Name: assays for the degradation of misfolded proteins in cells
Uploaded: 2016-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells at JoVE.com

We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).

1. Framställning av reagens <ol><li> Förbereda cellysbuffert (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP-40). Supplement 2 mM DTT, 1x komplett proteas cocktail, och 250 IE / ml bensonas före användning. </li><li> Förbereda pelletbuffert (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl2). Supplement 2 mM DTT, 1x komplett proteas cocktail och 250 IE / ml bensonas före användning. </li><li> Förbereda 3x kokande buffert (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplement 150 mM DTT före användning. </li><li>...

<ol>
	<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+misfolding.">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426, 884-890 (2003).</li><li>Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+and+protection+against+misfolded+or+damaged+proteins.">Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins.</a> Nature. 426, 895-899 (2003).</li><li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis.">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease.">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+proteins+in+fatal+ways.">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+Light:+The+Growing+Complexity+of+p53.">Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53.</a> Cell. 137, 413-431 (2009).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+function+of+mutant+p53+by+coaggregation+with+multiple+tumor+suppressors.">Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors.</a> Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).</li><li>Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+repeat+disorders.">Trinucleotide repeat disorders.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 575-621 (2007).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+system+that+degrades+misfolded+proteins+and+protects+against+neurodegeneration.">A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration.</a> Mol Cell. 55, 15-30 (2014).</li><li>Chu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+E3+ligase+activity+of+TRIM+proteins.">SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins.</a> Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).</li><li>Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+of+RNF4+family+proteins+in+eukaryotes:+targeting+a+ubiquitin+ligase+to+SUMOylated+proteins.">Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins.</a> EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).</li><li>Janer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+clastosomes+prevent+nuclear+accumulation+of+mutant+ataxin-7+and+other+polyglutamine+proteins.">PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins.</a> J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).</li><li>Bauer, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+chaperone-mediated+autophagy+for+the+selective+degradation+of+mutant+huntingtin+protein.">Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein.</a> Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).</li><li>Austin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+causing+mutants+of+TDP-43+nucleic+acid+binding+domains+are+resistant+to+aggregation+and+have+increased+stability+and+half-life.">Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).</li><li>Paxinou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+alpha-synuclein+aggregation+by+intracellular+nitrative+insult.">Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult.</a> J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+mutants+as+sensors+of+proteome+stress.">Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress.</a> Nat Methods. 8, 879-884 (2011).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li><li>Fortini, M. E., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila:+on+a+wing+and+a+prayer.">Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer.</a> Trends Genet. 16, 161-167 (2000).</li><li>Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fading+media+for+live+cell+GFP+imaging.">Anti-fading media for live cell GFP imaging.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates.">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li><li>McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Statistics. 3, 173-179 (2014).</li><li>Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+degradation+of+truncated+polyglutamine+proteins+by+the+proteasome.">Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome.</a> EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).</li><li>Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregate+formation+inhibits+proteasomal+degradation+of+polyglutamine+proteins.">Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins.</a> Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).</li><li>Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proteasomal+function+due+to+the+expression+of+polyglutamine-expanded+truncated+N-terminal+huntingtin+induces+apoptosis+by+caspase+activation+through+mitochondrial+cytochrome+c+release.">Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release.</a> Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).</li><li>Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibitor+PS-341+induces+apoptosis+through+induction+of+endoplasmic+reticulum+stress-reactive+oxygen+species+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells.">Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells.</a> Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).</li><li>Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+protein+aggregation.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation.</a> Science. 292, 1552-1555 (2001).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrasarcoplasmic+amyloidosis+impairs+proteolytic+function+of+proteasomes+in+cardiomyocytes+by+compromising+substrate+uptake.">Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake.</a> Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).</li><li>Link, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+green+fluorescent+protein+into+a+toxic,+aggregation-prone+protein+by+C-terminal+addition+of+a+short+peptide.">Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide.</a> The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).</li></ol>

Mekanismer som reglerar nedbrytningen av felveckade proteiner är nödvändiga för att bibehålla homeostas cellulära proteiner, och de representerar sannolikt värdefulla läkemedelsmål för behandling av neurodegenerativa sjukdomar och andra protein misfolding sjukdomar. Här är analyser som undersöker nedbrytningen av felveckade proteiner som beskrivs med hjälp av en patogen Atxn1 protein (Atxn1 82Q) och en nukleär lokaliserad luciferas mutant (NLS-LucDM) som exempel. För att unde...

Proteiner är de mest förekommande makromolekyler i celler, och de spelar en viktig roll i praktiskt taget alla biologiska processer. Den biologiska aktiviteten hos de flesta proteiner kräver deras vikning in och underhålla, de infödda tredimensionella strukturer. Proteiner med avvikande konforma inte bara förlora sina normala funktioner, men också ofta bildar lösliga oligomera arter eller aggregat som försämrar funktionen hos andra proteiner och är giftiga för celler 1,2. För att motverka protein misfolding celler använder både molekylära chaperoner, som hjälper ovikta eller delvis vikta polypeptider för att nå sin nativa konformation och nedbrytningsvägar som eliminerar felveckade proteiner 3. Med tanke på komplexiteten och stokastiska natur fällbara processen, är protein misfolding oundviklig, och det kan inte återföras i fråga om mutationer, biosyntetiska fel, och post-translationella skador 1. Hence, celler förlitar sig ytterst på degradation vägar att behålla sin proteinkvalitet. Vikten av cellulär protein kvalitetskontroll (PQC) system understryks av förekomsten av protein-misfolding sjukdomar, inklusive cancer, diabetes, och många neurodegenerativa störningar, såsom Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, amyotrofisk lateral skleros, Huntingtons sjukdom (HD), och spinocerebellär ataxi (SCA) 4,5. Till exempel, mutationer i tumörhämmande p53 är den enskilt vanligaste genetiska skada i tumörer, i samband med ~ 50-70% av alla fall 6. En väsentlig fraktion av p53-mutationer är missense-mutationer som förändrar konformationen av p53, vilket leder till bildningen av aggregat 7. Dessutom är proteiner med utökade polyQ sträckor genetiskt och patologiskt samband med HD och SCA. Dessa progressiva och ofta dödliga sjukdomar uppenbart när längden på den polyQ stretch i de påverkade proteinerna överskrider en viss threshålla, och blir allt allvarligare som längden på den polyQ stretch förlänger 8. En attraktiv metod för behandling av dessa sjukdomar är att terapeutiskt stärka cellulära PQC system, särskilt nedbrytningsvägar. Men de är involverade i nedbrytningen av felaktiga proteiner, särskilt i däggdjursceller, dåligt förblir förstås. Även om det har varit känt att proteasomet är av avgörande betydelse för nedbrytningen av felveckade proteiner, förblir en viktig fråga odefinierad: hur felveckade proteiner specifikt igen och riktade för nedbrytning. Vidare, fastän PQC system har identifierats i cellulära fack inklusive cytoplasman, det endoplasmatiska retiklet, och mitokondrien, de PQC system i kärnan förblir oklara 2. Nyligen genomförda studier från vårt laboratorium har identifierat ett system som känner igen och försämrar en mängd felveckade proteiner i kärnanav däggdjursceller 9. Detta system består av promyelocytisk protein (PML), ett nukleärt protein och en medlem av den tredelade -områdesbindande innehållande (TRIM) proteinfamiljen, och RNF4, en RING-domän innehållande protein. PML, och flera andra TRIM proteiner har SUMO (liten ubiquitin liknande modifierings) E3 ligasaktivitet, vilket underlättar specificitet och effektivitet av protein SUMOylation 10. RNF4 tillhör en liten grupp av SUMO inriktade ubiquitin ligaser (STUbL), som innehåller en eller flera sumo-interagerande motiv (SIMS), utöver den RING-domän som ger dem den ubiquitin-ligas-aktivitet 11. Vi fann att PML erkänner specifikt felveckade proteiner genom diskreta substratigenkänningsställen som kan urskilja olika egenskaper på felveckade proteiner. Vid bindning, PML taggar felveckade proteiner med poly-kedjor av SUMO2 / 3, två nästan identiska däggdjurs SUMO proteiner som kan bilda poly-kedjorna på grund av förekomsten av en intern SUMOylation webbplats. SUMOylated felveckade proteiner sedan erkänts av RNF4, vilket leder till deras ubikitinering och proteasomal nedbrytning. Vi visade vidare att PML-RNF4 systemet är viktigt för skydd mot neurodegeneration, såsom brist på PML förvärrar beteende och neuropatologiska defekter i en musmodell för SCA typ 1 (SCA1) 9. För att skilja proteinnedbrytning från andra cellulära mekanismer som kan reglera proteinnivåer, var andelen proteinomsättningen mätt 9. Bland de mest använda metoderna för att bestämma proteinomsättning är puls jaga och cykloheximid (CHX) jaga. Dessa två metoder undersöka tiden, respektive, de radioisotopmärkta proteiner av intresse i översättnings skicklig celler och totala redan existerande proteiner av intresse i översättnings inhiberade celler. Men det är en stor utmaning för att studera patogena och felveckning benägna proteiner som halveringstiden av dessa proteiner kan vara extremt long. Till exempel, ataxin-1, ataxin-7, Huntingtin, α-synuklein, och TDP-43 har alla halveringstider på mer än 12 till 24 timmar 9,12-16. Den långsamma personalomsättning av dessa proteiner utesluter användningen av CHX jaga analysen eftersom cellerna hyser dessa proteiner inte kan överleva längre översättning inhibition, särskilt eftersom de felveckade proteiner själva kan vara mycket giftiga för celler. Puls-chase analys med isotopmärkning kan också vara en utmaning för proteiner som är mycket aggregering benägna. De flesta puls jaga analyser förlitar sig på immunoutfällning för att separera proteinet av intresse från alla andra proteiner som också är radioaktivt märkta. Detta förfarande omfattar normalt långa immunoprecipitation och tvättförfaranden, under vilken SDS-olösliga aggregat kan bildas, vilket gör analysen med SDS-PAGE-elektrofores felaktig. Här ett protokoll för att analysera kärn felveckade proteiner med en långsam omsättningshastighet beskrivs 9. En patogen form av ataxin-1 (Atxn1) som innehåller en sträcka av 82 glutaminer (Atxn1 82Q) används för detta ändamål 8. När den uttrycks i celler, en förbättrad grönt fluorescerande protein (GFP) fusion av Atxn1 82Q former mikroskopiskt synliga inneslutningar i kärnan (Figur 1A). Puls chase analys visar att halveringstiden för Ataxn1 82Q är över 18 timmar 9. Atxn1 82Q består av arter med felveckade konformationer av olika egenskaper, liksom arter med nativ konformation. Det är troligt att dessa arter bryts ned i olika takt, och därför bör analyseras separat. Lysat från Atxn1 82Q-GFP-uttryckande celler fraktioneras i NP-40-löslig (lösligt eller NS, sannolikt representerar nativa proteiner eller felveckade mono / oligomera proteiner) och NP-40 olöslig (NI, aggregerad / felveckade) delar. Det senare kan ytterligare delas in i SDS-löslig (SS, sannolikt oordnade aggregat) eller SDS-resistenta (SR, sann amyloidfibriller) Fraktioner (Figur 1B). NS och SS-fraktioner kan analyseras genom SDS-PAGE följt av Western blotting, under det att SR-fraktionen kan detekteras genom filter retardation assays följt av immunoblotting. CHX chase kombineras med detergenten fraktioneringsmetoden, och upptäckte att halveringstiden för SS Atxn1 82Q är mycket kortare än den hos NS Atxn1 82Q och total Atxn1 82Q (figur 2A), vilket indikerar att SS-fraktionen kan kännas igen och bryts ned i celler 9. Således ger denna metod ett kraftfullt verktyg för att studera dynamiken i felveckade proteiner och jämföra deras mönster nedbrytning. Vi beskriver också en metod som är lämplig för högeffektiv screening för identifiering av makromolekyler eller små föreningar som kan modulera nedbrytningen av felveckade proteiner. Denna metod är baserad på en konformationsmässigt destabiliserad mutant av eldflugeluciferas (LucDM) 17, en modell chaperone substrat. Vi har säkringd LucDM till en nukleär lokaliseringssignal (NLS) för att söka av PQC system i detta cellulär avdelning, och GFP (NLS-LucDM-GFP) för att underlätta detektering. NLS-LucDM-GFP former mikroskopiskt synliga kärn aggregat i en liten andel av celler (figur 3a). Liknar Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-men inte dess vildtyp motsvarighet NLS-LucWT-GFP-modifieras genom SUMO2 / 3 och reglerade av PML-RNF4 reaktionsväg 9. NLS-LucDM-GFP utgör också SS och SR arter, även om de relativa mängderna av SS och SR arter är minimal jämfört med NS, med användning av de betingelser som beskrivs i protokoll 3 nedan. För att förenkla analysen kan vi endast analysera SDS lösliga LucDM (inkluderande både NS och SS-fraktioner) genom SDS-PAGE och western blöt. Viktigare, visade CHX chase assay som halveringstiden av SDS-lösliga NLS-LucDM-GFP är mycket kortare än den hos dess vildtyp motsvarighet (figur 3B), vilket antyder att LucDM är ett specifikt substrat för systemet som känner igen och bryts nedfelveckade proteiner. Nedbrytningen av LucDM-GFP orsakar en betydande nedgång i den totala fluorescenssignal. Därför har vi också utvecklat ett protokoll för realtidsdetektion av cellulär LucDM-GFP med hjälp av mikro fluorescens-baserad analys. Många hög genomströmning skärm (HTS) system utvecklas för läkemedel eller gener som modifierar cellulära aggregat och cellulär viabilitet orsakas av avvikande proteiner 18-20. Emellertid är mycket få HTSs särskilt utformade för inriktning nedbrytning i däggdjursceller. Detta protokoll fungerar som ett robust system för snabb och storskalig analys av effekterna av proteinuttryck, knockdown, och läkemedelsbehandling på cellulär felveckade proteinnedbrytning. Använda HeLa-celler som exempel nedan beskriver vi de protokoll för analys av dessa två felveckade proteiner. Analyserna kan också tillämpas på andra cellinjer, även om transfektion villkor och tidsförlopp kan behöva optimeras för enskilda cellinjer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11995-092</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">NP-40</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NP40S-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">SDS</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MG132</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45000232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:175px;">Roche Boehringer Mannheim</td>
			<td style="width:119px;">4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Bio-Dot Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Living Colors GFP Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:175px;">Clonetech</td>
			<td style="width:119px;">632375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Anti-Actin mAb Rabbit, IgG</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A45060-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Amino acids</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Olympus IX-81&#160; Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:175px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71/IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Greiner</td>
			<td style="width:119px;">89135-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200&#174; PRO</td>
			<td style="width:175px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;">Infinite 200&#174; PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cellulose acetate membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:175px;">Sterlitech</td>
			<td style="width:119px;">CA023001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Prism 5</td>
			<td style="width:175px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the degradation of misfolded proteins in cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

I ett stabilt tillstånd analys, kan observeras mikroskopiskt synliga Atxn1 82Q-GFP-nukleära aggregat hos 30 - 50% av HeLa-celler 20 h efter transfektion (Figur 1A). Western blot-analys av NS och SS fraktioner med användning av anti-GFP-antikropp visar en distinkt band av Atxn1 82Q-GFP mellan 100 kDa och 150 kDa markörer, vilket motsvarar proteinets molekylvikt (Figur 1B). Atxn1 82Q-GFP i SR-fraktionen kan detekteras antingen genom filter retardation ...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells at JoVE.com

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Analyser för nedbrytningen av Felveckade proteiner i celler

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Kristallisering av membranproteiner i Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotoblekning tester (FRAP &amp; Flip) för att mäta Chromatin Protein Dynamics i Living embryonala stamceller

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Viability Assays for Cells in Culture

Bärkraft: Analyser för celler i odling

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Odling av Human Nasal epitelceller på Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Cell-baserade L-glutation Protection Analyser för att studera Endocytosis och återvinning av plasmamembranproteiner

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Rekonstitution av β-catenin nedbrytning i<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Utdrag

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Reporter baserade tillväxtanalys för systematisk analys av proteinnedbrytning

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

Jämföra Affinity av GTPas-bindande proteiner med hjälp av konkurrensanalyser

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Hög Utbyte Expression av rekombinanta humana proteiner med transient transfektion av HEK293 celler i suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...