Name: a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform
Uploaded: 2016-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃŽÂ²-cell Replication Discovery Platform at JoVE.com

This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

פרוטוקול זה בוצע בהתאם ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. הפרוטוקול המתואר ישתנה לבידוד איון משישה 250 - 300 גרם (8 - 9 שבועות ישנים) חולדות זכרים ספראג Dawley, וזה מספיק כדי להפיק 228 בארות צלחת 384 גם להערכה שכפול תאי איון. <p class="jove_title" style=";te...

<ol>
	<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes.">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li><li>Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+pathology+and+the+pathogenesis+of+type+1+and+type+2+diabetes+mellitus+revisited.">Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited.</a> Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).</li><li>Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+travails+in+islet+transplantation.">Current advances and travails in islet transplantation.</a> Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).</li><li>Nath, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+pancreas+transplants+for+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).</li><li>Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissue+sources+for+new+beta+cells.">Adult tissue sources for new beta cells.</a> Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+to+insulin+secreting+cells:+two+steps+forward+and+now+a+time+to+pause.">Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause.</a> Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Meier, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans.">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).</li><li>Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glucose+on+beta+cells+in+pancreatic+monolayer+cultures.">Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures.</a> Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).</li><li>Brelje, T. C., Sorenson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+prolactin+versus+growth+hormone+on+islet+B-cell+proliferation+in+vitro:+implications+for+pregnancy.">Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy.</a> Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF+signalling+controls+age-dependent+proliferation+in+pancreatic+beta-cells.">PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells.</a> Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+and+mammalian+target+of+rapamycin+pathways+contribute+to+DNA+synthesis,+cell+cycle+progression,+and+proliferation+in+human+islets.">Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets.</a> Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).</li><li>Metukuri, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChREBP+mediates+glucose-stimulated+pancreatic+beta-cell+proliferation.">ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation.</a> Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemical+screen+reveals+that+harmine-mediated+inhibition+of+DYRK1A+increases+human+pancreatic+beta+cell+replication.">A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication.</a> Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).</li><li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1.">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li><li>Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+replication+and+beta+cell+function+in+adenovirally-transduced+isolated+rodent+islets.">Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Walpita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+islet+cell+culture+system+for+high-throughput+screening.">A human islet cell culture system for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).</li><li>Miyazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+pancreatic+beta+cell+line+that+retains+glucose-inducible+insulin+secretion:+special+reference+to+expression+of+glucose+transporter+isoforms.">Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms.</a> Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).</li><li>Song, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+inactivation+of+glycogen+synthase+kinase+3beta+(GSK3beta)+by+dual-specificity+tyrosine+phosphorylation-regulated+kinase+1A+(Dyrk1A).">Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A).</a> J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).</li><li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K++channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion.">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).</li><li>Cozar-Castellano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+the+first+comprehensive+molecular+characterization+of+cell+cycle+control+in+rodent+insulinoma+cell+lines.">Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines.</a> Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).</li><li>Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+transformation+of+a+pancreatic+beta-cell+line+derived+from+transgenic+mice+expressing+a+tetracycline-regulated+oncogene.">Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small-molecule+inducers+of+pancreatic+beta-cell+expansion.">Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).</li><li>Annes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+kinase+inhibition+selectively+promotes+rodent+and+porcine+islet+beta-cell+replication.">Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+cAMP-modulating+medications+to+promote+beta-cell+replication.">Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication.</a> Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).</li><li>Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+screening+for+secreted+proteins+that+modulate+glucose+handling+identifies+interleukin-6+family+members+as+potent+hypoglycemic+agents.">In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents.</a> PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).</li><li>Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+ornithine+decarboxylase+in+urinary+bladder+carcinoma+cells.">In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells.</a> Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).</li><li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+IPF-1/STF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site.">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochem J. 310, 997-1003 (1995).</li><li>Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+adult+beta-cells+revealed+using+a+Pdx1/insulin+dual-reporter+lentivirus.">Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus.</a> Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).</li><li>Rieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatocyte+nuclear+factor-4alpha+initiates+cell+cycle+entry,+but+is+not+sufficient+to+promote+beta-cell+expansion+in+human+islets.">Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets.</a> Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus--advances+and+challenges+in+human+beta-cell+proliferation.">Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation.</a> Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).</li></ol>

שיטות ניסיוניות ללימוד המסלולים המולקולריים השולטים צמיחת β-cell והתחדשות הן כלים חשובים לחוקרי סוכרת. בזאת, פלטפורמת הקרנה מבוססת עכברוש-איון לזהות ולאפיין לגירוי-מולקולה הקטנה של שכפול β-cell מוצג. בעוד רוב ההיבטים של פרוטוקול זה ...

סוכרת כוללת אוסף של הפרעות שיתוף הסוף-נקודה המשותפת של הומאוסטזיס הגלוקוז שבש. למרות מנגנוני פתוגניים של תת סוכרת הם ברורים, הם חולקים תוצאה של מסת β-cell ירד, כלומר, אובדן כושר אינסולין ייצור 1,2. נכון להיום, אסטרטגיות טיפול בסוכרת לסמוך על ממשל כרוני של אינסולין אקסוגני, גירוי תרופתי של ייצור אינסולין או שיפור רגישות לאינסולין, ולעתים נדיר, השתלת איי לבלב או 3,4 לבלב כולו. למרבה הצער, הצלחת יישום אסטרטגיה זו היא קצרת מועד ו / או לא מצליח לשחזר את הפונקציה מספיק של אינסולין אנדוגני. למרות התועלת של מפתחי שיטה לעורר התחדשות β-cell, אין גישה כזו. כתוצאה מכך, מטרת מחקר הסוכר עיקרית היא לפתח שיטות כדי ליצור תאי β חדשים או להרחיב המוני β-cell אנדוגני 5 </sup&gt;. למרות התחדשות β-cell ממקורות מתחדשים כמו תאי גזע עובריים היא מתקדמת, חששות בטיחות ויעילות להפוך את המרדף של אסטרטגיות חלופיות, כולל הרחבת β-תאים בוגרים, בעדיפות 6,7. חשוב לציין כי מקור השולט של תאי-β חדש in vivo הוא-תאי β קיימים ולא ובתאים מיוחדים 8,9. למרות β-תאים נראה שיש יכולת שכפולה מוגבלת, עלייה קטנה במסת β-cell (~ 30%) עשויים להיות מספיק כדי לשחזר הומאוסטזיס הגלוקוז אצל חולי סוכרת רבה. יתר על כן, בגירוי תרופתי באתרו של המוני β-cell אסטרטגיית טיפול זול וניתן להרחבה פוטנציאלי. בזאת שיטה גבוה הקרנת תוכן לזיהוי ואפיון מולקולות קטנות המעודדות צמיחת β-cell מוצגת. מגוון שיטות במבחנה ניסיונית עשוי לשמש לזיהוי מוצרי גן ו / או מולקולות that לקדם שכפול β-תא ראשוני. מאמצים מוקדמים למדידת שטף שכפול תאי β בשימוש תרבות pancreata מכרסמים עוברים או תרבויות איון מבודד ללא פגע למדוד [3 ח] התאגדות thymidine, התאגדות BrdU או גופי mitotic בתוך האוכלוסייה מוכתמת אלדהיד-thionine או אינסולין בתגובה לתנאי טיפול ספציפי 10, 11. גישות במבחנה אלה הגירסות וקרובות יש ממנו מספר מגבלות. ליקויים בולטים כוללים (1) שימוש בתאי עובר אשר, בניגוד β-תאים בוגרים, להציג קצב שכפול β-תאי בסיס גבוה והם צמיחה מוסדרת באופן מובהק 12; (2) אופי סובייקטיבי שפיטה הנסיין תלויות אירועים שכפולים β-cell; (3) את העבודה וזמן הטבע אינטנסיבי של ספירת הנסיין תלוי אירועים שכפולים β-cell מפגר תפוקה ניסיון; (4) שימוש התאגדות / כתם / מראה גרעיני לזהות שכפול אפילוts וכתם ציטופלסמית שאינה חופף לזהות β-תאים מובילים misattribution של אירועים שכפולים שאינו β-cell בסמוך בטאו תאים. לאחרונה β-תאים ראשוניים בוגרים שמשו להעריך את ההשפעה של transgene יתר הביטוי כמו גם טיפול מוצר או תרכובת גן על שכפול β-cell 13-16. עם זאת, מחקרים אלה גם יש לסמוך על ספירת סובייקטיבית של אירועים שכפול, cytoplasmic staining- או שאינו ספציפי שיטות לזיהוי β-cell ו / או צעדים עתירי עבודה כי להגביל את התפוקה, למשל, ציפוי שקופית היטב פרט של תאים או איון שלם הטבעת פרפין ועיבוד 17. יש לציין, מתודולוגיה הקרנה שכפולה β-תאים אנושיים מבוסס תמונה, דומה לזו המוצגת כאן, כבר פורסמה 18; עם זאת, שימוש מוצלח של assay זה לא הודגם ושימוש איי אדם להקרנה עיקרית לא יכול להיות רחב FEAsible. אסטרטגיה חלופית לזיהוי חומרים לקידום שכפול היא להעריך אינדוקציה הצמיחה של קווי β-cell. מאמצים ראשוניים המשמשים β-cell-קווי טרנספורמציה כגון min6 תאים או INS 832/13-תאי 14,19-21. עם זאת,-שורות תאים אלה להפגין צמיחה רסן לשאת מעט דמיון β-תאים מובחנים היטב 22. כתוצאה מכך, יכולת צמיחת אינדוקציה היא מינימאלית, של רלוונטיות ברורות ולפעמים קשה לשחזר. אסטרטגיה משופרת להקרנה מבוססת שורת תאים מנצלת &quot;טרנספורמציה הפיך&quot; תאים הנמצאים עצירת גדילה בהעדר טטרציקלין (דוקסיציקלין) ביטוי אנטיגן התלוי SV40 T 23,24. עם זאת, לא ברור אם תאים אלה לחזור למצב &quot;נורמלי&quot; β-דמוי תא עם הסרת דוקסיציקלין. למרבה הצער, שימוש בתאים אלה הניב תרכובות מקדמת גדילה כללית כי לא נראה שיש שתועלת מיידית24. באופן כללי, השימוש-שורות תאים ללמוד ויסות צמיחה של תאים מסוג מוצגים פעילות שכפולה ספונטנית מינימאלית עשוי להיות תחולה מוגבלת. פלטפורמת ההקרנה שהכפולה β-cell המוצגת כאן מנצלת עכברוש העיקרי בוגרים β-תאים לשמר ברגולציה של צמיחת vivo במידת ההאפשר, תרבויות תאי איון של רכב תא מסוג מעורב כדי לאפשר זיהוי של פעילויות לקידום צמיחה מוגבלת שושלת, רבה &quot;טוב עיצוב על מנת למקסם את תפוקת ניתוח אוטומטי לחסל הטיה ולהקל תפוקה. שימוש מוצלח של פלטפורמה זו אפשר זיהוי של מספר תרכובות המקדמות שכפול β-cell 25,26. בנוסף, assay שמש במשך מחקרי יחסי מבנה-פעילות וניסויי epistasis כימיים לספק תובנות מכניסטית לתוך תקנה המולקולרי של שכפול β-cell. הפלטפורמה הציג הותאמה בהצלחה FOr lentiviral RNAi מבוסס חקירת שכפול β-cell מסלולי 25. מגבלות של assay כוללות מוגבלות מדרגיות (שימוש של תאים ראשוניים), שימוש מכרסם ולא-תאי איון אדם (אם כי assay יכול להיות מותאם עבור מחקרי איון אדם), הוצאות הקשורות הדמיה מבוססת נוגדן ושימוש איון עיקרי, השימוש איים מפוזרים (אדריכלות איון שבש) כדי להקל על רכישה ותלות תמונה אוטומטיות על הזמינות של מיקרוסקופ אוטומטית עם רכישת תמונה ויכולת ניתוח. למרות מתודולוגיה הקרנה הקלילה in vivo לזיהוי מוצרי גנים או תרכובות מעודדי התחדשות β-cell באתרו תהיה אידיאלית, פלטפורמת דוגמת אינה זמינה עדיין 27. כתוצאה מכך, הפלטפורמה תארה מתאימה חוקר מעוניין לחקור את רוב ההיבטים של שכפול β-cell.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="978">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:364px;">250g male Male Sprague Dawly Rat</td>
			<td style="width:196px;">Charles River</td>
			<td style="width:147px;">Stain # 400</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:364px;">12 cm teeth tisuue forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">11.5 cm fine scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">14.5 cm surgical scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14001-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">16 cm curved forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11003-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12 cm curved hepostat</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">13011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12 cm scalpel handle</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Tissue sieve-30 mesh</td>
			<td style="width:196px;">Bellco Glass</td>
			<td style="width:147px;">1985-85000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cizyme RI, 375,000 CDA units</td>
			<td style="width:196px;">VitaCyte</td>
			<td style="width:147px;">005-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:364px;">Hanks&#39; Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Ketamine HCl (200 mg/20 ml)</td>
			<td style="width:196px;">JHP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:147px;">NDC# 42023-113-10</td>
			<td>to make anesthetic cocktail&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Xylazine (5 g/50 ml)</td>
			<td style="width:196px;">LLOYD</td>
			<td style="width:147px;">NADA# 139-236</td>
			<td>to make anesthetic cocktail&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Histopaque 1077</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">H-1077</td>
			<td>to make histopaque 1100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Histopaque 1119</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">H-1119</td>
			<td>to make histopaque 1100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Newborn Calf Serum 500 ml</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30118.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30268.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Low Glucose&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30021.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Functionality/Viability Solution&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Mediatech</td>
			<td style="width:147px;">99-768-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">RPMI1640 media&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30096.01</td>
			<td>to make conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">804G rat bladder carcinoma cell-line</td>
			<td style="width:196px;">Available upon request</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td>to make conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">26160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">GlutaMax-I</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)&#160;</td>
			<td style="width:196px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Formamide 500 mL</td>
			<td style="width:196px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:147px;">BP227-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Antigen Unmasking Solution 250 mL (PH 6.0)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">H-3300</td>
			<td>to make 0.15 M Sodium Sitrate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Dextrose, Anhydrous</td>
			<td style="width:196px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:147px;">DX0145-1</td>
			<td>to make 1 M glucose solution</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:364px;">Nomal Donkey Serum (Powder)</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Mouse anti-human Ki67 antibody</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">556003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Goat anti-human PDX-1 antibody</td>
			<td style="width:196px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:147px;">AF2419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2016-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2014-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2011-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal chicken anti-vimentin antibody</td>
			<td style="width:196px;">abcam</td>
			<td style="width:147px;">ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">715-065-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:147px;">S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">705-025-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">706-025-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">711-025-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">706-175-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">703-175-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">S7113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Disposable Reagent Reservoir 25 mL</td>
			<td style="width:196px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:147px;">39900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">384 well, black/clear, tissue culture treated plate</td>
			<td style="width:196px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:147px;">353962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">96 well, black/clear, tissue culture treated plate</td>
			<td style="width:196px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Multi-channel pipettor</td>
			<td style="width:196px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12-channel vaccume aspirator</td>
			<td style="width:196px;">Drummond</td>
			<td style="width:147px;">3-000-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:196px;">Falcon</td>
			<td style="width:147px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Isotemp Water Bath Model 2223&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">High-content screening instrument: ArrayScan VTI</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

כדי להעריך β-cell או שכפול תאי α, פרוטוקול assay בארבעת צבעים נדרשים. ראשית, אובייקטים מזוהים על ידי מכתים DAPI (ערוץ 1, 386 ננומטר). לאחר מכן, β-תאי (אירוע 1) נספרים: יצירות כי שיתוף להביע PDX-1 + (ערוץ 2, 650 ננומטר) ואינסולין פרי-גרעיני (ערוץ 3, 549 ננומטר). בהמשך לכ...

Watch this Scientific Journal Video about A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃŽÂ²-cell Replication Discovery Platform at JoVE.com

A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Replication Discovery Platform

אתגרים קריטיים לתחום מחקר הסוכר מעוניינים להבין את המנגנונים המולקולריים מווסת שכפול β-cell איון לפתח שיטות מגרה התחדשות תאי β. בזאת שיטה גבוהה ההקרנה תוכן לזהות ולהעריך את הפעילות β-cell לקידום שכפול של מולקולות קטנות מוצג.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

הקרנת תוכן גבוהה במחלות ניווניות

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

ניתוחים למודל חולדה של השתלה כבדה orthotopic חלקית עם שחזור עורקית כבדיה

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

הדמיית הלבלב Neuroplasticity:<em&gt; במבחנה</em&gt; Dual-נוירון פלסטיות Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma mRCC in Mice Following Nephrectomy

Nephrectomy דוגמנות קרצינומה ספונטני גרורתי של תאי כליות (mRCC) בעכברים בעקבות

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

לייזר דופלר: כלי למדידת הלבלב איון Microvascular Vasomotion In Vivo

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

יישום של End-to-end השקה ב Pancreatectomy המרכזית רובוטית

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...