Name: high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells at JoVE.com

תודה מיוחדת לד&quot;ר קלייר מ ווטרמן עבור חונכות ודיונים, מישל ביירד ומייק דוידסון למתן רבים של מבנים cDNA פלורסנט המשמש במחקרים אלה, ועם קתרין אפלגייט Gaudenz Danuser לפיתוח תוכנת ניתוח MT plusTipTracker. עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי מענק קא&quot;מ מן הריאות הלאומי ללב ודם (NHLBI) לבין המכון הלאומי לבריאות (NIH). (גרנט: 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

שימוש HUVECs בניסויי מורפולוגיה והגירה. Live- תא הדמיה של דינמיקת צמיחת MT שכותרתו EB3 בתוך HUVECs דורשת תנאי תרבית תאים מתאימים לשחזור כדי למדוד ולהעריך שינויים בצמיחת MT ומורפולוגיה HUVEC, כך שהם יכולים להיות מוקצים אז אל קיו איתות ECM. HUVECs מייצגים מודל מצוין לחקר צורת התא ואת תנועתיות. הם מאוד מקובלים transfection עם cDNAs fluorescently שכותרתו, הם מפגינים מורפולוגיות דרמטיות בתגובה הוא רמזי איתות מסיסים ופיסיים, והם שומרים על היכולת לארגן את עצמם לתוך צינורות כלי דם כאשר ספקו תנאי תרבית תאים מתאימים 65-70. בתרביות תאים ראשוניים, כגון HUVECs, מצריכה טיפול וניטור קפדני של מספר מעבר התא על מנת להבטיח את התאים בריאים וכי הם יתנהגו באופן רגיל בזמן ניסויים. לדוגמא, בעת ביצוע ניסויים חוקרים את cytoskeleטון ו / או מורפולוגיה תא, HUVECs לא אמור לשמש לניסויים מעבר למעבר תרבית תאים עשירית, כפי HUVECs בדרך כלל מתחילה להציג מורפולוגיות לא אחידות סביב המעבר כשנים-עשר עד חמישה-עשר. צפיפות תאים גם רגולטור חשוב לבריאות ושגשוגם HUVEC. חקירות הסתעפות HUVEC (ראה פרוטוקול 10.1-10.4, לעיל) להשתמש תרבויות צפיפות תאים נמוכות יחסית על מנת לספק את תאי מרחב פיזי כדי אינטראקציה עם ECM שלהם להאריך בליטות קנים. לעומת זאת, במחקרי גירת פצע קצה (ראה פרוטוקול 10.5-10.8), HUVECs הוא תרבות בשכבה לפני הפציעה. כפי HUVECs כזה, פצע קצה להציג מורפולוגיה יחסית un קנים, להאריך המובילים בליטות בקצה, ולהציג אינטראקציות תאי תאים עם השכנים המיידיים שלהם כפי שהם נודדים לתוך הפצע. אזהרות ואת היתרונות של Dynamics מעקב MT In Living HUVECs. ספינינג מיקרוסקופיה דיסק היא גישה מצוינתלבחון השערות ניסיוניות הדורשים בהירות התמונה confocal עם הזמן ברזולוציה גבוהה. עם מודול מצלמת הליזר המתאים, גישה מיקרוסקופיה זו רגישה קרינת פליטה נמוכה והוא יכול לסייע photobleaching מופחת לעומת סוגים אחרים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חשוב לציין, גישה זו גם מתאימה גם עבור בינוני עד הדמית זמן ברזולוציה גבוהה כפי שנדרש להפקה מדידות מקיפות של דינמיקת צמיחת MT בגישת תיוג EB3, במגוון סוגי תאים שונים. בעוד המתודולוגיה EB3 של תיוג גדל MT פלוס קצוות יש יתרונות ברורים על פני שיטות אחרות של MTS תיוג פלורסנטי, יש לה גם חסרונות ייחודיים. לדוגמא, קיים יחס של מערך MT שאינו צומח באופן פעיל בכל זמן נתון, כולל הוא את האוכלוסייה של MTS פירוק ואוכלוסיית סטאבילה, MTS הלא דינמי 71-74. EB3 לא לתייג שני אלה אוכלוסיות של MTS וולכן התרומה של שתי אוכלוסיות אלה לא יכללו בניתוח נתוני הניסוי. מתודולוגיות אלטרנטיבי לבחינת מערך MT כולו התמקד ביטוי טובולין שכותרתו פלורסנטי, אשר משלב לתוך כל האוכלוסיות של MTS ומאפשר זיהוי של גדל, מתכווץ, ואת סטאבילה MTS. עם זאת, בגלל צפיפות גבוהה יחסית של המערך MT סמוך למרכז התא צמוד למרכז בארגון microtubule (MTOC), תיוג מערך MT כולו יוצר חיסרון בביצוע ניתוח התמונה של הקצוות MT שאינם ליד התא בפריפריה 75-77. ניסויים באמצעות שיתוף תיוג שני צבעים של MTS עם טובולין פלורסנט EB3 פלורסנט בתאים חיים חשפו, איכותית, כי הרוב המכריע של MTS שכותרתו טובולין הם גם שכותרתו EB3 78. בנוסף, לא היתה שיטה יעילה של מעקב אוטומטי של MTS שכותרתו עם טובולין ניאון. משמעות הדבר היא כי אוסף נתוניםtion ומדידות של דינמיקת MT בתאים המבטאים טובולין פלורסנט דורשים מעקב ביד של MTS פרט, תהליך שהוא לשגיאה ומייגעת. כתוצאה מכך, ניתוח חישובית אוטומטי של MTS EB3 שכותרתו הפך המתודולוגיה המועדף למדידת דינמיקת MT כפי שהוא יכול להיות מיושם על ניסויי דינמיקת MT פני סוגי תאים רבים בתוך מגוון רחב של משטרים הניסיונות 35,79. קישור Dynamics צמיחה MT כדי HUVEC מורפולוגיה וההגירה. מנקודת המבט של חוקר cytoskeletal, אחד הסתגלות שימושית מאוד של ניתוח המעקב אוטומטי plusTipTracker היא היכולת למדוד ולהעריך הוא שינויי תא ואזוריים בדינמיקת צמיחת MT. דרישת תא להפוך מקוטב היא תנאי מוקדם הכרחי נדידת תאים כיוונית. כרמזי איתות כזה, מקוטב כבר ידועים עוד גורמי נהיגת מפתח עבור נדידת תאים כיוונית 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. לדוגמא, מולקולות מסיסות איתות כגון VEGF לגרום פילמור יקטין וצמיחת MT כלפי קיו VEGF בסוגי תאי אנדותל 2,82-87. בנוסף, בתגובה אינטראקציות פיזי עם ECM (למשל, ציות ממדיות mechanosensing), HUVECs לווסת הדינמיקה MT שלהם על ידי מקומי ויסות מפות כדי לקדם צמיחה MT בתוך מתארך בליטות הקנים, וזה משמש כדי להנחות הגירה HUVEC בכיוון של קיו 5,31,88. לפיכך, קיטוב בתגובה לאותות איתות תאיים מדגיש את הצורך בהערכה ניסיונית של שינויי נקודות בדינמיקת cytoskeletal. Live- תא הדמיה סימולטני של דינמיקת צמיחת MT (בגישת EB3) ואת נדידת תאי HUVEC קשה מאוד לבצע בגלל MTs לגדול על ציר זמן של שניות, תוך שינויים במורפולוגיה תא והגירה כיוונית להתרחש בקנה מידת זמן של שעות. עם זאת הוא לגבי התהליכים הם אינטימי לינקהד. יתר על כן, רציפה, הדמיה מהירה של EB3 שכותרתו fluorescently על ציר הזמן השני מוביל photobleaching של האות EB3. ניסיונות להתגבר על בעיה זו על ידי ביצוע סדרת הדמיה קצרה EB3 (סדרת רכישה 1-2 דקות) כל 30 דקות הצליחו, אבל יכול להיות מושלם רק במספר קטן של ECS כי היה ביטוי אופטימלי של EB3 וכי לא להציג לרעה אפקטים תאורת לייזר חזר 5. גישה חלופית המאפשרת פרשנויות של איך דינמיקת צמיחת MT לתרום שינויים במורפולוגיה תא והגירה היא אזור plusTipTracker של העניין (ROI) כלי 35 (ראה פרוטוקול 6.6). מתודולוגיה זו מאפשרת לצמיחת MT התא כולו עוקבת להיות תת-מחולק לאזורים המוגדרים על ידי משתמש, שממנו מסלולי צמיחת MT אז יכולים להיות מופקים ונותחו. לדוגמה, השוואות של &quot;מסועפת&quot; לעומת אזורים &quot;הלא-קנים&quot; של התא חשפו כי MTS לגדול יותר שלנחות ועוד בהתמדה בתוך אזורים מסועפים לעומת הפריפריה של התאים הלא-קני 5. בשנת HUVECs פצע קצה מקוטב, השוואות של קצה המובילה ונגררת דינמיקת צמיחת MT הקצה גילו כי פירוק MT-induced MCAK מעוכב במיוחד בתוך הקצה המוביל, אבל לא נגרר לקצה. ערכה אזורית מובילים ונגרר דינמיקת צמיחת MT יתרון HUVECs להביע Rac1 ו / או מוטציות זירחון של MCAK עוד עולה כי הפעלת נגרמת Rac1 של אורורה-קינאז ספציפי מקומי מעכב פעילות MCAK בתוך הקצה המוביל לנהוג קיטוב HUVEC והגירה כיוונית 31. לכן, השילוב של מעקב אוטומטי של דינמיקת צמיחת MT וערכה האזורית של דינמיקת צמיחת MT בתוך בליטות קנים ו / או את הקצה המוביל של פצע קצה HUVECs אפשר לנו לקשר דינמיקת צמיחת MT מורפולוגיה וגירת HUVEC. הפרוטוקולים המתוארים הם designeד לספק מתודולוגיה פשוטה מאוד דיר בדרך כלל לתרבות HUVEC וחקירת ניסיוני. עם זאת, חלק ניכר מן פרטי הפרוטוקול הם מורכבים זמן רב, אשר, בתורו, מספק הזדמנות עבור שגיאות או קשיים בניהול המתודולוגיה הניסיון. למרות שזה היה ניסיון לטפל בבעיות פוטנציאליות ברחבי הפרוטוקול, כאן מסופק ולפתור בעיות נוספות, מפורטות של בעיות פוטנציאליות שניתנות פחות נפוצים או מקוצר אחרת כפי שמציין בתוך פרוטוקול המתודולוגיה. הקשורים coverslips ציפוי עם מצעים polyacrylamide (פרוטוקול 2.2), בעיה נפוצה הנשאלת היא האופי המורכב של הפעלת coverslips זכוכית, צימוד polyacrylamide אל הזכוכית, הפעלת polyacrylamide, ולאחר מכן צימוד ECM אל polyacrylamide. אחת במיוחד צעד קשה ובעייתי פוטנציאלי הוא culturing HUVECs על ג&#39;ל פיברונקטין / polyacrylamide הבא חשיפה של פוליהcoverslips מצופה crylamide עד 2 מ&quot;מ sulfo-SANPAH (שלב 2.2.2.6, לעיל). זה קריטי להצלחת culturing HUVECs על מצעים אלה כי sulfo-SANPAH יוסר לחלוטין ממערכת ניסיוני הבאה נטיית ECM. זה יכול להיות מושג בצורה הטובה ביותר על ידי שטיפה עם DDH 2 O ו דוגרים coverslips DDH 2 O על שייקר לילה. אם תאים בתרבית על ECMS polyacrylamide אינם שורדים, או אם הכדאיות הוא פחות מהצפוי, עלה וחזר לשטיפת sulfo-SANPAH לאחר נטיה כדי פיברונקטין (שלב 2.2.2.9) מומלץ פוטנציאל להקל על בעיה זו. קשור לפרוטוקול 3 (transfection cDNA ותרבות HUVEC על coverslip), השפעה גדולה על ההצלחה של הליך electroporation היא הטיפול של HUVECs היא במהלך trypsinization של התאים כדי להסיר אותם מבקבוק הפלסטיק, ובעקבות הסיום את electroporation (שלבים 3.3-3.4, לעיל). זה קריטי כדי אכפתמלא לפקח על HUVECs בעוד טריפסין, ולא יעלה את הזמן הדרוש עבור התאים &quot;עיגול לטובה&quot; על פני השטח של הבקבוק (בדרך כלל 1-2 דקות). זמן מופרז טריפסין הוא הגורם העיקרי למוות HUVEC, אשר בדרך כלל אינה ממומשת עד תאים מצופה על coverslips מצופה פיברונקטין (שלב 3.4) ולאחר מכן מצליחים לצרף המצע. חשיבות דומה, HUVECs (ורוב סוגי תאים ראשוניים) לא מסתדרים היטב כאשר מושעה • לפרקי זמן ממושכים למאגר electroporation. במהלך ניסויים בקנה מידה גדול יותר, למשל, כאשר המשתמש הינו חמש או יותר תנאים המחייבים electroporation, עדיף לשמור על התאים pelleted ב צינורות בודדים (1 צינור לכל transfection) כדי לערבב אותם, אחד-על-א-זמן , למאגר electroporation מיד לפני electroporation. גישה זו מקטינה זמן הדגירה חיץ electroporation והישרדות HUVEC מוגדל. בנוסף, הצלה מיידית בתקשורת התרבות השלמה היא גם crelectroporation הבא itical. עיכובי הצלת דקה אחת או יותר electroporation הבא יכולים לגרום סף המוות מוחלט HUVEC ובכך יש להימנע. assay נדידת תאים קשור (פרוטוקול 9), הטכניקה של culturing HUVECs בצפיפות גבוהה מאוד תלויה שינוי קריטי (כמתואר בשלב 9.2) של המתודולוגיה תרבית תאים המסורתית HUVEC (המתואר פרוטוקול 3) הדורש ייבוש של coverslip מצופה פיברונקטין על מנת לאפשר תרבות HUVEC לתוך שטח קטן מאוד של coverslip. פעמים רבות, אם coverslip לא יבש לחלוטין או אם ציפוי מראש של coverslip עם פיברונקטין (שלבים 2.1 או 2.2) היה לא יעיל, התאים המכילים התקשורת כי מושם על coverslip תאבד מתח הפנים שלה ולהרחיב את הקצוות של coverslip, ובכך להפחית את הצפיפות של תאים על coverslip. שיטה אחת כדי לפתור בעיה זו פוטנציאל היא לשאוב את התקשורת מן coverslip ולאחר מכןמקום coverslip (עדיין בצלחת 35mm שלה) לחלק האחורי של ארון הבטיחות הביולוגי למשך 5-10 דקות. הסתגלות זו יכולה לסייע כדי לאפשר את זרימת האוויר בתוך ארון לסייע בייבוש המנה. אם כל נוזל גלוי נשאר על coverslip לאחר ייבוש באוויר, לשאוב כתמים נוזליים ושוב ולאפשר לאוויר יבש למשך 5-10 דקות נוספות בקבינט בטיחות ביולוגית. חשוב לציין כי אין דרך למנוע זאת בעיה פוטנציאלית לחלוטין, אבל זה הופך להיות פחות בעיה עם תרגול חוזר של הפרוטוקול. זהו גם המלצה לפתרון בעיות אשר בעת הכנת coverslips עבור assay נדידת תאים (או כל assay, בכלל), כדי להכין coverslips נוסף ויש HUVECs נוסף מוכן ללכת במקרה של בעיות לאורך הדרך. עם שיקולים אלה לפתרון בעיות בחשבון, זה חשוב גם להדגיש את התועלת של פרוטוקולים דנו והשלכותיהם במחקר ביולוגיה של התא בעתיד. תחולת אל polyacrהגישה ylamide הוא רחב יריעה, וכוללת לא רק מחקרים דו מימדי ההתקשרות התא ECM (כמתואר לעיל), אלא גם חקירות תלת מימדי 5. יישום זה הוא קריטי להגדלת הבנתנו כיצד HUVECs להסדיר צורת תא והגירה בסביבות פיסיולוגיות אמורים לספק לחוקרי הבנה בסיסית של איך מורפולוגיים שינויים מתואמים עם שינויי cytoskeletal. בעוד הפרוטוקולים המתואר כאן מתמקדים מדידות של דינמיקת צמיחת MT, רוב הפרוטוקולים יכול וצריך להיות מותאם למדידה מספר רב של היבטים למדידה מיקרוסקופית אחרים של אינטראקציות התא-ECM. עם כל כבוד דינמיקת MT, ישנם רבים מפות, כולל לפחות 14 משפחות של kinesins 89, כל אחד עם תפקיד פוטנציאלי בתרומה הקוטבית HUVEC והגירה מכוונת, וכל אחד מהם יכולים להיחקר באמצעות הפרוטוקולים שהוצגו. חקירות עתידיות במקרה בוסימפוני יכוון אירוסי תא ECM ב רגיל לעומת מדינות חולות. פרוטוקולים HUVEC המוצגים כאן הם החלים על חקירות של תהליכים ההומיאוסטטית וסקולרית נורמלי, כמו גם מדינות מחלה כולל מחלות לב, רטינופתיה, גידולים סרטניים וגרורות, עד כמה שם. Conjugating בעליל מצעי ECMS ו polyacrylamide שקופים ציות נוח עם מחקרים מיקרוסקופים יאפשר ללימודי אירוסי התא ECM כך אנגיוגנזה וסקולרית תא האנדותל יכולה להיות במעקב עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. אלו סוגים של גישות ניסיוניות כבר החלו לחשוף הבדלים חשובים בכושר תא האנדותל, קוטביות, הגירה, ואת ההשפעות של פרוטאינים המווסתים תהליכים אלה 5,31,90. מאמצי עתיד צריכים לשאוף לזהות כיצד השילוב של ציות ECM ו- ממדי mechanosensing עשוי לשמש לחלבונים שליטים מקומית כי למקד ולהסדיר דינמיקת cytoskeletal.

אנגיוגנזה מופעלת על ידי רמזי איתות תאיים המקדמים בתאי האנדותל (EC) לקטב, נודדים עם ייחוד כיוונית, ויוצרים כלי דם חדשים ברקמות הדורשים אספקת דם. גורמים תורמים חשבו לנהוג אנגיוגנזה הם אותות מן מטריקס (ECM). בתגובה רמזים פיזיים, ECS להאריך סניפים חדשים עם ייחוד כיוונית להנחות כיווני תנועה במבנה של 1,2 רשת כלי הדם. הארכיטקטורה של מורפולוגיה הסתעפות EC מוגדרת על ידי רגולציה מקומית של שלד תא microtubule (MT) בצורה מתואמת עם הסדרת contractility acto-שרירן 3. על מנת סניפים EC להיווצר, שרירן-II חייב להיות downregulated מקומית, וכתוצאה מכך בליטות קרום מקומי 4. באותו הזמן באותו המקום בתוך התא, דינמיקת צמיחת MT הופכת שונה וכתוצאה מכך צמיחת MT איטית ומתמשכת לקידום ענף אלוןgation ויציבות 5. תקנה cytoskeletal מתואמת זו מאפשרת ECS לקטב המורפולוגיה שלהם כדי להקל על ההגירה כיוונית. ההתפתחות המינית של מורפולוגיה תא מקוטבת דורשת MT המקוטב הרכבה 6. בעת העברת לתאי האפיתל, MTS לגדול לאט במיוחד בהתמדה בחוד החנית של התא 7-9; בעוד בנוירונים, בייזום ההתארכות של אקסונים או דנדריטים דורשים כי MTS הם לא רק בהווה, אלא כי הם דינמיים עוברים תהליכי ההרכבה ופירוק 10-15. בדרך זו, שליטה מקומית של דינמיקת צמיחת MT מקובעת את הארכיטקטורה של התא ומאפשרת שיפוץ מהיר של מורפולוגיה תאים כמו ECS לנווט ECM שלהם. דינמיקת צמיחת MT מוסדרת על ידי משפחות של חלבוני מנוע מולקולריים וחלבונים לא מנועים, כינת חלבונים הקשורים microtubule או microtubule מתנגש חלבונים (להלן Referred כדי כמפות). מפות ניתן להפעיל באופן מקומי או מומת, בדרך כלל באמצעות איתות מפלי יזם בממשק התא ECM 16,17. ברגע פעיל, מפות פונקציה על ידי קשירה של MT ושינוי קינטיקה של הרכבה ופירוק MT; ובכך תפקוד מקומי להסדיר דינמיקת MT כדי לקדם צורת תא קוטבי 18-20. Mitotic centromere Associated Kinesin (MCAK) היא מפה המשפחה Kinesin-13 הנקשרת הקצוות וזוגות MT הידרוליזה ATP כדי פירוק MT 21-23. תפקיד פונקציונלי זה של MCAK ידוע להיות קריטי בתוך 24-28 ציר mitotic, כמו גם במהלך שלבי 29,30. בתוך השלבים ECS, פירוק MT בתיווך MCAK מוסדר על ידי זרחון המושרה אורורה-A המקומי של MCAK בתגובה לפצוע קצה הפעלה מושרה של GTPase Rac1 הקטן. התוצאה של מפל איתות לכך היא עיכוב של MCAK בחוד החנית של ECS, כשהתוצאה היא צמיחה MT מקוטב כלפי leading קצה ופירוק MT-induced MCAK בקצה המאסף של נודדות 31 ECS. מתודולוגיות מסורתית למדידת הדינמיקה צמיחה MT בדרך כלל השתמשו ביד מעקב של טובולין fluorescently שכותרתו או או, ולאחרונה, שכותרתו fluorescently חלבון מחייב MT סוף 1 או 3 (EB1 או EB3, בהתאמה). הגישה טובולין פלורסנט יש את היתרון של תיוג מערך MT כולו. עם זאת, משום שרוב סוגי תאי mitotic לשמור על מערך רדיאלי של MTS במהלך השלבים 8,32,33, MTS ליד centrosome מאוד צפוף, וכתוצאה מכך, מעקב צמיחת MT ופירוק עם טובולין ניאון בדרך כלל מוגבל לציוד ההיקפי אזורים של התא. המגבלות האלה, ניצול של חלבוני EB-שכותרתו fluorescently (EB1 או EB3) כבר הגישה הנפוצה יותר למדידת דינמיקת MT. בגלל EBS רק התווית הפלוס בסיום הגדילה של MTS, הם מופיעים כמו קטנים (1-3 מיקרומטר), ניאון בהיר לבואts, ובכך לספק סמן להבחין בקלות של פילמור MT עם קרינת רקע מוגבלת מאוד 34-37. בעוד העובדה תווית EBS רק קבוצת משנה של מערך MT מייצגת כוח עיקרי של גישת EB, הוא גם ממחיש מגבלה אחת חשובה, כי MTS שאינו צומח לא מסומן על ידי גישת EB3. עם זאת, היכולת למדוד ולעקוב אחר שביטי EB3 לאורך זמן וכדי להמחיש צמיחת MT בתוך האזורים הסלולר תת לעשות אידיאלי גישה זו עבור יישומים הדורשים ערכה אזורית של ארגון MT. מגבלה קריטית נוספת של מתודולוגיות מסורתית דינמיקת צמיחת MT מדידה כבר ערכות נתונים גדולות מאוד והזמן הדרוש לניתוח נתונים. מגבלה זו נובעת מהצורך למעקב יד של מאה שביטי EB ברזולוציה גבוהה בזמן. יתר על כן, מדידות אלה צריכות להיעשות מספר משמעותי סטטיסטי של תאים וגם בצעו תחת מגוון מלא experimeתנאי פתיחות opening סגירות closures. לאחרונה, האילוצים הללו הוכרעו באמצעות טכניקות ניתוח חישובית מכוונת ספציפית שביטים מעקב EB3 באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות בתאים חיים 35. כאשר נעשה שימוש כראוי, גישה חישובית זה משמש הוא להגביל את הפוטנציאל לטעויות אנושות הקשורים מעקב יד מעבר למתן שיטת תפוקה גבוהה של מדידת פילמור MT. ניתוח חישובית של דינמיקת MT באמצעות חבילת תוכנה מבוססת Matlab, plusTipTracker, מאפשר למדידות של צמיחת MT על ידי מעקב אחר שביטי EB3 שכותרתו fluorescently 5,31,35,38. בנוסף, תוכנת plusTipTracker מאפשרת חישובים של אירועי אסון MT (פירוק aka) מבוסס על העלמות שביטי EB3 בתוך מסלול MT גדל, ומאפשרת משנה הסלולר (aka אזורי) ניתוח של דינמיקת צמיחת MT בתוך אזורים המוגדר על ידי משתמש של עניין . עבור המחקרים שלנו, דינמיקת צמיחת MT הושוותה בתוךאזורים מסועפים לעומת אזורים שאינם קנים, או בתוך מובילים לעומת נגרר קצות תא. פלט נתונים מתוכנת plusTipTracker יכול לשמש גם כדי ליצור שכבות מסלול בצבעים עבור תאים בודדים ואזורי משנה הסלולר. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה ששימשה לחקור את התפקיד של MCAK בויסות הדינמיקה צמיחה MT והתרומה של MT depolymerase זה להסדרת EC הסתעפות מורפולוגיה והגירה כיוונית. הגישה שלנו השתמשה שורת תאים ראשונית אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs), אשר בקלות תרבותית נוחים מאוד, transfection החולף נגרמת electroporation של cDNA פלסמיד. לאחר מכן השתמשו ברזולוציה גבוהה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות של HUVECs טרנספקציה עם סיום MT חלבון מחייב 3 (EB3) ו mitotic centromere Associated Kinesin (MCAK) cDNA -specific בונה כדי לבדוק את ההשפעות על הדינמיקה MT טרנספקציה HUVECs. PlusTipTracker מבוסס ניתוח תמונה חישובית של EB3MT בתוספת הקצוות -labeled היה למדוד מהירויות צמיחת MT ו גלגולי צמיחת MT בתמונות זמן לשגות, למדוד ולהשוות השפעות של מניפולציות ניסיון על דינמיקת צמיחת MT. מתודולוגיה זו מאפשרת לחקר דינמיקת MT וזיהוי כיצד רגולציה מקומית של דינמיקת MT בתוך אזורי משנה הסלולר תורמת לתהליכי angiogenic של הסתעפות והגירת EC. טכניקות אלו חלות על חקירות של כל MAP כי יכול להיות מתויג fluorescently והביע בתאים חיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aurora A Inhibitor I</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>99462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;mouse IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-1688-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-7788-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET455/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET525/36m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET605/70m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET605/70m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET700/75m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET700/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>RPI Products</td>
			<td>A30075-100.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clara cooled charge-coupled device camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>77026010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyelight 649 goat anti-rat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112-496-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-MV SingleQuot Supply &#38; Growth Factors (contents shown below)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum 25 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine brain extract 2.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL)&#160; 10.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic shutter</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>77016099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-036-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8006-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TiE</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI Technologies</td>
			<td>MS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>CS70330-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MCAK</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS310000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>Contains the electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2021854-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plusTipTracker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti&#8211;pT288&#8211;Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti&#8211;&#945;-tubulin</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA78G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>678-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk&#160;</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Yokagawa CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells at JoVE.com

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...