Name: a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform
Uploaded: 2016-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃŽÂ²-cell Replication Discovery Platform at JoVE.com

This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

Detta protokoll genomfördes i enlighet med Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Stanford University School of Medicine. Den beskrivna protokollet skalas för ö-isolering från sex 250-300 g (8 - 9 veckor gamla) Sprague Dawley-hanråttor, som är tillräcklig för att alstra 228 brunnar i en 384-brunnsplatta för ö-cellreplikation bedömning. 1. Material Beredning <ol><li> Förbereda beläggningsmedier före initiering holmen isolering genom uppsamling av konditionerade m...

<ol>
	<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes.">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li><li>Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+pathology+and+the+pathogenesis+of+type+1+and+type+2+diabetes+mellitus+revisited.">Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited.</a> Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).</li><li>Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+travails+in+islet+transplantation.">Current advances and travails in islet transplantation.</a> Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).</li><li>Nath, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+pancreas+transplants+for+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).</li><li>Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissue+sources+for+new+beta+cells.">Adult tissue sources for new beta cells.</a> Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+to+insulin+secreting+cells:+two+steps+forward+and+now+a+time+to+pause.">Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause.</a> Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Meier, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans.">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).</li><li>Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glucose+on+beta+cells+in+pancreatic+monolayer+cultures.">Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures.</a> Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).</li><li>Brelje, T. C., Sorenson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+prolactin+versus+growth+hormone+on+islet+B-cell+proliferation+in+vitro:+implications+for+pregnancy.">Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy.</a> Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF+signalling+controls+age-dependent+proliferation+in+pancreatic+beta-cells.">PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells.</a> Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+and+mammalian+target+of+rapamycin+pathways+contribute+to+DNA+synthesis,+cell+cycle+progression,+and+proliferation+in+human+islets.">Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets.</a> Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).</li><li>Metukuri, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChREBP+mediates+glucose-stimulated+pancreatic+beta-cell+proliferation.">ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation.</a> Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemical+screen+reveals+that+harmine-mediated+inhibition+of+DYRK1A+increases+human+pancreatic+beta+cell+replication.">A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication.</a> Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).</li><li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1.">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li><li>Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+replication+and+beta+cell+function+in+adenovirally-transduced+isolated+rodent+islets.">Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Walpita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+islet+cell+culture+system+for+high-throughput+screening.">A human islet cell culture system for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).</li><li>Miyazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+pancreatic+beta+cell+line+that+retains+glucose-inducible+insulin+secretion:+special+reference+to+expression+of+glucose+transporter+isoforms.">Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms.</a> Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).</li><li>Song, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+inactivation+of+glycogen+synthase+kinase+3beta+(GSK3beta)+by+dual-specificity+tyrosine+phosphorylation-regulated+kinase+1A+(Dyrk1A).">Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A).</a> J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).</li><li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K++channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion.">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).</li><li>Cozar-Castellano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+the+first+comprehensive+molecular+characterization+of+cell+cycle+control+in+rodent+insulinoma+cell+lines.">Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines.</a> Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).</li><li>Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+transformation+of+a+pancreatic+beta-cell+line+derived+from+transgenic+mice+expressing+a+tetracycline-regulated+oncogene.">Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small-molecule+inducers+of+pancreatic+beta-cell+expansion.">Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).</li><li>Annes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+kinase+inhibition+selectively+promotes+rodent+and+porcine+islet+beta-cell+replication.">Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+cAMP-modulating+medications+to+promote+beta-cell+replication.">Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication.</a> Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).</li><li>Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+screening+for+secreted+proteins+that+modulate+glucose+handling+identifies+interleukin-6+family+members+as+potent+hypoglycemic+agents.">In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents.</a> PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).</li><li>Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+ornithine+decarboxylase+in+urinary+bladder+carcinoma+cells.">In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells.</a> Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).</li><li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+IPF-1/STF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site.">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochem J. 310, 997-1003 (1995).</li><li>Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+adult+beta-cells+revealed+using+a+Pdx1/insulin+dual-reporter+lentivirus.">Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus.</a> Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).</li><li>Rieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatocyte+nuclear+factor-4alpha+initiates+cell+cycle+entry,+but+is+not+sufficient+to+promote+beta-cell+expansion+in+human+islets.">Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets.</a> Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus--advances+and+challenges+in+human+beta-cell+proliferation.">Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation.</a> Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).</li></ol>

Experimentella metoder för att studera de molekylära vägar som kontrollerar β-celltillväxt och förnyelse är viktiga verktyg för diabetesforskare. Häri till en råtta-ö-baserad screening plattform identifiera och karakterisera småmolekylära stimulatorer av β-cellreplikation presenteras. Medan de flesta aspekterna av detta protokoll är lätt utföras av erfarna forskare, bara några steg kräver särskild teknik. Först under holme isolering, kanyle av galla-kanal utan att störa...

Diabetes omfattar en samling av sjukdomar som delar den gemensamma slutpunkten av sönder glukoshomeostas. Även de patogena mekanismerna för diabetes subtyper är olika, de delar en följd av minskad β-cellmassan, det vill säga förlust av insulinproduktionen kapacitet 1,2. För närvarande diabetes behandlingsstrategier lita på kronisk administrering av exogent insulin, farmakologisk stimulering av produktion eller förstärkning av insulininsulinkänslighet, och sällan, transplantation av pankreasöar eller hela bukspottkörteln 3,4. Tyvärr, är framgången för dessa strategier kortlivad och / eller underlåter att tillräckligt rekapitulera funktionen av insulinproduktion. Trots användbarheten av att utveckla en metod för att stimulera β-cellförnyelsen, existerar inget sådant tillvägagångssätt. Följaktligen är en stor diabetesforskningen mål att utveckla metoder för att generera nya p-celler eller att expandera endogen β-cellmassan 5 </sup&gt;. Även β-cellförnyelsen från förnybara källor som embryonala stamceller går framåt, säkerhet och effektivitetsproblem gör jakten på alternativa strategier, inklusive expansion av mogna p-celler, en prioritet 6,7. Viktigt är den dominerande källan till nya p-celler in vivo redan existerande p-celler snarare än specialiserade progenitorceller 8,9. Även p-celler verkar ha begränsad replikering kapacitet, en liten ökning av β-cellmassan (~ 30%) kan vara tillräcklig för att återställa glukoshomeostas i många diabetiker. Vidare in situ farmakologisk stimulering av β-cellmassan är en potentiellt billig och skalbar behandlingsstrategi. Häri en hög halt screening metod för att identifiera och karakterisera små molekyler som stimulerar β-celltillväxt presenteras. Ett flertal in vitro experimentella metoder kan användas för att identifiera genprodukter och / eller molekyler that främja primär β-cellreplikation. Tidiga insatser för att mäta β-cellreplikation induktion används foster gnagare pancreata kultur eller intakta isolerade ö kulturer för att mäta [3 H] tymidininkorporering, BrdU inkorporering eller mitotiska kroppar i aldehyd-tionin eller insulin färgade befolkningen i svar på specifika behandlingsförhållanden 10, 11. Dessa in vitro metoder och nära varianter därav har flera begränsningar. Framstående brister inkluderar (1) användningen av fosterceller som till skillnad från mogna p-celler, visar en hög basal β-cellreplikation hastighet och är tillväxt regleras på ett tydligt sätt 12; (2) den subjektiva karaktär försöksberoende prövning av β-cellreplikeringshändelser; (3) arbets- och tidskrävande karaktär försöksberoende räkning av β-cellreplikeringshändelser fördröjer experimentell genomströmning; (4) användning av kärn inkorporering / bets / utseende för att identifiera replikering ävents och en icke-överlappande cytoplasmatisk fläck för att identifiera p-celler leder till felattribueringen av närbelägna icke-β-cellreplikeringshändelser till p-celler. På senare tid mogna primära p-celler har använts för att bedöma effekten av transgen överuttryck samt genprodukt eller förening behandling på β-cellreplikation 13-16. Emellertid har dessa studier också åberopas subjektivt räkning av replikeringshändelser, cytoplasmiskt staining- eller icke-specifika metoder för identifiering β-cell och / eller arbetsintensiva steg som begränsar genomströmningen, t.ex. individuell glid väl plätering av celler eller intakta ö paraffininbäddning och bearbetning 17. Notably, en bildbaserad human β-cellreplikation screening metodologi, som liknar den som presenteras häri, har publicerat 18; har dock framgångsrik användning av denna analys inte påvisats och användningen av humana öar för primär screening kan inte vara i stort sett FEAligt. En alternativ strategi för att identifiera replikationsbefrämjande substanser är att bedöma tillväxt induktion av β-cellinjer. Initiala ansträngningar används transformerade p-cellinjer såsom MIN6 celler eller INS 832/13-celler 14,19-21. Dessa cellinjer visar ohämmad tillväxt och bär föga likhet med väl differentierade p-celler 22. Följaktligen är tillväxtinduktionskapacitet minimal, av oklar relevans och ibland svårt att sammanfatta. En förbättrad strategi för cellinje baserad screening utnyttjar &quot;reversibelt omvandlas&quot; celler som tillväxt greps i frånvaro av tetracyklin (doxycyklin) -beroende SV40 T-antigen uttryck 23,24. Det är dock oklart om dessa celler återgår till en &quot;normal&quot; β-cell-liknande tillstånd vid doxycyklin bort. Tyvärr har användningen av dessa celler gav generaliserade tillväxtbefrämjande föreningar som inte verkar ha omedelbar nytta24. Sammanfattningsvis kan användningen av cellinjer för att studera tillväxtreglering av en celltyp som visar minimal spontan replikering aktivitet har begränsad användbarhet. Den β-cellreplikation screening plattform presenteras här utnyttjar mogna primära rått p-celler att behålla in vivo tillväxtreglering i möjligaste mån, ö-cellkulturer av blandad celltyp komposition för att möjliggöra identifiering av linjebegränsade tillväxtbefrämjande aktiviteter, multi -Ja formatering för att maximera genomströmningen och automatiserad analys för att eliminera fördomar och underlätta genomströmningen. Framgångsrik användning av denna plattform har möjliggjort identifiering av flera föreningar som främjar β-cellreplikation 25,26. Dessutom har analysen använts för struktur-aktivitetssamband studier och kemiska epistasis experiment för att tillhandahålla mekanistiska insikter i den molekylära regleringen av β-cellreplikation. De presenterade plattformen framgångsrikt anpassat for Lentiviral RNAi-baserad undersökning av β-cellreplikation vägar 25. Begränsningar av analysen inkluderar begränsad skalbarhet (användning av primärceller), användning av gnagare snarare än mänskliga ö-celler (även om analysen kan anpassas för mänskliga ö studier), kostnader i samband med antikroppsbaserad avbildning och primär ö, användning av spridda öar (störs holme arkitektur) för att underlätta automatiserad bildtagning och beroende av tillgången på ett automatiserat mikroskop med bildtagning och analyskapacitet. Även om en enkel in vivo screening metod för att identifiera genprodukter eller föreningar som stimulerar β-cellförnyelsen in situ skulle vara perfekt, är en sådan plattform ännu inte tillgängliga 27. Följaktligen är lämpligt för forskare intresserade av att undersöka de flesta aspekterna av β-cellreplikation den beskrivna plattformen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="978">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:364px;">250g male Male Sprague Dawly Rat</td>
			<td style="width:196px;">Charles River</td>
			<td style="width:147px;">Stain # 400</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:364px;">12 cm teeth tisuue forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">11.5 cm fine scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">14.5 cm surgical scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14001-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">16 cm curved forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11003-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12 cm curved hepostat</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">13011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12 cm scalpel handle</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Tissue sieve-30 mesh</td>
			<td style="width:196px;">Bellco Glass</td>
			<td style="width:147px;">1985-85000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cizyme RI, 375,000 CDA units</td>
			<td style="width:196px;">VitaCyte</td>
			<td style="width:147px;">005-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:364px;">Hanks&#39; Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Ketamine HCl (200 mg/20 ml)</td>
			<td style="width:196px;">JHP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:147px;">NDC# 42023-113-10</td>
			<td>to make anesthetic cocktail&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Xylazine (5 g/50 ml)</td>
			<td style="width:196px;">LLOYD</td>
			<td style="width:147px;">NADA# 139-236</td>
			<td>to make anesthetic cocktail&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Histopaque 1077</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">H-1077</td>
			<td>to make histopaque 1100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Histopaque 1119</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">H-1119</td>
			<td>to make histopaque 1100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Newborn Calf Serum 500 ml</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30118.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30268.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Low Glucose&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30021.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Functionality/Viability Solution&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Mediatech</td>
			<td style="width:147px;">99-768-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">RPMI1640 media&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30096.01</td>
			<td>to make conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">804G rat bladder carcinoma cell-line</td>
			<td style="width:196px;">Available upon request</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td>to make conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">26160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">GlutaMax-I</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)&#160;</td>
			<td style="width:196px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Formamide 500 mL</td>
			<td style="width:196px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:147px;">BP227-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Antigen Unmasking Solution 250 mL (PH 6.0)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">H-3300</td>
			<td>to make 0.15 M Sodium Sitrate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Dextrose, Anhydrous</td>
			<td style="width:196px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:147px;">DX0145-1</td>
			<td>to make 1 M glucose solution</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:364px;">Nomal Donkey Serum (Powder)</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Mouse anti-human Ki67 antibody</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">556003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Goat anti-human PDX-1 antibody</td>
			<td style="width:196px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:147px;">AF2419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2016-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2014-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2011-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal chicken anti-vimentin antibody</td>
			<td style="width:196px;">abcam</td>
			<td style="width:147px;">ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">715-065-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:147px;">S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">705-025-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">706-025-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">711-025-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">706-175-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">703-175-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">S7113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Disposable Reagent Reservoir 25 mL</td>
			<td style="width:196px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:147px;">39900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">384 well, black/clear, tissue culture treated plate</td>
			<td style="width:196px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:147px;">353962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">96 well, black/clear, tissue culture treated plate</td>
			<td style="width:196px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Multi-channel pipettor</td>
			<td style="width:196px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12-channel vaccume aspirator</td>
			<td style="width:196px;">Drummond</td>
			<td style="width:147px;">3-000-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:196px;">Falcon</td>
			<td style="width:147px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Isotemp Water Bath Model 2223&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">High-content screening instrument: ArrayScan VTI</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

Att bedöma β-cell eller α-cellreplikation, är en fyra-färganalysprotokoll erfordras. Först objekt identifieras med DAPI färgning (Kanal 1, 386 nm). Därefter p-celler (händelse 1) räknade: objekt som samuttrycker PDX-1 + (kanal 2, 650 nm) och peri-nukleär insulin (kanal 3, 549 nm). Därefter replikerande p-celler (händelse 2) räknas: p-celler (händelse 1) som co-express Ki-67 (kanal 4, 485 nm) (Figur 3). Den procentuella andelen av replikerande p-...

Watch this Scientific Journal Video about A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃŽÂ²-cell Replication Discovery Platform at JoVE.com

A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Replication Discovery Platform

Kritiska utmaningar för diabetesforskningen fältet är att förstå de molekylära mekanismer som reglerar ö β-cellreplikation och för att utveckla metoder för att stimulera β-cellförnyelsen. Häri en hög halt screening metod för att identifiera och bedöma β-cellreplikation främjande aktivitet av små molekyler presenteras.

En hög halt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cell replikering Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

En metod för Murine Islet Isolering och subkapsulär Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Hög halt Screening vid neurodegenerativa sjukdomar

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Kirurgiska ingrepp för en råttmodell av partiella ortotop levertransplantation med nedsatt arteriell rekonstruktion

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Simula Pancreatic Neuroplasticity:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neuron Plasticity analys

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxisk Stimulering av Brain Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Modell av stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma mRCC in Mice Following Nephrectomy

Modellering Spontan metastaserad njurcellscancer (MRCC) i möss efter Nefrektomi

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Musmodell av typ 2-diabetes: Pancreatic Islet Isolering och Live-cell 2-Photon Imaging av intakt cellöar

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: Ett verktyg för att mäta bukspottskörteln Islet mikrovaskulära Vasomotion In Vivo

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Tillämpningen av End-to-end anastomos i Robotic centrala Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...