Name: high-throughput screening of carbohydrate-degrading enzymes using novel insoluble chromogenic substrate assay kits
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить профессора J. Paul Нокс (Университет Лидса, Великобритания), который предоставил доступ к своей лаборатории для съемок, и Сьюзан Е. Маркус за отличную техническую помощь. JS не признает проект WallTraC (Европейской рамочной программы Комиссии Седьмой (соглашение о гранте №. 263916) и биомассой проекта для 21-го века (инновационный фонд Дании; дело № .: 103408) SKK благодарит проект SET4Future (Danish стратегических исследований Совета), Био-Значение стратегического основан датским советом стратегических исследований, датского совета по технологиям и инновациям (грант делу № .: 0603-00522B) и биологии-ориентированный подход для понимания ферментативного разложения комплекса полисахарид систем (грант делу № .:. 107279) для финансирования Эта статья отражает взгляды авторов только Европейский Союз не несет ответственности за любое использование, которое может быть изготовлен из информации, содержат в настоящем документе..

1. хромогенного анализа с CPH субстраты в 96-луночный планшет формата <ol><li> Активация набора для анализа пластины <ol><li> Активация фильтра 96-луночного (содержащий синий CPH-ксилана) набор для анализа пластины (список материалов) путем добавления 200 мкл раствора, полученного активации (с комплектом) в каждую лунку с последующим 10 мин инкубации при комнатной температуре без перемешивания. </li><li> Применение вакуума с помощью вакуумного коллектора (с распорной блок внутри и любого стандарта, прозрачный 96-луночный планшет в виде коллекции пластины), чтобы удалить из дошедших до нас активирующего раствора. Кроме того, можно использовать центрифугу при 2,700 мкг в течение 10 мин для этого шага вместо вакуумного коллектора. </li><li> Вымойте КПВ субстратов путем добавления 100 мкл стерильной воды и применять вакуум (или центробежной силы) для удаления стабилизатора. Повторите этот шаг еще два раза и планшеты теперь готовы к использованию. </li></ol></li><li> ферментной реакции Примечание: Всегда включайте буферв одиночку в качестве отрицательного контроля, и, если возможно, ранее охарактеризованными ферментами в качестве положительных контролей. Используйте статистически необходимое количество повторов. КПВ субстраты стабильны при рН от 3,0 до 10,0 и от общего объема раствора конечного буфера фермента в каждую лунку, не должна превышать 180 мкл. Экстракт из растений или культуральный бульон также может быть использован вместо очищенного раствора фермента. <ol><li> Добавьте 150 мкл 100 мМ натрий - ацетатного буфера, рН 4,5 , и 5 мкл эндо -cellulase раствора (до конечной концентрации 1 ед / мл) в каждую лунку набора для анализа пластины. </li><li> Поместите продукт пластину (ясный-луночный планшет совместим с читателем Микротитровальный пластины) под набор для анализа пластины для сбора любой потенциальной утечки из реакционной пластины при сотрясении. </li><li> Выдержите набора для анализа пластины при температуре 25 ° С в течение 30 мин в горизонтальном шейкере при 150 оборотах в минуту. Примечание: Смешивание реакции в набор для анализа пластины во время инкубации имеет решающее значение для достижения последовательного и репроприводима результат. CPH субстраты стабильны до 90 ° C. Время инкубации должна быть увеличена до 24 часов при испытании культуральных бульонах, содержащих неизвестные концентрации фермента с CPH субстратов. Следует отметить, что соответствующие периоды инкубации зависят от активности фермента (ов), но в общем случае, если не обнаружено активности в течение 24 часов, вполне вероятно, что фермент не будет ухудшать тестируемый субстрат. Активный фермент деградирует нерастворимых хромогенные полисахаридами КПВ субстрата в растворимые хромогенных олигосахариды, которые видны в виде окрашенного супернатанта. </li><li> Поместите чистую тарелку продукта внутри вакуумного коллектора с распорного блока внутри. </li><li> Поместите пластину набора для анализа на верхней и применять вакуум (максимальное отрицательное давление -60 кПа). Кроме того, можно использовать центрифугу при 2,700 мкг в течение 10 мин. Примечание: Фильтрат , содержащий цветные олигосахариды в качестве продукта реакции теперь в продукте пластины для дальнейшего анализа 8 </sвверх&gt;. </li></ol></li><li> Обнаружение и Количественное <ol><li> Убедитесь, что объем жидкости в каждую лунку продукта пластины примерно одинакова при визуальном осмотре. </li><li> Измерить оптическую плотность сбора пластины при 595 нм для синего CPH-ксилана, используя планшет-ридер. </li><li> При выполнении анализа данных, вычесть буфера только отрицательные контрольные значения из значений из скважин, где был добавлен фермент. Рассчитывают среднее значение и стандартное отклонение от средств (SEM) из дублированных лунках 8. </li></ol></li></ol> 2. хромогенного анализа с МКТ Подложки в формате 96-луночного <ol><li> ферментной реакции <ol><li> Добавляют 150 мкл 100 мМ ацетата натрия буфера, рН 4,5 , и 5 мкл 31 ед / мл эндо -xylanase раствора в каждую лунку набора для анализа пластины , содержащей красный МКТ-пшеничной соломы (конечная концентрация фермента в скважине: 1 ед / мл) , Примечание: Набор для анализа пластины (96-луночного фильтр плАтес содержащие ICB субстраты) производятся, как описано в литературе (см перечень материалов). МБК субстратами являются стабильными в буферах при рН в диапазоне между рН 3,0 до 10,0. Всегда включать только буфер в качестве отрицательного контроля, коммерческие ферменты в качестве положительного контроля и использовать статистически соответствующее количество копий. <ol><li> Не активировать ICB субстраты, как пластины CPH подложки, но удалить стабилизатор промывкой три раза с 100 мкл воды, а затем с помощью вакуумной фильтрации или центрифугирования. </li></ol></li><li> Поместите пластину продукта под пластиной подложки для сбора любой потенциальной утечки из пластины подложки при сотрясении. </li><li> Инкубируйте реакции при 25 ° С, встряхивая при 150 оборотах в минуту в течение 2 часов. Примечание: активный фермент деградирует нерастворимых хромогенные полисахариды в ICB субстрата в растворимые олигосахариды, которые видны как цветная супернатанта. ICB субстраты стабильны до 90 ° C. Инкубационный тIME должен быть увеличен до 24 часов, если неочищенные ферменты, такие как культуральных бульонов используются. </li><li> Поместите пластину продукта внутри вакуумного коллектора с распорного блока внутри. </li><li> Поместите пластину набора для анализа на верхней и применять вакуум (максимальное отрицательное давление -60 кПа) или использовать центрифугу для фильтрата продукта из набора для анализа пластины в лунку продукта пластины. Примечание: Фильтрат , содержащий цветные олигосахариды в качестве продукта реакции в настоящее время в коллекции пластины для дальнейшего анализа 8. </li></ol></li><li> Обнаружение и количественное определение <ol><li> Убедитесь, что объем жидкости в каждую лунку для сбора пластины приблизительно одинакова при визуальном осмотре. </li><li> Измерить оптическую плотность сбора пластины при 517 нм для красного ICB-пшеничной соломы с использованием планшет-ридера. </li><li> При выполнении анализа данных - вычесть буфер - только отрицательные контрольные значения из значений из лунок, где ферментбыл добавлен. Рассчитывают среднее значение и стандартное отклонение от средств (SEM) из дублированных лунках 8. Примечание: В случае скрининга неизвестных ферментов, мы предлагаем сделать серию разбавления, чтобы получить более подробные данные о динамическом диапазоне активности фермента. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbohydrate-active+enzymes+database+(CAZy)+in+2013.">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).</li><li>Cantarel, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Carbohydrate-Active+EnZymes+database+(CAZy):+an+expert+resource+for+Glycogenomics.">The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics.</a> Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).</li><li>Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+of+analysis+of+biomass+sugars+using+high-performance+liquid+chromatography.">Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography.</a> Biotechnol. Lett. 26 (15), 1207-1211 (2004).</li><li>Black, G. E., Fox, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+analysis+of+sugar+monomers+from+complex+matrices+using+chromatography+in+conjunction+with+mass+spectrometry+or+stand-alone+tandem+mass+spectrometry.">Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 720 (1-2), 51-60 (1996).</li><li>Miller, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dinitrosalicylic+Acid+Reagent+for+Determination+of+Reducing+Sugar.">Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar.</a> Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).</li><li>Somogyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notes+on+Sugar+Determination.">Notes on Sugar Determination.</a> J. Biol. Chem. 195 (1), 19-23 (1952).</li><li>Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+diffusion+assay+for+screening+of+beta-glucanase-producing+microorganisms.">Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms.</a> Biotechniques. 33 (4), 798 (2002).</li><li>Kra&#269;un, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+versatile+chromogenic+substrates+for+high-throughput+analysis+of+biomass-degrading+enzymes.">A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes.</a> Biotechnol Biofuels. 8, (2015).</li><li>Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cyclodextrin+glycosyltransferase+into+a+starch+hydrolase+with+a+high+exo-specificity.">Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity.</a> J. Biotechnol. 103 (3), 203-212 (2003).</li><li>Nyyssonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+high-throughput+functional+screening+and+next+generation+sequencing+for+identification+of+plant+polymer+decomposing+enzymes+in+metagenomic+libraries.">Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries.</a> Front Microbiol. 4, 282 (2013).</li><li>Sweeney, M. D., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+Converting+Enzymes+as+Industrial+Biocatalysts+for+Fuels+and+Chemicals:+Recent+Developments.">Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments.</a> Catalysts. 2 (2), 244-263 (2012).</li><li>Biely, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+xylan+deacetylating+enzymes+on+monoacetyl+derivatives+of+4-nitrophenyl+glycosides+of+beta-D-xylopyranose+and+alpha-L-arabinofuranose.">Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose.</a> J. Biotechnol. 151 (1), 137-142 (2011).</li><li>Mackenzie, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polysaccharide+utilization+locus+from+an+uncultured+bacteroidetes+phylotype+suggests+ecological+adaptation+and+substrate+versatility.">A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).</li></ol>

Есть две патентные заявки, поданные с участием анализа подложки 96-луночного планшета CPH и анализ ICB подложки 96-луночного (WO2015036000 и Дании PA 2015 70311).

Мы используем новое поколение разноцветных CPH и МКТ субстратов , которые основаны на chlorotriazine красителей (полный список подложек в таблице 1) расположены в специально созданных коммерческого набора для анализа. Ферментативного расщепления субстратов дает мелкие, растворимые, окрашенные продукты , которые могут быть обнаружены в растворе для анализа и может быть определена количественно с помощью ридера 9 пластин. Этот анализ предназначен для оценки эндо -Актерское ферментов и чувствительность анализа аналогичен подход, использующий azurine поперечно сшитую (AZCL) подложках 10, в то время как другие способы доступны для экзо -Актерское ферментов 11,12. Ограничение этого набора для анализа заключается в выявлении эндо -enzyme активности, а CPH, а также ICB подложки не разлагаемые на экзо -enzymes , скорее всего , из - за стерических затруднений , возникающих из красителя и сшивающих молекул 8. Анализ проводят в 96-достл формат и индивидуальные реакции происходят в скважинах. Реакция должна быть тщательно перемешана в плите, чтобы получить воспроизводимые данные. Полученные супернатанты фильтруют в табличке, где поглощение каждой лунки может быть определена количественно с помощью оптической плотности спектрометрией. Основные принципы и расположение анализа показаны на рисунке 1. Анализ состоит из аналитического планшета (96-луночный фильтровальный планшет а) с подложками, и после инкубации с ферментами, надосадочную жидкость фильтруют через в четком луночного планшета и оптические плотности считывают обеспечивая полуколичественный измерение ферментной специфичности и активности. Было показано, что этот скрининг тест с использованием CPH субстраты могут быть также использованы в агаровой формате пластины, где растворимые продукты реакции создать цветной ореол после инкубации в течение ночи. 8 Наборы анализа могут быть использованы для скрининга очищенные ферменты и их возможные побочные действия, как показано вРисунок 2. Побочные действия могут возникать из одного фермента и его беспорядочном специфичности , но и с тем , что образец анализировали представляет собой смесь различных ферментов и их синергический эффект должен быть изучен. Кроме того, как было показано в предыдущих исследованиях, что ферментные коктейли, кишечную флору 13 и культуральные бульоны из грибов 8, а также эндогенный фермент , растений и бактерий (неопубликованные данные) могут быть использованы в качестве источника фермента. ICB субстраты решения сложных смесей компонентов клеточной стенки часто встречаются в промышленных процессах пробоя биомассы. Эти подложки предназначены для оценки наличия полисахарида и предоставить информацию о том, как эффективно оптимизировать коктейли деградации для более эффективного выхода деградации. Как показано на рисунке 3 CPH и ICB подложки могут быть использованы в ферментной скрининга бок о бок - показывая огромное количество информации о специфичности фермента А.Н.d активность в обоих контексте предпочтительного субстрата (CPH) и более природный комплекс, содержащий другие компоненты в дополнение к предпочтительным субстратом более близко имитируя макромолекулярная сборка обнаруживаемых в природе (ICB). Использование нескольких цветов позволяет одновременного обнаружения различных ферментативных активностей против нескольких субстратов, что увеличивает высокую пропускную способность и multiplexity анализа. Спектры различных красителей может быть решена путем простой линейной регрессии и в большинстве случаев активность мульти-субстрат можно наблюдать при визуальном осмотре в одиночку. Имитируемый примером такого эксперимента и его результаты изображено на рисунке 4. Этот анализ инструментов и универсальность его применения очень хорошо подходит для скрининга первого уровня ферментов и культуры бульонов с неизвестными деятельности. Наиболее важными аспектами этого анализа являются его высокая пропускная природа, настраиваемость, простота использования и гибкость. Имея это в виду, ше полагают, что этот новый набор инструментов позволит значительно улучшить и ускорить процессы фермента скрининг на промышленных объектах, а также научных приложений.

Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.
We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.
One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8. 
The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).
CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:427px;">assay kit plates</td>
			<td style="width:145px;">Glycospot</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:288px;">customized assay kit plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">activation solution</td>
			<td>Glycospot</td>
			<td></td>
			<td>for activating CPH substrates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>5015</td>
			<td>spacer block</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 &#181;m, clear, non-sterile</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSHVN4510</td>
			<td>assay plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-Well Microplates, Polypropylene</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>651201</td>
			<td>collection plate after washing the substrates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nunc&#8482; MicroWell&#8482; 96-Well Microplates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>269620</td>
			<td>product plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diaphragm pump MZ 2 NT</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>732000</td>
			<td>vacuum pump used with the vacuum manifold</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Infors HT Ecotron</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>4950132 (Buch &#38; Holm)</td>
			<td>horizontal shaker</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SpectraMax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>10067-750 (VWR)</td>
			<td>96-well plate absorbance reader</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuum manifold</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>5017</td>
			<td>vacuum manifold</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-CELTR</td>
			<td>cellulase [cel]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">endo-&#946;-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus)&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-BMACJ</td>
			<td>mannanase [man]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">endo-&#946;-1,3-glucanase (Trichoderma spp.)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-LAMSE</td>
			<td>&#946;-glucanase [glu]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger)&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-EGALN</td>
			<td>galactanase [gal]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">endo-&#946;-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger)&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-XYAN4</td>
			<td>xylanase [xyl]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-XEGP</td>
			<td>xyloglucanase [xg]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#945;-amylase (Bacillus licheniformis)&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>E-BLAAM</td>
			<td>amylase [amy]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of carbohydrate-degrading enzymes using novel insoluble chromogenic substrate assay kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits at JoVE.com

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Высок объём Люцифераза Assay для оценки протеолиза PCSK9 сингл оборот протеазы

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Распознавание последовательности ДНК с помощью высокопроходимых профилирований primase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Полу-высокой пропускной адаптации NADH-связанных АТПас анализ для скрининга малых ингибиторы молекулы

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Скрининг на фитоэстрогены с помощью клеточного рецептора эстрогена β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Флюорометрический анализ на основе Click-Химии для аполипопротеин N-ацилтрансферазы от характеристики ферментов до высокопроизводительного скрининга

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Экономичная и универсальная высокопроизводительная система очистки белка с использованием многоколоночного пластинчатого адаптера

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Анализ флуоресценции кальция с двойным добавлением для высокопроизводительного скрининга рекомбинантных рецепторов, связанных с G-белком

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...