Name: high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells at JoVE.com

Met speciale dank aan Dr. Clare M. Waterman voor mentorschap en discussies, Michelle Baird en Mike Davidson voor het verstrekken van veel van de tl-cDNA constructen gebruikt in deze studies, en Kathryn Applegate en Gaudenz Danuser voor het ontwikkelen van plusTipTracker MT analyse software. Dit werk werd ondersteund, gedeeltelijk, door een subsidie ​​aan KAM van het National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) en de National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

Met behulp van HUVECs in morfologie en migratie experimenten. Levende cellen beeldvorming van EB3 gemerkte MT groeidynamiek in HUVEC vereist geschikte en reproduceerbare celkweek voorwaarden om te meten en beoordelen veranderingen in MT groei en morfologie HUVEC, zodat ze vervolgens kunnen worden toegewezen aan een ECM-signalerend cue. HUVECs vertegenwoordigen een uitstekend model voor het bestuderen van de cel vorm en beweeglijkheid. Ze zijn zeer vatbaar voor transfectie met fluorescent gelabelde cDNA, ze vertonen dramatische morfologie in reactie op zowel oplosbare en fysieke signalering signalen, en ze behouden de mogelijkheid om zich te organiseren in vasculaire tubes indien passende celkweekomstandigheden 65-70. Primaire celkweken, zoals HUVEC, zorgvuldig worden behandeld en worden bewaakt cellen passage nummer om te bereiken de cellen gezond en dat ze gewoonlijk gedragen tijdens experimenteren. Bijvoorbeeld, bij het uitvoeren van experimenten die de cytoskeleton en / of celmorfologie dient HUVEC niet worden gebruikt voor experimenten na de tiende celcultuur passage, zoals HUVEC&#39;s beginnen meestal aan niet-uniforme morfologie rond doorgang twaalf tot vijftien weergegeven. Celdichtheid is ook een kritische regulator van HUVEC gezondheid en proliferatie. HUVEC vertakking onderzoeken (zie protocol 10,1-10,4 hierboven) gebruikt relatief lage celdichtheid kweken teneinde de cellen fysieke ruimte om met ECM en vertakte uitsteeksels verlengen. In tegenstelling, in de wond-edge migratie studies (zie Protocol 10,5-10,8), HUVEC zijn cultuur in een monolaag voorafgaand aan de verwonding. Als zodanig gewikkeld rand HUVEC relatief niet-vertakte morfologie weergegeven verlengen voorrand uitsteeksels en vertonen cel-cel interacties met hun directe buren als ze migreren in de wond. Voorbehoud en voordelen van Tracking MT Dynamiek in Living HUVEC&#39;s. Draaiende schijf microscopie is een uitstekende benaderingtesten experimentele hypothesen die confocale helderheid van het beeld met een hoge tijdsresolutie vereisen. Met de juiste camera en laser module, dit microscopie benadering is gevoelig voor lage emissie fluorescentie en kan helpen bij verminderde fotobleken vergelijking met andere soorten van fluorescentie microscopie. Belangrijk is dat deze benadering ook zeer geschikt voor matige tot hoge tijdsresolutie beeldvorming zoals vereist voor het genereren van uitgebreide metingen van MT groeidynamiek met de EB3 labeling benadering in verschillende celtypen. Terwijl de EB3 methode etikettering groeiende MT plus-uiteinden heeft verschillende voordelen boven andere methoden van fluorescent labeling MTS, maar heeft ook unieke nadelen. Zo is er een deel van de MT array niet actief groeit op een bepaald moment, zowel de populatie demonteren MT en de populatie van stabiele, niet-dynamische MT 71-74. EB3 zouden deze twee populaties van MT&#39;s labelen endus de bijdrage van deze twee populaties zouden niet bij experimentele gegevensanalyse. Alternatieve methoden voor het evalueren van de gehele matrix MT gericht op expressie van fluorescent gelabeld tubuline, die wordt opgenomen in alle populaties van MT en kunnen worden vastgesteld groeien, krimpen en stabiele MT. Vanwege de relatief hoge dichtheid van de MT matrix nabij het centrum van de cel en grenzend aan het microtubule organiserende centrum (MTOC) merken van het gehele MT matrix creëert een nadeel uitvoeren beeldanalyse van MT uiteinden die niet vlak bij de cel periferie 75-77. Experimenten met twee-color co-labeling met fluorescerende MTS tubuline en fluorescerende EB3 in levende cellen is gebleken, kwalitatief, dat de overgrote meerderheid van tubuline-gelabelde MTs ook EB3-gelabelde 78. Daarnaast is er geen efficiënte methode geautomatiseerd volgen van MT gelabeld met fluorescerende tubuline geweest. Dit betekent dat de gegevens inzametie en metingen van MT dynamica in cellen die fluorescent tubuline vereisen kant volgen van individuele MTS, een proces dat foutgevoelig en vervelend. Daardoor is geautomatiseerde computeranalyse van EB3 gemerkte MT worden de geprefereerde methode voor het meten MT dynamiek kan worden toegepast op MT dynamiek experimenten in talrijke celsoorten en bij verschillende experimentele regimes 35,79. Het koppelen van MT groeidynamiek om HUVEC morfologie en migratie. Vanuit een cytoskelet onderzoeker, een uiterst nuttig aanpassing van de plusTipTracker geautomatiseerde analyse volgen is het vermogen te meten en zowel volledige cellen en regionale veranderingen in MT groeidynamiek evalueren. De eis voor een cel om gepolariseerd is een essentiële voorwaarde voor directionele cel migratie. Als zodanig gepolariseerd signalering signalen zijn al lange tijd bekend als de belangrijkste drijvende factoren voor gerichte celmigratie 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. Oplosbare signaalmoleculen zoals VEGF induceren actine polymerisatie en MT groei naar de cue VEGF in endotheliale celsoorten 2,82-87. Bovendien, als reactie op fysieke interactie met de ECM (bijvoorbeeld compliance en dimensionaliteit mechanosensing), HUVEC moduleren hun MT dynamiek van lokaal regelen MAPs MT groei te bevorderen binnen verlengen vertakte uitsteeksels en dit dient om HUVEC migratie begeleiden in de richting van de cue 5,31,88. Aldus polarisatie in respons op extracellulaire signalen signalen benadrukt de noodzaak experimentele evaluatie van gelokaliseerde veranderingen in cytoskelet dynamiek. Tegelijkertijd live-cell imaging van MT groeidynamiek (de EB3 benadering) en HUVEC celmigratie is uiterst moeilijk zijn omdat MT groeien op een tijdschaal van seconden, terwijl veranderingen in celmorfologie en gerichte migratie plaatsvinden op een tijdschaal van uren. Maar beide processen zijn nauw linked. Bovendien, continue, snelle beeldvorming van fluorescent gelabelde EB3 op de tweede tijdschaal leidt tot fotobleken van de EB3 signaal. Pogingen om dit probleem op te lossen door het uitvoeren van beeldvorming korte reeks EB3 (1-2 min acquisitie serie) elke 30 minuten waren succesvol, maar kon slechts worden bereikt in een klein aantal EC dat optimale expressie van EB3 hadden en die niet weergegeven nadelige effecten herhaalde laserbelichting 5. Een alternatieve benadering die het mogelijk maakt voor interpretaties van hoe MT groeidynamiek bijdragen aan veranderingen in de cel morfologie en migratie is de plusTipTracker Region of Interest (ROI) gereedschap 35 (zie Protocol 6.6). Deze methodologie maakt volledige cellen MT groei circuits onderverdeeld in door de gebruiker gedefinieerde gebieden waaruit MT groei titels dan kunnen worden geëxtraheerd en geanalyseerd worden. Zo zijn vergelijkingen van &quot;vertakte&quot; versus &quot;niet-vertakte&quot; gebieden van de cel bleek dat MT groeien sbescheiden en aanhoudend binnen vertakte gebieden vergeleken met de niet-vertakte celperiferie 5. In gepolariseerde wond-edge HUVEC&#39;s, een vergelijking van de voorrand en achterrand groeidynamiek edge MT bleek dat-MCAK geïnduceerde MT demontage specifiek wordt geremd binnen de leading edge, maar niet de achterrand. Regionale evaluatie van de leidende en achterrand MT groeidynamiek in HUVEC uitdrukken Rac1 en / of fosforylering mutanten van MCAK verder bleek dat Rac1-geïnduceerde activering van Aurora-A kinase specifiek en lokaal MCAK activiteit remt binnen de leading edge om HUVEC polarisatie en directionele migratie rijden 31. Zo is de combinatie van geautomatiseerde volgen van MT groeidynamiek en regionale evaluatie van MT groei dynamiek binnen de vertakte uitsteeksels en / of de voorste rand van de wond-edge HUVEC heeft ons toegelaten om MT groeidynamiek koppelen aan HUVEC morfologie en migratie. De beschreven protocollen zijn designed om een ​​over het algemeen eenvoudig en zeer herhaalbare methodologie voor HUVEC cultuur en experimenteel onderzoek te bieden. Desalniettemin zijn veel van de protocol details zijn ingewikkeld en tijdrovend, hetgeen op zijn beurt biedt de kans op fouten of moeilijkheden bij het uitvoeren van de experimentele methode. Hoewel het werd geprobeerd om potentiële problemen aan te pakken in het hele protocol, hier is aanvullende, gedetailleerde oplossen van mogelijke problemen die minder vaak of anderszins afgekort als noten binnen de methodologie protocollen. Gerelateerd aan coating dekglaasjes met polyacrylamide substraten (2,2 Protocol), een gemeenschappelijk probleem dat zich voordoet is de complexiteit activeren dekglaasjes, polyacrylamide koppelen aan het glas, activerende polyacrylamide en vervolgens koppelen ECM het polyacrylamide. Een bijzonder moeilijk en potentieel problematische stap kweken van HUVEC op de fibronectine / polyacrylamidegel na blootstelling van de polyA-Crylamide beklede dekglaasjes tot 2 mM sulfo-SANPAH (stap 2.2.2.6 hierboven). Het is cruciaal voor het succes van het kweken van HUVEC volgende substraten die sulfo-SANPAH volledig verwijderd uit het volgende experimentele systeem ECM conjugatie. Dit kan het best worden bereikt door wassen met DDH 2 O en incuberen van de dekglaasjes in DDH 2 O op een schudder overnacht. Als cellen gekweekt op de polyacrylamide ECM niet overleven, of als levensvatbaarheid lager dan verwacht, vergroot en herhaald wassen van sulfo-SANPAH na conjugatie fibronectine (stap 2.2.2.9) wordt aanbevolen om mogelijk dit probleem te verlichten. Protocol 3 (cDNA transfectie en HUVEC cultuur op een dekglaasje) gerelateerd, een grote invloed op het succes van de elektroporatie werkwijze is de behandeling van de HUVEC zowel tijdens trypsine van de cellen om ze uit de kunststoffles verwijderen en na het sluiten van de elektroporatie (stappen 3,3-3,4, hierboven). Het is cruciaal om zorgde HUVECs volledig controleren terwijl in trypsine, en niet de tijd die nodig is voor de cellen &quot;round-up&quot; op het oppervlak van de kolf (typisch 1-2 min) overschrijden. Veel tijd in trypsine is een belangrijke oorzaak van dood HUVEC, die doorgaans niet gerealiseerd totdat de cellen op met fibronectine gecoate dekglaasjes (stap 3,4) uitgeplaat en vervolgens niet hechten aan het substraat. Even belangrijk, niet HUVEC&#39;s (en de meeste primaire celtypes) niet goed doen als geschorst voor lange tijd in de elektroporatie buffer. Tijdens grootschalige experimenten, bijvoorbeeld wanneer de gebruiker vijf of meer aandoeningen die elektroporatie vereist, is het beter om de cellen gepelleteerd in afzonderlijke buizen (1 tube per transfectie) één-per-tijd houden en te mengen, in de elektroporatie buffer onmiddellijk vóór elektroporatie. Deze aanpak minimaliseert de incubatietijd in elektroporatie buffer en maximale HUVEC overleven. Daarnaast onmiddellijke redding in volledige cultuur media is ook critical na elektroporatie. Redding vertraging van één minuut of meer elektroporatie kan tot vrijwel volledige HUVEC dood en derhalve moeten worden vermeden. Verwante celmigratie assay (Protocol 9), de techniek van het kweken van HUVEC&#39;s bij extreem hoge dichtheid hangt kritisch modificatie van de traditionele HUVEC celkweek methode (in Protocol 3 beschreven) (in stap 9.2 beschreven) dat drogen van de fibronectine gecoate dekglaasje vereist om HUVEC cultuur staat in een zeer klein gebied van het dekglaasje. Vaak wanneer het dekglaasje niet volledig gedroogd of vooraf bekleden van het dekglaasje met fibronectine (stappen 2,1 en 2,2) was niet efficiënt, het medium dat cellen bevat die is geplaatst op het dekglaasje zal de oppervlaktespanning verliezen en uit te breiden naar de randen van het dekglaasje, waardoor de dichtheid van cellen op het dekglaasje verminderen. Eén methode om dit potentiële probleem op te lossen is om de media te zuigen uit het dekglaasje enPlaats het dekglaasje (nog in de 35 mm gerecht) in de achterkant van de bioveiligheid kast voor 5-10 min. Deze aanpassing kan helpen om de luchtstroom binnen de kast mogelijk te helpen bij het drogen van de schotel. Als zichtbare vloeistof op het dekglaasje na drogen aan de lucht blijft, zuig het vloeibare vlekken en weer laat aan de lucht drogen voor 5-10 extra min in de bioveiligheid kast. Het is belangrijk op te merken dat er geen manier om dit potentiële probleem volledig te vermijden, maar wel minder een probleem met herhaalde oefening van het protocol worden. Het is ook een aanbeveling van het oplossen van problemen die bij de voorbereiding dekglaasjes voor de celmigratie assay (of een test, in het algemeen), om extra dekglaasjes bereiden en extra HUVEC&#39;s ready-to-go in geval van problemen langs de weg. Met deze problemen overwegingen in gedachten, is het ook belangrijk om de bruikbaarheid van de beschreven protocollen en hun gevolgen voortaan celbiologie onderzoek benadrukken. De toepasselijkheid van het polyacrylamide benadering is breed en omvat niet alleen tweedimensionale studies van cel-ECM engagement (hierboven beschreven), maar ook driedimensionale 5 onderzoeken. Deze toepassing is van cruciaal belang voor het vergroten van ons begrip van hoe HUVECs reguleren cel vorm en migratie in fysiologische omgevingen en moeten onderzoekers geven een fundamenteel begrip van hoe morfologische veranderingen worden gecoördineerd met het cytoskelet veranderingen. Hoewel de hier beschreven protocollen zijn gericht op metingen van MT groeidynamiek, de meeste protocollen kunnen en moeten worden aangepast om een ​​aantal andere microscopisch meetbare aspecten van cel-ECM interacties te meten. Wat MT dynamiek er tal MAPs, waarvan ten minste 14 families van kinesins 89, elk met een mogelijke rol bij HUVEC polariteit en gerichte migratie en die allemaal kunnen worden onderzocht met behulp van protocollen gepresenteerd. Toekomstig onderzoek moet eenLSO worden gericht op de cel-ECM engagement in normale versus zieke staten. HUVEC protocollen die hier van toepassing zijn op onderzoeken van normale vasculaire homeostatische processen, alsmede ziektetoestanden waaronder hartaandoeningen, retinopathie, tumorgroei en metastase, een paar te noemen. Vervoegen van zichtbaar transparante ECM&#39;s en polyacrylamide substraten van vatbaar naleving van microscopische studies zal zorgen voor cel-ECM betrokkenheid studies zodanig dat endotheelcellen vasculaire angiogenese kan worden gecontroleerd met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Deze soorten experimentele benaderingen zijn al begonnen met belangrijke verschillen in endotheliale cellen vorm, polariteit, migratie, en de effecten van eiwitten die deze processen reguleren 5,31,90 onthullen. Toekomstige inspanningen moeten gericht zijn om te bepalen hoe de combinatie van ECM compliance en dimensionaliteit mechanosensing kan dienen om lokaal de controle eiwitten die zich richten en reguleren cytoskelet dynamiek.

Angiogenese wordt geactiveerd door extracellulaire signalering signalen die endotheelcellen (EC) te bevorderen polariseren, migreren met directionele specificiteit en vormen nieuwe bloedvaten in weefsels die bloedtoevoer nodig. Bijdragende factoren gedacht om angiogenese rijden zijn signalen van de extracellulaire matrix (ECM). In reactie op fysieke signalen, EC uit te breiden nieuwe vestigingen met directionele specificiteit voor gerichte beweging te begeleiden bij de vorming van het vasculaire netwerk 1,2. De architectuur van EC morfologie en vertakking gedefinieerd gelokaliseerd regulering van de microtubuli (MT) cytoskelet op een manier die is afgestemd op de regulering van acto-myosine contractiliteit 3. Om EC takken te vormen, moet myosine-II lokaal worden neerwaarts gereguleerd, wat resulteert in gelokaliseerde membraan uitsteeksels 4. Op hetzelfde moment en op dezelfde locatie in de cel, raken MT groeidynamiek gewijzigd resulteert in trage en aanhoudende MT groei tak Elon bevorderenking en stabiliteit 5. Deze gecoördineerde cytoskelet verordening staat EC om hun morfologie polariseren om directionele migratie te vergemakkelijken. De ontwikkeling van een gepolariseerde celmorfologie vereist gepolariseerd MT monteren 6. In migrerende epitheelcellen, MT groeien langzaam en aanhoudend specifiek naar de voorrand van de cel 7-9; terwijl neuronen in de inleiding en verlenging van axonen en dendrieten vereist dat MT niet alleen aanwezig, maar dat ze dynamisch het proces van montage en demontage 10-15 ondergaan. Op deze wijze gelokaliseerde controle MT groeidynamiek bepaalt de architectuur van de cel en zorgt voor een snelle herinrichting van celmorfologie ECS navigeren door de ECM. MT groeidynamiek worden gereguleerd door families van moleculaire motor eiwitten en niet-motorische eiwitten, de zogenaamde microtubuli geassocieerde eiwitten of microtubuli interagerende eiwitten (voortaan afbeeldRred als Maps). Kaarten kunnen lokaal worden geactiveerd of geïnactiveerd, meestal door middel van signalering cascades gestart met de cel-ECM-interface 16,17. Eenmaal actief, MAP-functie door te binden aan het MT en de wijziging van de kinetiek van MT montage en demontage; daardoor functioneren om lokaal te regelen MT dynamiek om de cel vorm en polariteit 18-20 promoten. Mitotische Centromere Associated Kinesin (MCAK) is een Kinesin-13 familie MAP dat zich bindt aan MT uiteinden en koppels ATP hydrolyse tot MT demontage 21-23. Deze functionele rol van MCAK bekend kritiek in de mitotische spoel 24-28, alsook tijdens interfase 29,30 te zijn. Binnen tussenfase EC, wordt-MCAK bemiddeld MT demontage gereguleerd door gelokaliseerde Aurora-A-geïnduceerde fosforylering van MCAK in reactie op de wond-edge-geïnduceerde activering van de Rac1 kleine GTPase. Het resultaat van deze signaalcascade is de remming van MCAK aan de voorrand van EC, resulterend in gepolariseerd groei MT richting de leAding edge and-MCAK geïnduceerde MT demontage aan de achterrand van het migreren van EC 31. Traditionele methoden voor het bepalen MT groei dynamiek doorgaans gebruikt kant volgen van ofwel fluorescent gelabelde tubuline of, meer recent, fluorescent-gelabelde MT End Bindingseiwit 1 of 3 (EB1 of EB3 respectievelijk). De fluorescerende tubuline benadering het voordeel etikettering van MT gehele array. Omdat de meeste celtypen mitotische een radiale reeks MT houden tijdens interfase 8,32,33, MT vlakbij het ​​centrosoom zeer dicht en daardoor volgen groei MT en demontage fluorescerende tubuline is meestal beperkt tot de perifere gebieden van de cel. Vanwege deze beperkingen, is het gebruik van fluorescent gelabelde eiwitten EB (EB1 of EB3) de meest voorkomende aanpak voor het meten MT dynamiek geweest. Omdat EBS alleen de groeiende plus-uiteinden van MTs label, verschijnen ze als kleine (1-3 pm), fel tl koments, waardoor een gemakkelijk waarneembare marker MT polymerisatie met zeer beperkte achtergrondfluorescentie 34-37. Terwijl dat EBS label slechts een subset van de MT matrix is ​​een grote kracht van de EB benadering ook wijst op een belangrijke beperking zijn die niet groeiende MT niet gelabeld door het EB3 benadering. Desondanks moet het vermogen te meten en volgen EB3 kometen tijd en MT groei binnen subcellulaire&#39;s zichtbaar maakt deze aanpak geschikt voor toepassingen die regionale evaluatie van MT organisatie vereist. Een andere kritieke beperking van traditionele methoden voor het bepalen MT groeidynamiek is zeer grote gegevenssets en de tijd die nodig is voor gegevensanalyse. Deze beperking komt voort uit de noodzaak van de hand volgen van honderden EB kometen met een hoge tijdsresolutie. Bovendien moeten deze metingen uit te voeren in een statistisch significant aantal cellen en ook uitgevoerd onder verschillende controle- en experimental omstandigheden. Onlangs zijn deze beperkingen overwonnen door middel van geautomatiseerde analyse technieken die specifiek gericht zijn op het bijhouden van EB3 kometen met behulp van time-lapse microscopie in levende cellen 35. Bij juist onderhoud deze computationele benadering dient om zowel de kans op menselijke fouten in verband met de hand tracking naast voorzien in een high-throughput werkwijze voor het meten MT polymerisatie beperken. Computationele analyse van MT dynamiek met behulp van de MatLab-gebaseerde software pakket, plusTipTracker, zorgt voor metingen van MT groei door het bijhouden van fluorescent-gelabelde EB3 kometen 5,31,35,38. Daarnaast plusTipTracker software maakt het mogelijk voor berekeningen van MT catastrofe gebeurtenissen (aka demontage) op basis van de verdwijning van EB3 kometen binnen een groeiende MT spoor, en zorgt voor een sub-cellulaire (aka regionaal) analyse van MT groeidynamiek binnen de door de gebruiker gedefinieerde regio&#39;s van belang . Voor onze studies, werden MT groeidynamiek in vergelijking binnenvertakte gebieden versus niet-vertakte gebieden of binnen leidende versus trailing celranden. Gegevensuitvoer plusTipTracker software kan ook worden gebruikt om kleur gecodeerde overlays voor individuele cellen en subcellulaire&#39;s genereren. Hier beschrijven we de methode die werd gebruikt om de rol van MCAK bij het moduleren van MT groeidynamiek en de bijdrage van deze MT depolymerase om de regulering van de EC vertakking morfologie en directionele migratie te onderzoeken. Onze aanpak een primaire humane cellijn, humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC), die gemakkelijk gekweekt en zeer vatbaar voor elektroporatie-geïnduceerde, transiënte transfectie van plasmide cDNA zijn. We vervolgens gebruikt high-resolution, time-lapse fluorescentie microscopie van HUVECs getransfecteerd met MT Einde Binding eiwit 3 (EB3) en Mitotische Centromere Associated Kinesin (MCAK) -specifieke cDNA constructen te evalueren effecten op MT dynamiek getransfecteerde HUVEC&#39;s. PlusTipTracker-gebaseerde, computer beeldanalyse van EB3gemerkte MT plus uiteinden was om MT groei snelheden en MT groei levens te meten in time-lapse beelden, te meten en te vergelijken effecten van experimentele manipulaties op MT groeidynamiek. Deze methode maakt het mogelijk voor de studie van MT dynamiek en de identificatie van de manier waarop gelokaliseerde regulatie van MT dynamiek binnen sub-cellulaire regio&#39;s draagt ​​bij aan de angiogene processen van de EG-vertakking en migratie. Deze technieken zijn van toepassing op onderzoeken van elke MAP die fluorescent kunnen worden gelabeld en uitgedrukt in levende cellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aurora A Inhibitor I</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>99462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;mouse IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-1688-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-7788-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET455/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET525/36m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET605/70m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET605/70m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET700/75m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET700/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>RPI Products</td>
			<td>A30075-100.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clara cooled charge-coupled device camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>77026010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyelight 649 goat anti-rat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112-496-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-MV SingleQuot Supply &#38; Growth Factors (contents shown below)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum 25 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine brain extract 2.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL)&#160; 10.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic shutter</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>77016099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-036-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8006-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TiE</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI Technologies</td>
			<td>MS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>CS70330-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MCAK</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS310000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>Contains the electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2021854-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plusTipTracker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti&#8211;pT288&#8211;Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti&#8211;&#945;-tubulin</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA78G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>678-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk&#160;</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Yokagawa CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

HUVEC cultuur live-cell microscopie Levende cellen beeldvorming van HUVECs expressie fluorescerende eiwitten vereist dat HUVEC&#39;s in een omgeving die geschikt is voor normale groei en onderhoudscel, evenals normale eiwit expressie en functie gehandhaafd. Figuur 1 toont een schematische weergave van het protocol gebruikt voor het bereiden van een gebufferde en gesloten systeem dat handhaaft geoptimaliseerd optische kenmerken voor het verzamelen van time-lapse beelden van levende cellen. Dunne stroken dubbelzijdig tape geplaatst op een glasplaatje (figuur 1A) en het dekglaasje met de gekweekte HUVEC omgekeerd boven de band zodanig dat de cellen worden geconfronteerd met de schuif (figuur 1B). Zo levert de band een kleine opening tussen de beide oppervlakken en creëert een ruimte waarin de cellen worden gebaad in geschikte celkweekmedium (figuur 1C, zie Protocol 4, hierboven). ikna laatste stap wordt de glazen dekglaasje gelast aan het glaasje met een vaseline: lanoline: paraffinewas (1: 1: 1 mengsel, valap Figuur 1D) een gesloten systeem. Deze celkweek aanpak werd gebruikt voor zowel de kortere tijdreeks beeldvorming van EB3 kometen en voor de langere tijdreeks vertakking en migratie experimenten. Bovendien, de wasachtige consistentie van valap zorgt voor gemakkelijke verwijdering uit de glasplaatje en dekglaasje aan het einde van een imagingexperiment zodat aanvullende benaderingen zoals fixatie en immunolabeling (zie Protocol 8), kunnen worden uitgevoerd op dezelfde dekglaasje en celmonster die werd gevisualiseerd met behulp van de live-cell imaging aanpak. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Figuur 1:. Methodologie van HUVEC cultuur live-cell microscopische imaging (A) Knip 2 stukken van dubbelzijdige tape in 0,65 cm x 2.50 cm rechthoekige strips en veilig een stuk dubbelzijdige tape horizontaal langs de bovenrand van de schuif, en het andere stuk, langs de onderrand van de schuif. Het is belangrijk dat een kleine ruimte tussen de band en de schuif rand zorgen voor het afdichten van de kamer zoals beschreven in (D). (B) Met behulp van een tang verwijder het dekglaasje met HUVECs en draai de dekglaasje (cel naar beneden) bovenop de stukken tape. (C) Een micropipet, voeg 40 pl beeldmedia (complete endotheliale basaal medium aangevuld met 25 uM HEPES) tussen het dekglaasje en het glaasje. Zorg ervoor dat de ruimte tussen het dekglaasje en schuif volledig is gevuld met imaging media en vermijd bubbels. Gebruik een aspirator langs de rand van het dekglaasje om overtollige media te verwijderen, indien nodig. (D) Met warm valap (1: 1: 1 vaseline: lanoline: paraffine) voor afdichting rondom de randen van het dekglaasje. Controleer op imaging media lekkages door te drukken rond voorzichtig op het dekglaasje. Gebruik extra valap te verhelpen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Geautomatiseerde bijhouden van fluorescent-gelabelde EB3 zorgt voor een uitgebreide analyse van de gehele cel en regionale dynamiek MT groei. De verzameling duidelijk onderscheiden en zeer tijd- en ruimte opgelost microscopische beelden van de EB3 eiwit essentieel is voor de analyse van EB3 stromingen binnen de cel. HUVEC expressie van fluorescent-gelabelde EB3 varieert sterk van cel naar cel en fluorescentie-intensiteit verhoogt meestal binnen dezelfde cel gedurende hr. Aldus is het belangrijk dat de deze veranderingen in expressieprofiel volgen om mogelijke effecten van verhoogde expressie EB op MT groeidynamiek identificeren. Dit wordt het beste bereikt door het evalueren van grijswaarden fluorescentie intensity profielen voor elke afgebeeld cel en gegevensanalyse beperkt tot die cellen die een bepaald bereik van grijswaarden expressieprofielen geven. Eerste evaluatie van expressieprofiel datasets is kritisch en moet worden vergeleken met MT groeidynamiek gegevens die verkregen door plusTipTracker software voor elke cel. Expressieprofielen kunnen worden uitgezet tegen MT groeisnelheid en MT groei levensduur van elke cel in een experimentele groep teneinde het gewenste bereik van grijswaarden expressie te bepalen en om mogelijke uitschieters te identificeren. Figuur 2 hoogtepunten een HUVEC gekweekt op een fibronectine substraat (zie Protocol 2.1, hierboven) en tot expressie brengen in de buurt van een optimaal niveau van Mapple-gelabelde EB3. Fluorescerende EB3 kometen wordt in een time-lapse reeks beelden gedurende 12 seconden (Figuur 2A). Analyse van EB3 kometen met behulp van plusTipTracker software gaat om een ​​geautomatiseerd, beeld-voor-beeld EB3 komeet detectie (groene en gele stippen, figuur 2B). Kometen ontdekt binnen elk frame worden vervolgens gekoppeld, afhankelijk van hun verandering in de positie van het frame-to-frame, te EB3 tracks en een visuele EB3 spoor overlay (figuur 2C-F) te genereren. Track overlays zijn kleurcodering en de kleur onderscheid kan worden bepaald door parameters die door de gebruiker zijn ingevoerd. Gewoonlijk deze onderscheidingen gebruik maken van de wereldwijde gemiddelde van MT groeisnelheid en MT groei levenslange 5,31 en daarmee splitsing van de gegevens in vier groepen: traag en kortstondige (rood), traag en een lange levensduur (geel), snel en op korte gewoond (groen), en snel en langlevend MT groei (blauw; figuur 2G). PlusTipTracker-gemedieerde volgen van EB3-gelabelde MT groeidynamiek maakt het ook mogelijk de gebruiker gedefinieerde regio&#39;s van belang (ROI). PlusTipTracker haalt de MT groeispoor data vanuit de gebruiker gedefinieerde ROI (Figuur 2A, B en F), waardoor vergelijkingen van MT groei dynamics binnen verschillende gebieden van dezelfde cel. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Figuur 2: EB3 komeet detectie, tracking en plusTipTracker data-uitgang (A) time-lapse film van een HUVEC uitdrukken mapple EB3.. Linker paneel toont een heel uitzicht cel en volledige cel masker (witte lijn) markeren van de cel grenzen. Rode doos staat voor het ingezoomde gebied in de time-lapse beelden (rechts panelen). Rechts panelen tonen ruwe grijstinten time-lapse beelden van EB3 kometen in opeenvolgende frames imaging (t = 0 sec - t = 12 sec). (B) plusTipTracker detectie van EB3 kometen van de in (A) beelden. Linker paneel toont een gehele cel weergave van gedetecteerde kometen (gele stippen). Rode doos staat voor het ingezoomde gebied in de time-lapse beelden (rechts panelen). Rechter panelen benadrukken vijf gedetecteerd EB3 kometen (rode pijlen) en sporenelementen die vijf kometen over de 12 sec imaging periode. Groen<html> stippen vertegenwoordigen gedetecteerd EB3 kometen die niet bestonden (of werden niet gedetecteerd) in de voorgaande tijdsinterval. (C) Maximale intensiteitsprojectie van 61 frames (2 min film) van de EB3 kometen getoond in (A). (D) plusTipTracker MT spoor overlay van dezelfde 61 frames (2 min film) getoond in (C). (E) Zoom van maximale intensiteit projectie (rode doos in C). (F) Zoom van plusTipTracker MT spoor overlay van maximale intensiteit projectie (rode doos in D). (G) Kleur-gecodeerde legenda voor spoor overlays getoond in (D) en (F). Aanwijzing zo langzaam, snelle kortstondige of lange duur is gebaseerd op de gemiddelde waarde voor alle sporen groei gemeten in een groep van tien MAPPLE-EB3 expressie HUVEC. Voor eenvoudiger visualisatie zijn spoor overlays in (D) en (F) gegenereerd met omgekeerde pixelintensiteiten de afbeeldingscel getoond in (A). Schaalbalken = 20 urn./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. HUVEC vertakking en migratiepatronen zijn gevoelig voor mechanisch-fysieke signalen van de ECM. HUVECs zijn bekend om te reageren op verschillende soorten signalering signalen en daarmee morfologische veranderingen die een geschikte cellulaire reactie op de specifieke signalering cue (s) 36,40-42 bepalen ondergaan. HUVECs gekweekt op fibronectine beklede glassubstraten (figuur 3A), of stijve 2-dimensionale polyacrylamidegel ECM&#39;s (55 kPa) typisch een ronde of langwerpige morfologie met weinig afzonderlijke vertakte uitsteeksels (figuur 3B) weergegeven. Echter, indien gekweekt op zacht 2-dimensionale polyacrylamidegel ECM (0,7 kPa), HUVEC&#39;s vertonen een sterk vertakte morfologie die bekend is gevolg van naleving geïnduceerde benedenregulering van myosine-II contractiliteit 4,5,31 (figuur 3C). Aldus HUVEC zelfregulering van celmorfologie met ECM mechanosensing, en dit wordt bereikt door gelokaliseerde modulatie van MT dynamiek en acto-myosine contractiliteit. Omdat HUVECs diverse morfologische kenmerken weergeven, om HUVEC meten vertakking is het essentieel om eerst definiëren wat een vertakte uitsteeksel, en vervolgens te bepalen hoe een vertakte uitsteeksel objectief gemeten. Een techniek maakt gebruik van vier stappen benadering waarbij een celgrens of &quot;masker&quot; gegenereerd handmatig opsporen van de randen van de cel met een beeld van een cel die een fluorescerende volumemarkering de celranden (Figuur 3D) omschrijven. Na masker generatie zijn tak oorsprong gedefinieerd lokaliseren grootste hoek van de kromming tussen het vertakte uitsteeksel en het cellichaam. Een lijn wordt getrokken naar Demark de &quot;branch origin&quot; (paarse schuine lijnen Figuur 3E). Branch nummer is gewoon gemeten door het tellen van het aantal vestigingen met een bepaalde tak oorsprong (figuur 3F). Scheutlengtes wordt gemeten als de afstand van de tak oorsprong naar het distale uiteinde tak (Figuur 3G). Om opname van kleine lamellipodia projecties van gegevensanalyse voorkomen, aanvullend criterium dient branches langer ( &quot;branch length&quot;) moet dan breed (de &#39;branch origin &quot;), en die zich vertakt moet ten minste tien micron lengte 5 , 31. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . Figuur 3: Analyse van HUVEC vertakking morfologie (A - C) DIC image voorbeelden van HUVEC&#39;s gekweekt op fibronectine gecoate glazen ECM (A) stijve (55 kPa) polyacrylamide ECM (B) en zachte (0,7kPa) polyacrylamide ECM (C). Vertakking is sterk toegenomen in HUVEC&#39;s gekweekt op 0,7 kPa polyacrylamide ECM (C) in vergelijking met stijvere ECM&#39;s (A, B). (D). DIC microscopische afbeelding (afbeelding links) van een getransfecteerde HUVEC uitdrukken van een mapple-C1 cDNA construct (een cel volume marker; rechter afbeelding). (E) Definieer de branche oorsprong door het lokaliseren van de grootste hoek van de kromming (dat wil zeggen de positie waar het membraan wordt de grootste kromming, paars-gekleurde lijnen) aan weerszijden van de branche en sluit vervolgens de hoeken met een rechte lijn (blauwe lijnen) . (F) te identificeren en te selecteren vertakte uitsteeksels die&gt; 10 urn uit te breiden van de &quot;branch origin&quot; (zoals gedefinieerd in E). Tel het aantal vertakte uitsteeksels aan het verkrijgen van &quot;branch-nummer.&quot; (G) Meet de afstand van het centrum van de &#39;branch oorsprong &quot;naar de most distale punt van de branche met behulp van de line tool in de annotaties en metingen toepassing van NIS Elements Software om het verkrijgen van &quot;branch lengte.&quot; Schaal bars = 20 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Naast sensing ECM compliance, HUVEC ook voelen en te reageren op de afschaffing van de aangrenzende cellulaire contacten geïnduceerd door scratch verwonden. In de migratieanalyse, HUVEC&#39;s gekweekt in een monolaag worden onderworpen aan een kras wond en migratie karakteristieken worden gemeten (zie protocol 9 hierboven). Na inductie van de wond door krabben de monolaag, wond-edge HUVEC polariseren Door een stuwende voorrand die zich uitstrekt in de wond (figuur 4A, t = 0 uur). Over een tijdsverloop van 10-12 uur, gepolariseerde wond-edge HUVEC migreren in de wond gebied en vul dewond, de oprichting van een nieuwe samenvloeiende monolaag (Figuur 4A, t = 11 uur). Net als bij HUVEC vertakking, de huidige gegevens blijkt dat polarisatie en migratie is kritisch afhankelijk van de gecoördineerde reorganisatie van het MT en actine cytoskeletons 43-49. Dit wordt bereikt, deels door gelokaliseerde remming van MCAK geïnduceerde MT demontage aan de voorrand, maar niet aan de achterrand van wond-edge HUVEC 31. De gevoeligheid van MT dynamiek-wond geïnduceerde polarisatie wordt geïnitieerd door de Rac1 GTPase, waarin tal van downstream-regulator eiwitten, waaronder Aurora-A kinase dat fosforyleert en remt MCAK aan de voorste rand, en andere kinasen die in staat zijn tot het remmen of activeren van kaarten zijn doelen lokaal moduleren MT groei en krimp 18,31,36,48,50-53. Uitgebreid experimenteel bewijs ondersteunt het idee dat de coördinatie van de leading edge uitsteeksel en achterrand krimp wordt bestuurd door cycli van Rac1 activeringMT montage op de leading edge en RhoA activering Acto-myosine contractiliteit te bevorderen op de achterrand, waardoor gericht beweeglijkheid 9,41,51,52,54-58 rijden. Tot op heden is er geen gevestigde methode voor het uitvoeren van geautomatiseerde volgen van celmigratie. Dit is een gevolg van de moeilijkheden bij het computationeel analyseren van cel-ECM grenzen die constant veranderen als wond-edge cellen polariseren en migreren. Hoewel veel software programma kan volgen fluorescent gelabelde cellen 59-64 zijn de populatie van fluorescent gelabelde HUVEC in opgewikkelde edge migratie experimenten ongeveer 30-40% van de totale bevolking HUVEC, en dus de meeste van de wond-randcellen must worden gevisualiseerd door fase-contrast beeldvorming of DIC. Daarnaast is het van belang bij het meten wond-edge migratie fluorescerende en niet-fluorescerende cellen evalueren binnen dezelfde wond om vast te stellen specifiekeeffecten van expressie constructen, zowel binnen de experimentele studiegroepen en tussen experimentele studie groepen. Momenteel is de beste aanpak om HUVEC migratie te meten is om een hand te volgen aanpak waarbij een wond-edge cel eerst wordt geïdentificeerd en vervolgens de kern en nucleolus geïdentificeerd (Figuur 4B) te gebruiken. De nucleolus wordt gebruikt als de positie bepalend voor cell tracking vanwege de hoge dichtheid en lichtverstrooiing relatief kleine omvang. Deze twee functies van de nucleolus gemakkelijker te identificeren en te verminderen meetfouten door beperking van het gebied waarin de gebruiker een afzonderlijk nummer posities plaatsen. HUVEC migratie tracks worden vervolgens gegenereerd door te klikken op de nucleolus in opeenvolgende time-lapse afbeelding frames. Tenslotte migratie snelheid en migratie afstand tot oorsprong worden gemeten en geanalyseerd voor de controle en experimentele celgroepen (figuur 4B). <img alt="figuur 4"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Figuur 4: Analyse van de wond-edge HUVECs en migratie volgen (A) 20X fase-contrast beelden van een 11 hr time-lapse imaging serie scratch wond-edge HUVEC (aka &quot;Migratie Assay&quot;).. De wond en trekrichting aangegeven in panel t = 0 uur. HUVECs worden getoond aan de wond rand en verder steken in de wond totdat een monolaag van cellen wordt gevormd (t = 3,5 uur - t = 11 uur). (B) Analyse van migratieanalyse time lapse imaging (zie A) moet eerst de identificatie van een traceerbare wond-edge HUVEC gebaseerd op cellocatie (dwz elementen fysiek aan de rand van de wond) en expressieprofiel (i .e. selecteer een groene wondrand cel als het experiment gaat om de expressie van GFP). afbeelding van de fase contrast met behulp van, identificeren van de kern en de nucleolus. Hand volgen de nucleolus in opeenvolgende time-lapse beelden met behulp van de eennotaties en metingen toepassing in NIS Elements software om migratie snelheid en de afstand tot de oorsprong te bepalen. Schaal bars = 100 micrometer (A), 20 pm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells at JoVE.com

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Isolatie van de Mens navelstreng endotheel cellen (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kwantitatieve analyse van Random migratie van cellen met behulp van time-lapse video Microscopie

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo&#39;s

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...