilpasning af plusTipTracker automatiseret sporing analyse er evnen til at måle og evaluere både hele celle- og regionale ændringer i MT vækstdynamik. Kravet om en celle til at blive polariseret er en væsentlig forudsætning for retningsbestemt celle migration. Som sådan, polariserede signalsystemer tidskoder længe har været kendt som centrale drivkræfter for retningsbestemt cellemigration 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. For eksempel opløselige signaleringsmolekyler såsom VEGF inducerer actinpolymerisation og MT vækst mod VEGF cue i endotheliale celletyper 2,82-87. Derudover er der i respons på fysiske interaktioner med ECM (f.eks overholdelse og dimensionalitet mechanosensing), HUVEC&#39;er modulere deres MT dynamik ved lokalt at regulere MAP&#39;er at fremme MT vækst inden forlængende forgrenede fremspring, og dette tjener til at styre HUVEC migration i retning af cue 5,31,88. , Polarisering som reaktion på ekstracellulære signalsystemer tidskoder fremhæver således behovet for eksperimentel evaluering af lokaliserede ændringer i cytoskeletale dynamik. Samtidig live-cell imaging af MT vækstdynamik (ved hjælp af EB3 tilgang) og HUVEC celle migration er yderst vanskeligt at udføre, fordi MTS vokse på en tidsskala sekunder, mens ændringer i cellemorfologi og retningsbestemt migration forekommer på en tidsskala timer. Men begge processer er intimt Linked. Desuden kontinuerlig, hurtig billeddannelse af fluorescens-mærket EB3 på anden tidsskala fører til fotoblegning af EB3 signal. Forsøg på at overvinde dette problem ved at gennemføre korte imaging række EB3 (1-2 min erhvervelse serien) hver 30 minutter har været en succes, men kunne kun ske i et lille antal EC&#39;er, der havde optimale udtryk for EB3 og det gjorde ikke vise negativ effekter til gentagen laserbelysning 5. En alternativ metode, der giver mulighed for fortolkninger af, hvordan MT vækstdynamik bidrager til ændringer i cellemorfologi og migration er plusTipTracker Region of Interest (ROI) værktøj 35 (se protokol 6.6). Denne metode giver mulighed for hel celle MT vækst spor at være opdelt i brugerdefinerede områder, hvorfra MT vækst spor derefter kan udvindes og analyseres. For eksempel har sammenligninger af &quot;forgrenet&quot; kontra &quot;ikke-forgrenede&quot; regioner af cellen vist, at MT&#39;er vokse mere sringe og mere vedholdende inden forgrenede regioner sammenlignet med den ikke-forgrenede celleperiferi 5. I polariseret sår-kant HUVEC&#39;er, sammenligninger af de førende kant og bagkant MT vækstdynamik afslørede, at MCAK-induceret MT demontering hæmmes specifikt i forkanten, men ikke bagkanten. Regional evaluering af førende og bagkant MT vækstdynamikken i HUVEC&#39;er udtrykker Rac1 og / eller phosphoryleringsbegivenheder mutanter af MCAK afslørede endvidere, at Rac1-induceret aktivering af Aurora-A kinase specifikt og lokalt hæmmer MCAK aktivitet i forkanten til at køre HUVEC polarisering og retningsbestemt migration 31. Således har kombinationen af ​​automatiserede sporing af MT vækstdynamik og regional evaluering af MT vækstdynamikken inden de forgrenede fremspring og / eller forkanten af ​​sår-kant HUVEC&#39;er tilladt os at linke MT vækstdynamikken til HUVEC morfologi og migration. De beskrevne protokoller er designed at tilvejebringe et generelt ligetil og yderst repeterbar metode til HUVEC kultur og eksperimentel undersøgelse. Alligevel er mange af de protokoller detaljer er komplekse og tidskrævende, hvilket på sin side giver mulighed for fejl eller problemer med at gennemføre den eksperimentelle metode. Mens det blev forsøgt at løse potentielle problemer i hele protokollen, her gives yderligere, detaljeret fejlfinding af potentielle problemer, der er mindre almindelige eller på anden måde forkortet noter inden metodologicentre protokoller. Relateret til coating dækglas med polyacrylamid-substrater (protokol 2,2), et fælles problem, der opstår, er den komplekse karakter af aktiverende dækglas, kobling polyacrylamid til glasset, aktiverende polyacrylamid, og derefter kobling af ECM til polyacrylamid. En særlig vanskelig og potentielt problematisk trin dyrkning HUVEC&#39;er onto fibronectin / polyacrylamidgel efter eksponering af polyAcrylamide-overtrukne dækglas til 2 mM sulfo-SANPAH (trin 2.2.2.6, ovenfor). Det er afgørende for succes for dyrkning HUVEC&#39;er på disse substrater, sulfo-SANPAH fjernes helt fra det eksperimentelle system efter ECM konjugation. Dette kan bedst opnås ved vask med Hedeselskabet 2 O og inkubere dækglassene i Hedeselskabet 2 O på et rysteapparat natten over. Hvis celler dyrket på polyacrylamid ECM&#39;er ikke overlever, eller hvis levedygtighed er mindre end forventet, forøget og gentagen vask af sulfo-SANPAH efter konjugering til fibronectin (trin 2.2.2.9) anbefales til potentielt afhjælpe dette problem. Relateret til protokol 3 (cDNA transfektion og HUVEC kultur på et dækglas), en stor indflydelse på succesen af ​​elektroporation procedure er håndteringen af ​​HUVEC&#39;er både under trypsinisering af cellerne for at fjerne dem fra plastflaske, og efter indgåelsen af elektroporation (trin 3,3-3,4, ovenfor). Det er afgørende at plejefuldt overvåge HUVEC&#39;er mens i trypsin, og ikke at overskride den nødvendige tid til cellerne til &quot;rund-up&quot; på overfladen af ​​flasken (typisk 1-2 min). Overdreven tid i trypsin er en væsentlig årsag til HUVEC dødsfald, der ikke er typisk realiseres, før cellerne udpladet på fibronectincoatede dækglas (trin 3.4) og derefter ikke vedhæfte til substratet. Lige så vigtig, behøver HUVEC&#39;er (og de fleste primære celletyper) ikke klare sig godt, når suspenderet for lange gange i elektroporation buffer. Under større målestok eksperimenter, for eksempel, hvor brugeren har fem eller flere tilstande, der kræver elektroporering, er det bedre at holde cellerne pelleteret i individuelle rør (1 tube pr transfektion) og at blande dem, one-at-a-time , i elektroporation buffer umiddelbart før elektroporering. Denne fremgangsmåde minimerer inkubationstid i elektroporation puffer og maksimeret HUVEC overlevelse. Derudover øjeblikkelig redning i komplet dyrkningsmedier er også crtiske efter elektroporering. Rescue forsinkelser på et minut eller mere efter elektroporation kan resultere i næsten fuldstændig HUVEC død og derfor bør undgås. Relateret cellemigrationsassay (protokol 9), teknikken med dyrkning HUVEC&#39;er ved ekstremt høj tæthed afhænger af en kritisk modifikation (beskrevet i trin 9.2) af den traditionelle HUVEC cellekultur metode (beskrevet i protokol 3), der kræver tørring af fibronectin coatede dækglas således at HUVEC kultur i et meget lille område af dækglasset. Ofte gange, hvis dækglasset ikke er helt tør, eller hvis en forudgående belægning af dækglasset med fibronectin (trin 2.1 eller 2.2) var ikke effektive, medierne-holdige celler, der er placeret på dækglasset vil miste sin overfladespænding og udvide til kanter af dækglasset, og derved reducere densiteten af ​​celler på dækglasset. En metode til at foretage fejlfinding af dette potentielle problem er at aspirere mediet fra dækglasset og derefterplacere dækglasset (stadig i sin 35mm skål) i bagsiden af ​​biosikkerhed kabinet til 5-10 min. Denne tilpasning kan bidrage til at tillade strømmen af ​​luft i kabinettet for at hjælpe med tørring af skålen. Hvis nogen synlig væske forbliver på dækglasset efter lufttørring, suge væsken pletter og igen lad det lufttørre i 5-10 ekstra minutter i biosikkerhed kabinet. Det er vigtigt at bemærke, at der er ingen måde helt at undgå dette potentielle problem, men det bliver mindre af et problem med gentagne praksis af protokollen. Det er også en fejlfinding anbefaling, at når de forbereder dækglas for cellemigrationsassay (eller en hvilken som helst assay, i almindelighed), for at forberede ekstra dækglas og har ekstra HUVEC&#39;er klar til at gå i tilfælde af problemer undervejs. Med disse fejlfinding overvejelser i tankerne, er det også vigtigt at understrege nytten af ​​de protokoller, der diskuteres og deres konsekvenser i fremtiden cellebiologi forskning. Anvendeligheden til polyacrylamid tilgang er omfattende, og omfatter ikke blot todimensionale studier af celle-ECM engagement (beskrevet ovenfor), men også tredimensionale undersøgelser 5. Denne applikation er afgørende for at øge vores forståelse af, hvordan HUVEC&#39;er regulere celle form og migration i fysiologiske miljøer og bør give efterforskerne en grundlæggende forståelse af, hvordan morfologiske ændringer koordineres med cytoskeletændringer. Mens de protokoller, der er beskrevet her, er fokuseret på målinger af MT vækstdynamik, at størstedelen af ​​de protokoller kan og bør tilpasses til at måle en række andre mikroskopisk målbare aspekter af celle-ECM interaktioner. Med hensyn til MT dynamik, der er mange kort, herunder mindst 14 familier af kinesiner 89, hver med en potentiel rolle ved at bidrage til HUVEC polaritet og instrueret migration, og som alle kan undersøges ved hjælp af de protokoller, der præsenteres. Fremtidige undersøgelser bør enLSO være rettet mod celle-ECM engagement i normal versus sygdomstilstande. HUVEC protokoller præsenteres her gælder for undersøgelser af normale vaskulære homeostatiske processer, samt til sygdomstilstande, herunder hjertesygdomme, retinopati, tumorvækst og metastase, for at nævne nogle få. Konjugerende synligt gennemsigtige ECMS og polyacrylamid substrater af medgørlige overholdelse mikroskopiske undersøgelser vil give mulighed for celle-ECM engagement undersøgelser således at endotelceller vaskulær angiogenese kan overvåges med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Disse typer af eksperimentelle tilgange er allerede begyndt at afsløre væsentlige forskelle i endotelceller form, polaritet, migration, og virkningerne af proteiner, der regulerer disse processer 5,31,90. Den fremtidige indsats bør sigte mod at identificere, hvordan kombinationen af ​​ECM overholdelse og dimensionalitet mechanosensing kan tjene til lokalt kontrol proteiner, der er målrettet og regulerer cytoskeletale dynamik.

Angiogenese er udløst af ekstracellulære signalering tidskoder, der fremmer endotelceller (EC&#39;er) at polarisere, migrere med retningsbestemt specificitet, og danne nye vaskulatur i væv, der kræver blodforsyning. Medvirkende faktorer menes at drive angiogenese er signaler fra den ekstracellulære matrix (ECM). Som reaktion på de fysiske signaler, EC&#39;er udvide nye filialer med retningsbestemt specificitet til at vejlede retningsbestemt bevægelse i dannelsen af det vaskulære netværk 1,2. Arkitekturen i EF morfologi og forgrening er defineret ved lokaliseret regulering af mikrotubuli (MT) cytoskeleton på en måde, der er koordineret med reguleringen af acto-myosin kontraktilitet 3. For EF grene til at danne, skal myosin-II være lokalt nedreguleret, hvilket resulterer i lokaliserede membran fremspring 4. På samme tid og på samme sted i cellen, bliver MT vækstdynamik ændret resulterer i langsom og vedvarende MT vækst for at fremme gren Elongelse og stabilitet fem. Denne koordinerede cytoskelet regulering giver EC&#39;er til at polarisere deres morfologi at lette retningsbestemt migration. Udviklingen af en polariseret celle morfologi kræver polariseret MT samling 6. Ved at migrere epitelceller MTS vokser langsomt og vedholdende specifikt på forkant af cellen 7-9; mens i neuroner, indledning og forlængelse af axoner eller dendritter kræver, at MTS er ikke kun til stede, men at de er dynamisk gennemgår processerne for montering og demontering 10-15. På denne måde, lokaliseret styring af MT vækstdynamikken bestemmer arkitekturen af ​​cellen og tillader hurtig remodellering af cellemorfologi som EC&#39;er navigere gennem deres ECM. MT vækstdynamik er reguleret af familier af molekylære motor proteiner og ikke-motoriske proteiner, kaldet mikrotubuli associerede proteiner eller mikrotubuli interagerende proteiner (herefter Referred til som Maps). MAP&#39;er kan lokalt aktiveres eller inaktiveres, typisk gennem signaleringskaskader indledt ved cellepositionen ECM grænseflade 16,17. Når aktiv, Maps funktion ved binding til MT og ændring af kinetikken for MT samling og adskillelse; derved fungerer til lokalt regulere MT dynamik for at fremme celleform og polaritet 18-20. Mitotisk Centromer Associated kinesin (MCAK) er en kinesin-13 familie MAP som binder til MT ender og par ATP hydrolyse til MT demontering 21-23. Denne funktionelle rolle af MCAK vides at være kritisk inden mitosespindelen 24-28, samt i interfasen 29,30. Inden interfase EC&#39;er, er MCAK-medieret MT demontering reguleret af lokaliseret Aurora-A induceret phosphorylering af MCAK som reaktion på sår-kant induceret aktivering af Rac1 lille GTPase. Resultatet af denne signaleringskaskade er hæmning af MCAK på forkant ECS, hvilket resulterer i polariseret MT vækst mod leading kant og MCAK-induceret MT demontering ved bagkanten migrere EC&#39;er 31. Traditionelle metoder til måling af MT vækstdynamik har typisk anvendt hånd sporing af enten fluorescens-mærkede tubulin eller senest, fluorescens-mærket MT end binding protein 1 eller 3 (EB1 eller EB3 henholdsvis). Den fluorescerende tubulin tilgang har den fordel, at mærke hele MT array. Men fordi størstedelen af mitotiske celletyper opretholde en radial række af MT&#39;er under interfase 8,32,33 MTS nær centrosom er meget tæt, og som et resultat, tracking MT vækst og adskillelse med fluorescerende tubulin er normalt begrænset til den perifere regioner af cellen. På grund af disse begrænsninger, har udnyttelsen af ​​fluorescensmærkede EB proteiner (EB1 eller EB3) været den mere fælles tilgang til måling MT dynamik. Fordi EB&#39;er kun mærke de voksende plus-ender MTS, vises de som små (1-3 um), lyst fluorescerende kommerts, hvilket giver et let skelneligt markør for MT polymerisation med meget begrænset baggrundsfluorescens 34-37. Mens det faktum, at EBS etiket kun en delmængde af MT arrayet er en stor styrke af EB tilgang, det også fremhæves én vigtig begrænsning, er at ikke-voksende MT&#39;er ikke mærket af EB3 tilgang. Ikke desto mindre er evnen til at måle og spore EB3 kometer over tid og til at visualisere MT vækst inden sub-cellulære regioner gør denne fremgangsmåde velegnet til applikationer, der kræver regional evaluering af MT organisation. En anden kritisk begrænsning af traditionelle metoder til måling MT vækstdynamik har været meget store datasæt og den tid, der kræves til dataanalyse. Denne begrænsning skyldes behovet for hånden sporing af hundredvis af EB kometer på høje tid opløsning. Desuden skal gøres på en statistisk signifikant antal celler og også udført under forskellige kontrol- og experime disse målingerntal forhold. For nylig har disse begrænsninger blevet overvundet gennem beregningsmæssige analyse teknikker specifikt rettet mod sporing EB3 kometer ved hjælp time-lapse mikroskopi i levende celler 35. Når det bruges korrekt, denne beregningsmæssige tilgang tjener til både begrænser risikoen for menneskelige fejl i forbindelse med hånd-sporing ud over at give en high-throughput metode til måling MT polymerisering. Computational analyse af MT dynamik ved hjælp af MatLab-baserede software-pakke, plusTipTracker, giver mulighed for målinger af MT vækst ved at spore fluorescens-mærkede EB3 kometer 5,31,35,38. Derudover plusTipTracker software giver mulighed for beregninger af MT katastrofebegivenheder (aka afmontering) baseret på forsvinden EB3 kometer inden for et voksende MT spor, og giver mulighed for sub-cellulære (aka regionale) analyse af MT vækstdynamikken inden brugerdefinerede områder af interesse . For vores undersøgelser blev MT vækstdynamik sammenlignet indenforgrenede regioner versus ikke-forgrenede regioner, eller inden for førende versus efterfølgende celle kanter. Udlæst fra plusTipTracker software kan også anvendes til at generere farvekodede spor overlays til individuelle celler og subcellulære regioner. Her beskriver vi metoden til at undersøge den rolle, MCAK i modulerende MT vækst dynamik og bidrag denne MT depolymerase til reguleringen af ​​EF forgrening morfologi og retningsbestemt migration. Vores tilgang anvendes en primær human cellelinie, Human navleveneendotelceller (HUVEC&#39;er), som er let dyrkes og stærkt modtagelige for elektroporering-induceret, transient transfektion af plasmid cDNA. Vi brugte derefter høj opløsning, time-lapse fluorescens mikroskopi af HUVEC&#39;er transficeret med MT end binding protein 3 (EB3) og Mitotisk Centromer Associated kinesin (MCAK) -specifik cDNA konstruerer at vurdere effekter på MT dynamik transficeret HUVEC&#39;er. PlusTipTracker-baserede beregningsmæssige billedanalyse af EB3-mærket MT plus ender var at måle MT vækst hastigheder og MT vækst levetider i time-lapse billeder, til at måle og sammenligne effekten af ​​eksperimentelle manipulationer på MT vækstdynamik. Denne metode giver mulighed for studiet af MT dynamik og identifikation af, hvordan lokaliseret regulering af MT dynamik inden sub-cellulære regioner bidrager til angiogene processer EF forgrening og migration. Disse teknikker er gældende for efterforskningen af ​​MAP, der kan fluorescensmærkede og udtrykt i levende celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aurora A Inhibitor I</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>99462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;mouse IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-1688-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-7788-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET455/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET525/36m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET605/70m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET605/70m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET700/75m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET700/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>RPI Products</td>
			<td>A30075-100.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clara cooled charge-coupled device camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>77026010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyelight 649 goat anti-rat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112-496-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-MV SingleQuot Supply &#38; Growth Factors (contents shown below)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum 25 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine brain extract 2.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL)&#160; 10.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic shutter</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>77016099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-036-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8006-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TiE</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI Technologies</td>
			<td>MS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>CS70330-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MCAK</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS310000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>Contains the electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2021854-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plusTipTracker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti&#8211;pT288&#8211;Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti&#8211;&#945;-tubulin</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA78G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>678-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk&#160;</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Yokagawa CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

HUVEC kultur for levende celle mikroskopi Live-cell imaging af HUVEC&#39;er udtrykker fluorescerende proteiner kræver, at HUVEC&#39;er opretholdes i et miljø, der er egnet til normal vækst og vedligeholdelse celle, samt normal proteinekspression og funktion. Figur 1 viser en skematisk afbildning af den anvendte protokol til fremstilling af en pufret og lukket system, der opretholder optimeret optiske egenskaber til opsamling time-lapse billeder af levende celler. Tynde strimler af dobbeltsidet tape anbringes på et objektglas (figur 1A) og derefter dækglasset indeholdende den dyrkede HUVEC&#39;er inverteres oven på båndet, således at cellerne vender mod glas (figur 1B). På denne måde båndet tilvejebringer et lille mellemrum mellem de to glasflader, og skaber et rum, i hvilket cellerne kan badet i passende celledyrkningsmedier (figur 1C, se protokol 4, ovenfor). jegna sidste trin er dækglas forseglet til objektglasset under anvendelse af en vaseline: lanolin: paraffin (1: 1: 1 blanding, VALAP; figur 1 D) at etablere et lukket system. Denne cellekultur fremgangsmåde blev anvendt til både kortere sekvens billeddannelse af EB3 kometer og for længere tid sekvens forgrening og migrationseksperimenterne. Derudover vokslignende konsistens VALAP tillader nem fjernelse fra objektglas og dækglas i slutningen af ​​et billeddannende eksperiment, således at supplerende tilgange, herunder fiksering og immunomærkning (se protokol 8), kan udføres på samme dækglas og celleprøve der blev visualiseret under anvendelse af live-cell imaging tilgang. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Figur 1:. Metode af HUVEC kultur for levende celler mikroskopisk billeddannelse (A) Klip 2 stykker af dobbeltklæbende tape i 0,65 cm x 2.50 cm rektangulære strimler og sikre et stykke dobbeltklæbende tape vandret langs den øverste kant af objektglasset, og det andet stykke, langs den nederste kant af objektglasset. Det er vigtigt at tillade en lille mængde plads mellem båndet og objektglasset kant til forsegling af kammeret som beskrevet i (D). (B) Under anvendelse af pincet fjerne dækglasset indeholdende HUVEC&#39;er og invertsukker dækglasset (celle nedad) oven på stykker tape. (C) Ved anvendelse af en mikropipette, tilsættes 40 pi billeddannende medie (komplet endotel basalt medium suppleret med 25 pM HEPES) mellem dækglasset og objektglasset. Sørg for, at rummet mellem dækglasset og slide er helt fyldt med imaging medier og undgå bobler. Brug en aspirator langs kanten af ​​dækglasset for at fjerne overskydende medier, hvis det er nødvendigt. (D) Brug varmt VALAP (1: 1: 1 vaseline: lanolin: paraffin) at forsegle omkring kanterne af dækglasset. Kontroller for billeddannende medier lækages ved at skubbe rundt forsigtigt på dækglasset. Brug ekstra VALAP at afhjælpe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> Automatiseret sporing af fluorescens-mærket EB3 muliggør omfattende analyse af hele celler og regionale MT vækst dynamik. Indsamlingen af ​​klare, tydelige og meget tid og rum-løst mikroskopiske billeder af EB3 protein er afgørende for analysen af ​​EB3 bevægelser inden i cellen. HUVEC ekspression af fluorescens-mærket EB3 varierer meget fra celle til celle og fluorescensintensiteten øger typisk inden for samme celle over en periode på timer. Således er det vigtigt at overveje og overvåge disse ændringer i udtryk profil for at identificere potentielle virkninger af øget EB udtryk på MT vækstdynamik. Dette opnås bedst ved at evaluere grå-skala fluorescens intensity profiler for hver afbildet celle, og derefter begrænse dataanalyse til de celler, der udviser et defineret område af grå skala udtryk profiler. Indledende vurdering af udtryk profil datasæt er kritisk, og bør sammenlignes med MT vækstdynamik data, der opnås ved plusTipTracker software til hver celle. Udtryk profiler kan plottes mod MT vækst hastighed og MT vækst levetid for hver celle i en forsøgsgruppe, for at bestemme det ønskede område af gråtoner ekspression og til at identificere potentielle outliers. Figur 2 fremhæver en HUVEC dyrket på en fibronectin substrat (se protokol 2.1, ovenfor) og udtrykke nær optimale niveau af Mapple-mærket EB3. Fluorescerende EB3 kometer er vist i en time-lapse serie billeder over en periode på 12 sek (figur 2A). Analyse af EB3 kometer ved hjælp plusTipTracker software indebærer en automatiseret, frame-by-frame EB3 komet DETEktion (grønne og gule prikker, figur 2B). Kometer detekteret inden for hver frame derefter forbundet, afhængig af deres ændring i position fra ramme-til-ramme, for at generere EB3 spor og en visuel EB3 track overlay (Figur 2C-F). Track overlays er farvekodet og farve sondringer kan bestemmes ved parametre indtastes af brugeren. Sædvanligvis disse sondringer bruge den globale gennemsnit af MT vækst hastighed og MT vækst levetid 5,31 og dermed opdele data i fire grupper: langsom og kortvarig (rød), langsom og langlivede (gul), hurtige og korte levede (grøn), og hurtigt og langlivet MT vækst (blå, figur 2G). PlusTipTracker-medieret sporing af EB3-mærket MT vækstdynamik muliggør også brugerdefinerede Regioner interessepunkter (ROIs). PlusTipTracker udtrækker MT vækstsporet data inde fra brugerdefineret ROI (figur 2A, B og F), således at der sammenligninger af MT vækst Dynamics inden for forskellige områder af den samme celle. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Figur 2: EB3 komet afsløring, sporing, og plusTipTracker data output (A) tid-lapse film af en HUVEC udtrykker mapple EB3.. Venstre panel viser en hel celle visning og helcelle maske (hvid linje) demarking de cellegrænser. Rød kasse repræsenterer det zoomede område vist i time-lapse billeder (højre paneler). Højre paneler viser rå grå-skala time-lapse billeder af EB3 kometer i successive imaging rammer (t = 0 sek - t = 12 sek). (B) plusTipTracker påvisning af EB3 kometer fra de viste billeder i (A). Venstre panel viser en hel celle visning af opdagede kometer (gule prikker). Rød kasse repræsenterer det zoomede område vist i time-lapse billeder (højre paneler). Højre paneler fremhæve fem fundne EB3 kometer (røde pile) og spore disse fem kometer over 12 sek imaging periode. Grøn<html> prikker repræsenterer opdaget EB3 kometer, som ikke eksisterede (eller blev ikke påvist) i forrige tidsinterval. (C) Maksimal projektion af 61 rammer (2 min film) af EB3 kometer vist i (A). (D) plusTipTracker MT spor overlejring af de samme 61 frames (2 min film) vist i (C). (E) zoom på maksimal intensitet fremspring (rød boks i C). (F) Zoom af plusTipTracker MT track overlejring af maksimal intensitet projektion (rød boks i D). (G) Farvekodede legende for track overlays vist i (D) og (F). Betegnelse så langsom, hurtig, kortvarig eller langlivede er baseret på den gennemsnitlige værdi for alle vækst- spor målt i en gruppe af ti Mapple-EB3 udtrykker HUVEC&#39;er. For nemmere visualisering, er spor overlejringer i (D) og (F), der genereres ved hjælp inverterede pixel intensiteter af cellen billedet vist i (A). Scale barer = 20 pm./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. HUVEC forgrening og migrationsmønstre er følsomme over for mekanisk-fysiske signaler fra ECM. HUVEC&#39;er er velkendte til at reagere på forskellige typer af signalering tidskoder og i den forbindelse, at undergå morfologiske ændringer, der dikterer en passende cellulære respons på den bestemte signalering cue (r) 36,40-42. HUVEC&#39;er dyrket på fibronectin overtrukne glassubstrater (figur 3A), eller på stive 2-dimensionelle polyacrylamid ECM&#39;er (55 kPa) typisk vise en runde eller aflange morfologi med få distinkte forgrenede fremspring (figur 3B). Men når de dyrkes på meget blødt 2-dimensionelle polyacrylamid ECM&#39;er (0,7 kPa), HUVEC&#39;er vise en stærkt forgrenet morfologi, der er kendt for at resultere fra overholdelse-induceret nedregulering af myosin-II kontraktilitet 4,5,31 (figur 3C). Således HUVEC&#39;er regulere deres cellulære morfologi gennem ECM mechanosensing, og dette opnås ved lokal modulering af MT dynamik og acto-myosin kontraktilitet. Fordi HUVEC&#39;er vise en bred vifte af morfologiske egenskaber, for at måle HUVEC forgrening er det vigtigt at først definere, hvad en forgrenet fremspring er, og derefter at definere, hvor en forgrenet fremspring vil måles objektivt. Én teknik anvender en fire-trins fremgangsmåde, hvor en celle grænse eller &quot;maske&quot; genereres manuelt opsporing kanterne af cellen under anvendelse af et billede af en celle, der udtrykker en fluorescerende volumen markør til at definere celle kanter (figur 3D). Efter maske generation, er branch oprindelser defineret ved lokalisering størst ombukningsvinkel mellem den forgrenede fremspring og cellelegemet. En linje henledes på DEMArk den &quot;filial oprindelse&quot; (lilla vinklede linier, figur 3E). Branch nummer måles blot ved at tælle antallet af filialer med en defineret gren oprindelse (figur 3F). Branch længden måles som afstanden fra grenen oprindelse til den distale gren spids (figur 3G). For at undgå inddrage små lamellipodial fremskrivninger fra dataanalyse, yderligere kriterium kræver, at filialer skal være længere ( &quot;filial længde&quot;) end de er brede (ved &quot;filial oprindelse&quot;), og at filialer skal være mindst ti mikrometer i længden 5 , 31. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . Figur 3: Analyse af HUVEC forgrening morfologi (A - C) DIC billede eksempler på HUVEC&#39;er dyrket på fibronectin coated glas ECM&#39;er (A) stive (55 kPa) polyacrylamid ECM&#39;er (B) og bløde (0,7kPa) polyacrylamid ECM&#39;er (C). Forgrening forøges dramatisk i HUVEC&#39;er dyrket på 0,7 kPa polyacrylamid ECM&#39;er (C) sammenlignet med stivere ECM&#39;er (A, B). (D). DIC mikroskopisk billede (venstre billede) af en transficeret HUVEC udtrykker en Mapple-C1-cDNA konstruere (en celle volumen markør, højre billede). (E) Definer filialen oprindelse ved at lokalisere den største vinkel krumning (dvs. den position, hvor membranen viser den største krumning, lilla-farvede linjer) på begge sider af branchen og tilslut derefter vinklerne med en lige linje (blå linjer) . (F) identificere og udvælge forgrenede fremspring, som strækker sig&gt; 10 um fra &quot;gren oprindelse&quot; (defineret i E). Tæl antallet af forgrenede fremspring for at opnå den &quot;filial nummer.&quot; (G) Mål afstanden fra centrum af den &quot;filial oprindelse&quot; til most fjerneste punkt af filialen hjælp linjen værktøj i anmærkninger og målinger anvendelse af NIS Elements Software for at opnå den &quot;filial længde.&quot; Scale barer = 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> Foruden sensing ECM overholdelse, HUVEC&#39;er også fornemmer og svare eliminering af tilstødende cellulære kontakter som induceret af bunden sårdannelse. I migration assay HUVEC&#39;er dyrket i et monolag underkastes en ridse sår og migration egenskaber måles (se protokol 9, ovenfor). Efter induktion af såret ved at ridse monolaget, sår-edge HUVEC&#39;er polarisere ved at udvikle en protrusive forkant, som strækker sig ind i såret (figur 4A, t = 0 timer). Over et tidsforløb for 10-12 timer, polariserede sår-edge HUVEC&#39;er vandre ind i sårområdet og fyldesår, oprettelse af et nyt konfluent monolag (figur 4A, t = 11 timer). Som med HUVEC forgrening, nuværende tyder på, at polarisering og migration er kritisk afhængig af den koordinerede re-organisering af MT og actin cytoskelet 43-49. Dette opnås til dels ved lokal inhibering af MCAK-induceret MT demontering ved forkanten, men ikke ved bagkanten af sår-kant HUVEC&#39;er 31. Følsomheden af ​​MT dynamik viklet-inducerede polarisation initieres af Rac1 GTPase, som er rettet mod talrige downstream regulator proteiner, herunder Aurora-A kinase, som phosphorylerer og inhiberer MCAK på forkant, og andre kinaser der er i stand til at inhibere eller aktivere MAP&#39;er til lokalt modulere MT vækst og svind 18,31,36,48,50-53. Omfattende eksperimentelle beviser støtter den opfattelse, at koordineringen af ​​forkant fremspring og bagkant sammentrækning styres gennem cyklusser af Rac1 aktiveringat fremme MT samling på forkant og RhoA aktivering til acto-myosin kontraktilitet ved bagkanten, og derved køre dirigeret motilitet 9,41,51,52,54-58. Til dato er der ikke en etableret metode til at udføre automatiseret sporing af celle migration. Dette er et resultat af vanskeligheder i beregningsmæssigt analysere celle-ECM grænser, der er konsekvent skiftende som sår-edge celler polarisere og migrere. Mens mange programmer er i stand til at spore fluorescensmærkede celler 59-64, populationen af fluorescensmærket HUVEC&#39;er i sår-edge migrationseksperimenter er ca. 30-40% af den samlede HUVEC befolkning, og derfor hovedparten af sår-edge celler skal visualiseres ved fase-kontrast eller DIC billeddannelse. Desuden er det vigtigt ved sår-kant migration til evaluering fluorescerende og ikke-fluorescerende celler inden for samme sår for at identificere specifikkevirkninger af udtryk konstruerer både inden eksperimentelle studiegrupper og mellem eksperimentelle studiegrupper. I øjeblikket er den bedste fremgangsmåde til at måle HUVEC migration er at bruge en hånd sporing metode, hvor et sår-kant celle først identificeres og derefter kernen og nucleolus identificeres (figur 4B). Nucleolus anvendes som positionen determinant for celle sporing grund af sin høje lysspredning densitet og relativt lille størrelse. Disse to funktioner i nucleolus gør det lettere at identificere og reducere målefejl ved at begrænse det område, hvor brugeren kan placere individuelle spor positioner. HUVEC migration spor derefter genereres ved at klikke på nucleolus i successive time-lapse billedrammer. Endelig migration hastighed og migration afstand til oprindelse måles og analyseres for kontrol og eksperimentelle cellegrupper (figur 4B). <img alt="Figur 4"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54.265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Figur 4: Analyse af sår-edge HUVEC&#39;er og migration sporing (A) 20X fase-kontrast billeder af en 11 timers tid-lapse imaging række scratch sår-kant HUVEC&#39;er (aka &quot;Migration Assay&quot;).. Såret og retning migration er angivet i panel t = 0 timer. HUVEC&#39;er er vist at krydse såret kant og rykke ind i såret, indtil et monolag af celler er dannet (t = 3,5 timer - t = 11 timer). (B) Analyse af migration assay tid bortfalder billeddannelse (som vist i A) kræver først identifikation af en sporbar sår-edge HUVEC baseret på celle placering (dvs. celler fysisk på kanten af såret) og udtryk profil (dvs. , vælg grøn sårkanten celle hvis eksperimentet involverer ekspression af GFP). Brug af fase kontrast billede, identificere kernen og nucleolus. Hånd spore nucleolus i successive time-lapse billeder med ennotationer og målinger ansøgning i NIS Elements software til at bestemme migration hastighed og afstand til oprindelse. Scale barer = 100 um (A), 20 pm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells at JoVE.com

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse af Random migration af celler Brug af Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Fænotypisk og funktionel karakterisering af endotheliale kolonidannende celler afledt fra human Navlestrengsblod

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Langsigtet, høj opløsning Konfokal Time Lapse Imaging af<em&gt; Arabidopsis Kimblad</em&gt; Epidermis under spiring

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse af oxidativt stress i zebrafisk embryoner

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høj opløsning Imaging og analyse af de enkelte Astral mikrotubulusdynamik i Spirende Gær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...