Name: a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform
Uploaded: 2016-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃŽÂ²-cell Replication Discovery Platform at JoVE.com

This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Stanford University School of Medicine durchgeführt. 300 g - Das beschriebene Protokoll wird von sechs 250 für Inselisolierung skaliert (8 - 9 Wochen alte) männliche Sprague-Dawley-Ratten, die 228 Wells einer 384-Well-Platte für die Inselzellen-Replikationsabschätzung zu erzeugen ausreichend ist. 1. Material Vorbereitung <ol><li> Bereiten Beschichtungsmedien vor Beginn der Inselisolierun...

<ol>
	<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes.">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li><li>Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+pathology+and+the+pathogenesis+of+type+1+and+type+2+diabetes+mellitus+revisited.">Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited.</a> Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).</li><li>Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+kinase+inhibition+selectively+promotes+rodent+and+porcine+islet+beta-cell+replication.">Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+cAMP-modulating+medications+to+promote+beta-cell+replication.">Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication.</a> Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).</li><li>Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. 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Experimentelle Methoden für die molekularen Mechanismen zu studieren, die β-Zellwachstum und Regeneration zu steuern sind wichtige Werkzeuge für die Diabetes-Forscher. Hierbei wird eine Ratte-Insel-basierte Screening-Plattform für kleine Molekül Stimulatoren der β-Zell-Replikation identifizieren und zu charakterisieren, wird präsentiert. Während die meisten Aspekte dieses Protokolls leicht von erfahrenen Forschern durchgeführt werden, erfordern ein paar Schritte besondere Technik. E...

Diabetes umfasst eine Sammlung von Störungen des gemeinsamen Endpunktes gestörter Glukose-Homöostase zu teilen. Obwohl die pathogenen Mechanismen von Diabetes - Subtypen unterschieden sind, sie die Folge einer verminderten β-Zellmasse teilen, dh Verlust von Insulin Produktionskapazität 1,2. Derzeit verlassen Diabetes Behandlungsstrategien auf die chronische Verabreichung von exogenen Insulin, pharmakologische Stimulation der Insulinproduktion oder Verbesserung der Insulinempfindlichkeit und in seltenen Fällen die Transplantation von Pankreas - Inseln oder ganze Bauchspeicheldrüse 3,4. Leider ist der Erfolg dieser Strategien ist von kurzer Dauer und / oder nicht in ausreichendem Maße die Funktion der endogenen Insulinproduktion rekapitulieren. Trotz der Nützlichkeit, ein Verfahren zur Entwicklung von β-Zell-Regeneration zu stimulieren, kein solcher Ansatz vorhanden ist. Folglich ist ein wichtiges Ziel der Diabetesforschung , Methoden zu entwickeln neue β-Zellen zu erzeugen , oder endogene β-Zellmasse 5 zu erweitern </sup&gt;. Obwohl β-Zellregeneration aus erneuerbaren Quellen wie embryonale Stammzellen voranschreitet , Sicherheit und Effizienz betrifft , um die Verfolgung alternativer Strategien, einschließlich der Erweiterung der reifen β-Zellen, eine Priorität 6,7. Wichtig ist , ist die vorherrschende Quelle von neuen β-Zellen in vivo vorbestehenden β-Zellen und nicht spezialisierte Vorläuferzellen 8,9. Obwohl β-Zellen begrenzte Replikationskapazität, eine geringe Zunahme der β-Zellmasse zu haben scheinen (~ 30%) ausreichend sein Glucosehomöostase in viele Diabetiker wiederherzustellen. Darüber hinaus ist in situ pharmakologische Stimulation der β-Zellmasse eine potentiell kostengünstige und skalierbare Behandlungsstrategie. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von kleinen Molekülen, die β-Zellwachstum stimulieren dargestellt. Eine Vielzahl von in vitro experimentellen Methoden verwendet werden können Genprodukte und / oder Moleküle zu identifizieren , That fördern primäre β-Zell-Replikation. Frühe Bemühungen für β-Zell - Replikation Induktionsmessung verwendet fötalen Nagetier Bauchspeicheldrüsen Kultur oder intakte isolierte Inselkulturen zu messen [3 H] Thymidin - Einbau, BrdU - Einbau oder mitotischen Körper innerhalb der Aldehyd-Thionin oder Insulin gefärbten Population als Reaktion auf bestimmte Behandlungsbedingungen 10, 11. Diese in - vitro - Ansätze und nahe Varianten davon haben einige Einschränkungen. Prominent Mängel umfassen (1) die Verwendung von fetalen Zellen , die, im Gegensatz zu reifen β-Zellen, eine hohe basale 12 in einer bestimmten Weise reguliert β-Zellreplikationsrate und das Wachstum anzuzeigen; (2) die subjektive Natur der Experimentator abhängigen Jurierung von β-Zellen-Replikationsereignisse; (3) die arbeits- und zeitintensiv Natur der Experimentator abhängige Zählung von β-Zellen-Replikationsereignisse verzögert experimentellen Durchsatz; (4) die Nutzung der Kern Einbau / Fleck / Aussehen Replikation zu identifizieren, selbstts und eine nicht-überlappenden zytoplasmatischen stain β-Zellen zu identifizieren, führt zu Fehlattribution von proximalen nicht-β-Zell-Replikationsereignisse-Zellen ß. In jüngerer Zeit reifen haben primäre β-Zellen , die die Auswirkungen von Transgen Überexpression sowie Genprodukts oder Verbindung Behandlung auf β-Zell - Replikation 13-16 zu bewerten verwendet worden. Allerdings haben diese Studien auch auf subjektive Zählen von Replikationsereignisse verlassen, zytoplasmatische staining- oder nicht-spezifischen Methoden für die β-Zellen - Identifikation und / oder arbeitsintensive Schritte , die den Durchsatz begrenzen, beispielsweise einzelne Einschub gut Plattieren von Zellen oder intakten islet Paraffineinbettung und Verarbeitung 17. Bemerkenswert ist , ein bildbasiertes menschliche β-Zellreplikation Screening Methode, ähnlich der hier vorgestellten, wurde 18 veröffentlicht wurde ; jedoch hat erfolgreiche Verwendung dieses Assays nicht nachgewiesen werden, und die Verwendung von menschlichen Inseln zur Vorabsiebung nicht breit sein FEAwortlich. Eine alternative Strategie zur Identifizierung von Replikationsfördernde Substanzen das Wachstum Induktion von β-Zelllinien zu bewerten. Erste Versuche umgewandelt β-Zell-Linien verwendet wie MIN6 Zellen oder INS 832/13-Zellen 14,19-21. Allerdings zeigen diese Zelllinien ungebremst Wachstum und wenig Ähnlichkeit mit gut differenzierten β-Zellen 22. Folglich wachstumsInduktionsLeistung ist minimal, unklarer Relevanz und manchmal schwer zu rekapitulieren. Eine verbesserte Strategie für die zellbasierte Screening - Linie nutzt Zellen &quot;reversibel umgewandelt&quot; , das Wachstum in Abwesenheit von Tetracyclin (Doxycyclin) -abhängigen SV40 T - Antigen - Expression 23,24 verhaftet sind. Es ist jedoch unklar, ob diese Zellen zu einer &quot;normalen&quot; β-Zell-ähnlichen Zustand auf Doxycyclin Entfernung zurück. Leider hat die Verwendung dieser Zellen verallgemeinert wachstumsfördernden Verbindungen ergab, dass offenbar nicht unmittelbaren Nutzen haben24. Insgesamt ist die Verwendung von Zell-Linien Wachstumsregulation eines Zelltyp - Anzeige von minimal spontane Replikationsaktivität zu studieren , können begrenzte Anwendbarkeit aufweisen. Die β-Zellreplikation präsentiert Screening - Plattform hierin verwendet reifen primären Ratten - β-Zellen in vivo Wachstumsregulierung in dem Maße möglich, Inselzellkulturen von gemischten Zelltyp - Zusammensetzung zu erhalten Identifizierung von Lineage-restricted wachstumsfördernden Aktivitäten zu ermöglichen, multi -well Formatierung Durchsatz und automatisierte Analyse zu maximieren Bias zu beseitigen und den Durchsatz zu erleichtern. Der erfolgreiche Einsatz dieser Plattform hat Identifizierung mehrerer Verbindungen aktiviert , die β-Zell - Replikation 25,26 fördern. Zusätzlich wurde der Test für die Struktur-Wirkungs-Beziehung Studien und chemischen epistasis Experimenten verwendet worden mechanistische Einblicke in die molekulare Regulation von β-Zell-Replikation zu ermöglichen. Die vorgestellte Plattform wurde erfolgreich angepasst for lentiviralen RNAi-basierte Untersuchung von β-Zell - Replikation Pfade 25. Einschränkungen des Tests umfassen Skalierbarkeit (Verwendung von Primärzellen) beschränkt, die Verwendung von Nagetier anstatt menschlichen Inselzellen (obwohl der Test auf menschlichen Insel Studien angepasst werden kann), Aufwendungen im Zusammenhang mit Antikörper-basierte Bildgebung und primäre Insel Nutzung, die Nutzung von dispergierten Inseln (gestört islet Architektur) automatisierten Bildaufnahme und die Abhängigkeit von der Verfügbarkeit eines automatisierten Mikroskop mit Bildaufnahme und Analysefähigkeit zu erleichtern. Obwohl eine leichte In - vivo - Screening - Methodik Genprodukte oder zur Identifizierung von Verbindungen , die β-Zell - Regeneration in situ stimulieren ideal wäre, eine solche Plattform ist noch nicht 27 zur Verfügung. Folglich ist die beschriebene Plattform geeignet für Forscher interessiert sich für die meisten Aspekte der β-Zell-Replikation zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="978">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:364px;">250g male Male Sprague Dawly Rat</td>
			<td style="width:196px;">Charles River</td>
			<td style="width:147px;">Stain # 400</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:364px;">12 cm teeth tisuue forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">11.5 cm fine scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">14.5 cm surgical scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14001-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">16 cm curved forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11003-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12 cm curved hepostat</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">13011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12 cm scalpel handle</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Tissue sieve-30 mesh</td>
			<td style="width:196px;">Bellco Glass</td>
			<td style="width:147px;">1985-85000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cizyme RI, 375,000 CDA units</td>
			<td style="width:196px;">VitaCyte</td>
			<td style="width:147px;">005-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:364px;">Hanks&#39; Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Ketamine HCl (200 mg/20 ml)</td>
			<td style="width:196px;">JHP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:147px;">NDC# 42023-113-10</td>
			<td>to make anesthetic cocktail&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Xylazine (5 g/50 ml)</td>
			<td style="width:196px;">LLOYD</td>
			<td style="width:147px;">NADA# 139-236</td>
			<td>to make anesthetic cocktail&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Histopaque 1077</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">H-1077</td>
			<td>to make histopaque 1100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Histopaque 1119</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">H-1119</td>
			<td>to make histopaque 1100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Newborn Calf Serum 500 ml</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30118.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30268.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Low Glucose&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30021.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Functionality/Viability Solution&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Mediatech</td>
			<td style="width:147px;">99-768-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">RPMI1640 media&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30096.01</td>
			<td>to make conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">804G rat bladder carcinoma cell-line</td>
			<td style="width:196px;">Available upon request</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td>to make conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">26160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">GlutaMax-I</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)&#160;</td>
			<td style="width:196px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Formamide 500 mL</td>
			<td style="width:196px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:147px;">BP227-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Antigen Unmasking Solution 250 mL (PH 6.0)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">H-3300</td>
			<td>to make 0.15 M Sodium Sitrate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Dextrose, Anhydrous</td>
			<td style="width:196px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:147px;">DX0145-1</td>
			<td>to make 1 M glucose solution</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:364px;">Nomal Donkey Serum (Powder)</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Mouse anti-human Ki67 antibody</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">556003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Goat anti-human PDX-1 antibody</td>
			<td style="width:196px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:147px;">AF2419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2016-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2014-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2011-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal chicken anti-vimentin antibody</td>
			<td style="width:196px;">abcam</td>
			<td style="width:147px;">ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">715-065-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:147px;">S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">705-025-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">706-025-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">711-025-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">706-175-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">703-175-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">S7113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Disposable Reagent Reservoir 25 mL</td>
			<td style="width:196px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:147px;">39900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">384 well, black/clear, tissue culture treated plate</td>
			<td style="width:196px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:147px;">353962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">96 well, black/clear, tissue culture treated plate</td>
			<td style="width:196px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Multi-channel pipettor</td>
			<td style="width:196px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12-channel vaccume aspirator</td>
			<td style="width:196px;">Drummond</td>
			<td style="width:147px;">3-000-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:196px;">Falcon</td>
			<td style="width:147px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Isotemp Water Bath Model 2223&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">High-content screening instrument: ArrayScan VTI</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

Zu β-Zelle oder α-Zellreplikation, eine Vierfarben-Assay-Protokoll ist erforderlich, zu beurteilen. Zuerst werden Objekte durch DAPI-Färbung (Kanal 1, 386 nm) identifiziert. Als nächstes gezählt β-Zellen (Ereignis 1): Objekte , die und peri-Kern Insulin (Kanal 3, 549 nm) PDX-1 + (2, 650 nm - Kanal) zusammen auszudrücken. Anschließend replizieren β-Zellen (Ereignis 2) gezählt: ß-Zellen (Ereignis 1) coexprimierender Ki-67 (Kanal 4, 485 nm) (Abbildung 3).</stro...

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A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Replication Discovery Platform

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Forschung

Medizin

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Chirurgische Verfahren für eine Ratte Modell Teilweise Lebertransplantation mit arteriellen Rekonstruktion

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

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Simulation von Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität:<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zwei-Neuron-Plastizität Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

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Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

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Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

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