Name: a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

1. إنشاء الثقافات خلية تعليق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير السائل BY-2 وسائل الاعلام من خلال إضافة 4،43 ز Linsmaier وسكوغ وسائل الإعلام بصل، 30 غرام من السكروز، 200 ملغ KH 2 PO 4، و 200 ميكروغرام من 2،4-ثنائي كلورو فينوكسياسيتين حمض (2،4-D) إلى 900 مل م...

وقد تم التحقق من صحة بروتوكول المذكورة أعلاه بنجاح لعزل البروتوبلازم، والعد، والتحول باستخدام التبغ زراعة الخلايا تعليق BY-2. ومع ذلك، يمكن بسهولة تمديد بروتوكول لأي ثقافة تعليق النبات. في الوقت الحاضر، وقد تم تحقيق العزلة والتحول البروتوبلازم في محطات عديدة، بما في ...

في السنوات الأخيرة كان هناك زخم كبير وضعت على تصميم المحاصيل المعدلة وراثيا للتغلب على الأمراض المختلفة 1، منح مقاومة مبيدات الأعشاب 2، منح الجفاف 3،4 والتسامح الملح 5، ومنع الحيوانات العاشبة 6، وزيادة العائد الكتلة الحيوية 7، وتقليل جدار الخلية عناد 8. وقد ساعد هذا الاتجاه من خلال تطوير أدوات جزيئية جديدة لتوليد النباتات المعدلة وراثيا، بما في ذلك الجينوم التحرير باستخدام كريسبر وTALENs 9، والجينات إسكات من خلال الرنا المزدوج الجديلة 10، ميرنا 11، وسيرنا 12. في حين أن هذه التقنيات وتبسيط جيل من النباتات المعدلة وراثيا، أنها خلقت أيضا عنق الزجاجة، حيث ولدت العدد الهائل من النباتات المعدلة وراثيا لا يمكن عرضه باستخدام الأنظمة التقليدية التي تعتمد على تجديد مصنع. تتعلق هذه العقبة، في حين إسكات ويبني الجينوم التحرير يمكن إدراج بسرعة إلى النباتات، والعديد منفشلت الصفات التي تستهدف إحداث التأثير المطلوب، والتي غالبا ما تكون غير المكتشفة حتى يتم تحليل النباتات في الدفيئة. في هذا العمل، وقد وضعنا طريقة لسريع وتلقائي وفحص عالية الإنتاجية من جبلة مجردة النبات، وعلى وجه التحديد لمعالجة عنق الزجاجة الحالي في الفحص المبكر أعداد كبيرة من الجينوم التحرير والجينات إسكات الأهداف. استخدام جبلة مجردة، بدلا من الخلايا النباتية سليمة، لديها العديد من المزايا للتطوير منصة الآلي. أولا، يتم عزل جبلة مجردة بعد هضم جدار الخلية النباتية، ومع هذا الحاجز لم تعد موجودة، وزيادة كفاءة تحويل 13. في الخلايا النباتية سليمة لا يوجد سوى اثنين أساليب راسخة للتحول، biolistics 14 و الأجرعية التحول بوساطة 15. أيا من هذه الأساليب يمكن ترجمتها بسهولة إلى منصات المعالجة السائلة، كما biolistics يتطلب معدات متخصصة لtransformation، في حين الأجرعية التحول بوساطة يتطلب ثقافة مشتركة وإزالة اللاحقة من البكتيريا. ولا هي قابلة لأساليب إنتاجية عالية. في حالة جبلة مجردة، يجري التحول بشكل روتيني باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) ترنسفكأيشن بوساطة 16، والتي تتطلب فقط عدة بورصات حل، ويعتبر مثاليا لمنصات المعالجة السائلة. ثانيا، جبلة مجردة، بحكم التعريف، هي ثقافات وحيدة الخلية، وبالتالي فإن المشاكل المرتبطة تشكيل تكتل وسلسلة في مزارع الخلايا النباتية، وليس لوحظ في جبلة مجردة. من حيث الفحص السريع باستخدام مقياس الطيف الضوئي، القائم على لوحة تكتل من الخلايا أو الخلايا في الطائرات متعددة سوف يؤدي إلى صعوبة في الحصول على قياسات متناسقة. منذ جبلة مجردة هي أيضا الأكثر كثافة من وسائل الاعلام ثقافتهم، والرواسب في قاع الآبار، وتشكيل أحادي الطبقة، والتي تفضي للالطيفي القائم على طبق من ذهب. وأخيرا، في حين أن الثقافات تعليق خلية النبات PRIMARالمستمدة إيلي من الكالس 17، جبلة مجردة يمكن حصاده من عدد من الأنسجة النباتية، مما يؤدي إلى القدرة على تحديد التعبير الأنسجة محددة. على سبيل المثال، القدرة على تحليل root- أو التعبير عن ورقة محددة من الجينات يمكن أن تكون هامة جدا للتنبؤ النمط الظاهري. لهذه الأسباب، ولم يتم التحقق من البروتوكولات وضعت في هذا العمل باستخدام جبلة مجردة معزولة عن التبغ تستخدم على نطاق واسع (النيكوتين تبغ L.) &quot;برايت صفراء &#39;2 (BY-2) ثقافة تعليق. وقد وصفت ثقافة تعليق BY-2 باعتبارها الخلية &quot;هيلا&quot; من النباتات العليا، وذلك بسبب استخدام كل مكان في التحليل الجزيئي للخلايا النبات 18. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت خلايا BY-2 لدراسة الآثار المترتبة على مصنع الضغوطات 19-22، داخل الخلايا البروتين توطين 23،24، وبيولوجيا الخلية الأساسية 25-27 يدل على فائدة واسعة من هذه الثقافات في بيولوجيا النبات. ميزة إضافية لBY-2 الثقافات هيالقدرة على مزامنة مع الثقافات aphidicolin، والتي يمكن أن تؤدي إلى تعزيز استنساخ للتعبير الجين دراسات 28. وعلاوة على ذلك، تم تطوير طرق لاستخراج BY-2 جبلة مجردة باستخدام أنزيمات منخفضة التكلفة 29،30، والإنزيمات التي تستخدم عادة لتوليد جبلة مجردة باهظة لأنظمة عالية الإنتاجية من حيث التكلفة. على هذا النحو، وقد تم التحقق من صحة البروتوكول هو موضح أدناه باستخدام ثقافة تعليق BY-2، ولكن يجب أن تكون قابلة للتعديل إلى أي ثقافة مصنع التعليق الخلية. وتجرى التجارب إثبات صحة مفهوم باستخدام البرتقال البروتين مضان (النفط مقابل الغذاء) مراسل الجين (pporRFP) من Porites المرجانية الصلبة porites 31 تحت سيطرة المروج CAMV 35S.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Orbitor RS Microplate mover</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Bravo Liquid Handler</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Synergy H1 Multi-mode Reader</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Teleshake</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>3800048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CPAC Ultraflat Heater/cooler</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>7000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Vworks Automation Software</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:255px;">Momentum Software</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Liquid Handling Control 2.17 Software</td>
			<td style="width:157px;">Biotek</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Zyla 3-Tap microscope camera</td>
			<td style="width:157px;">Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">ET-CY3/TRITC Filter Set</td>
			<td style="width:157px;">Chroma Technology Corp</td>
			<td>49004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohament CL</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost cellulase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect UF</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect 10L</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase/arabinase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Linsmaier &#38; Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">L689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2,4 dichlorophenoxyacetic acid</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">D295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Poly (ethylene glycol) 4000</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">95904-250G-F</td>
			<td>Formerly Fluka PEG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">25535-16-4</td>
			<td>Acros Organics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaCl2</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C7902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Mannitol</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC424205000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KOH</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Gelzan CM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">G1910-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">103184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96-well 1.2 ml deep well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AB-0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96 well optical bottom plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">9405 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">NaCl</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KCl</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MES</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC17259-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MgCl2</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

على مدى العقد الماضي كان هناك تجدد في استخدام جبلة مجردة النباتية التي تتراوح بين الأنواع نموذج لاقتصاص أنواع، لتحليل مسارات نقل الإشارة والشبكات التنظيمية النسخي، التعبير الجيني، الجينوم التحرير، والجينات إسكات. وعلاوة على ذلك، تم إحراز تقدم كبير في تجديد النباتات من جبلة مجردة، التي ولدت المزيد من الاهتمام في استخدام هذه النظم لعلم الجينوم المصنع. في هذا العمل، وقد تم وضع بروتوكول لأتمتة العزلة البروتوبلازم والتحول من 2 (BY-2) ثقافة تعليق التبغ &quot;الأصفر الساطع&quot; باستخدام منصة الروبوتية. تم التحقق من صحة إجراءات التحول باستخدام البرتقال ببروتين (النفط مقابل الغذاء) مراسل الجين (pporRFP) تحت سيطرة المروج القرنبيط فيروس تبرقش 35S (35S). وأكد التعبير النفط مقابل الغذاء في جبلة مجردة بواسطة المجهر epifluorescence. شملت التحليلات أيضا الأساليب كفاءة الإنتاج البروتوبلازم باستخدام propidiuم يوديد. وأخيرا، تم استخدام منخفضة التكلفة الإنزيمات للمأكولات لإجراء البروتوبلازم العزلة، التحايل على الحاجة إلى مختبر الصف الانزيمات التي هي في الإنتاجية العالية الآلي العزلة البروتوبلازم وتحليل باهظة التكلفة. على أساس بروتوكول المتقدمة في هذا العمل، ويمكن إجراء الإجراء الكامل من العزلة البروتوبلازم إلى تحول في أقل من 4 ساعات، من دون أي مساهمة من المشغل. في حين تم التحقق من صحة بروتوكول المتقدمة في هذا العمل مع ثقافة الخلية BY-2، وينبغي أن تكون الإجراءات والأساليب للترجمة إلى أي ثقافة تعليق مصنع / نظام بروتوبلازمي، والتي ينبغي تمكين تسريع الأبحاث الجينومية المحاصيل.

في الدراسة الحالية، فإن معدل مضاعفة BY-2 تباينت 14-18 ساعة تعتمد على درجة الحرارة التي حضنت الثقافات، بما يتفق مع التقارير السابقة لطول دورة الخلية متوسط ​​من 15 ساعة. مع هذا المعدل مضاعفة، 1: تم استخدام 100 ابتداء من اللقاح لبدء الثقافات، مما يؤدي إلى الث...

Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

يوصف منهجية الإنتاجية العالية، الآلي، إنتاج البروتوبلازم التبغ والتحول. النظام الآلي يمكن التعبير الجيني الموازي واسع والاكتشاف في نظام نموذجي BY-2 التي ينبغي أن تكون للترجمة للمحاصيل غير النموذجية.

ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

اضطرابات في الدورة الدموية miRNAs في متلازمة القولون العصبي التي تم اكتشافها باستخدام تعدد الإنتاجية العالية منصة التعبير الجيني

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

عالية الإنتاجية آليا عزل بمساعدة من درجة الحرارة التي تراعي القاتلة المسوخ في<em&gt; كلاميدوموناس reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في Melanogaster المورفولوجية

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: عالية إنتاجية على أساس تسلسل تقنية لتحديد تكرار متأخر مناطق الجينوم

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

تحديد تركيبات المخدرات التآزر بواسطة الأسلوب2 تداخل الفائق

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

عالية الإنتاجية الحمض النووي بلازميد تعدد الإرسال والتحويل باستخدام تكنولوجيا نانوالاستغناء الصوتية

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...