Name: a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

1. Etablering af Suspension Cell Cultures <ol><li> Forbered væske BY-2-medier ved tilsætning 4,43 g Linsmaier &amp; Skoog Basal medier, 30 g saccharose, 200 mg KH 2 PO 4, og 200 ug af 2,4-D (2,4-D) til 900 ml destilleret vand og pH til 5,8 med 0,1 M KOH. Efter indstilling af pH, justere slutvolumen til 1000 ml med destilleret vand og autoklave. Medier kan opbevares op til 2 uger ved 4 ° C. </li><li> Inokulere en 250 ml Erlenmeyer-kolbe med 100 ml flydende BY-2-medier og et enkelt stykke BY-2 c...

Den ovenfor beskrevne protokol er blevet valideret for protoplast isolation, tælling, og transformation ved hjælp af BY-2 tobak suspension cellekultur; kunne dog protokollen let udvides til enhver plante suspension kultur. På nuværende tidspunkt har protoplast isolation og transformation er opnået i en lang række planter, herunder majs (Zea mays) 10, gulerod (Daucus carota) 32, poppel (Populus euphratica) 33, drue (Vitis vinifera) 34, ...

I de senere år har der været en betydelig drivkraft placeret på udformningen af transgene afgrøder til at overvinde forskellige sygdomme 1, udstyre herbicidresistens 2, tillægger tørke 3,4 og salt tolerance 5, forebygge herbivory 6, øge biomasse udbytte 7, og mindske cellevæg vrangvillighed 8. Denne tendens er blevet hjulpet på vej af udviklingen af nye molekylære værktøjer til at generere transgene planter, herunder genom-redigering ved hjælp CRISPR og Talens 9, og gen silencing gennem dsRNA 10, miRNA 11, og siRNA 12. Mens disse teknologier har forenklet frembringelsen af ​​transgene planter, har de også skabt en flaskehals, hvor der genereres ikke kan screenes under anvendelse af traditionelle systemer, der er afhængige af planteregenerering det store antal af transgene planter. Relateret til dette flaskehals, mens silencing og genom-redigering konstruktioner kan indføres hurtigt i planter, mange af demålrettede træk undlader at frembringe den ønskede virkning, som ofte først opdages planter analyseres i drivhuset. I dette arbejde har vi udviklet en metode til hurtig, automatiseret, high-throughput screening af planteprotoplaster, specifikt at afhjælpe den nuværende flaskehals i tidlig screening af store antal af genom-redigering og gene silencing mål. Anvendelsen af ​​protoplaster, i modsætning til intakte planteceller, har flere fordele for udviklingen af ​​en automatiseret platform. Først protoplaster isoleret efter fordøjelse af plantecellevægge, og med dette ikke længere til stede barriere, er transformationseffektivitet steg 13. I intakte planteceller er der kun to veletablerede fremgangsmåder til transformation, biolistics 14 og Agrobacterium-medieret transformation 15. Ingen af ​​disse metoder kan let oversættes til flydende håndtering platforme, som biolistik kræver specialudstyr til transfoinger, hvorimod Agrobacterium-medieret transformation kræver co-kultur og efterfølgende fjernelse af bakterierne. Hverken er modtagelige for høj kapacitet metoder. I tilfælde af protoplaster, er transformation rutinemæssigt udført under anvendelse af polyethylenglycol (PEG) -medieret transfektion 16, som kun kræver flere løsning udvekslinger, og er ideelt egnet til håndtering af flydende platforme. For det andet, protoplaster, per definition, er single-cellekulturer, og dermed problemerne med sammenklumpning og kæde-dannelse i plantecellekulturer er ikke observeret i protoplaster. Med hensyn til hurtig screening under anvendelse af en plade-baseret spektrofotometer, sammenklumpning af celler, eller celler i flere planer vil føre til vanskeligheder med at erhverve konsekvente målinger. Da protoplaster er også tættere end deres dyrkningsmedier, de sedimentere til bunden af ​​brøndene, der danner et monolag, der er befordrende for plade-baseret spektrofotometri. Endelig mens plantecelle suspensionskulturer er Primarily afledt af callus 17, kan protoplaster høstes fra en række plantevæv, hvilket fører til muligheden for at identificere vævsspecifik ekspression. For eksempel, evnen til at analysere rod- eller blad-specifik ekspression af et gen kan være meget vigtigt at fænotype forudsigelse. Af disse grunde blev de protokoller, der er udviklet i dette arbejde valideret ved hjælp af protoplaster isoleret fra den udbredte tobak (Nicotiana tabacum L.) &#39;Bright Yellow »2 (BY-2) suspension kultur. BY-2 suspensionskultur er blevet beskrevet som &quot;HeLa&quot; celle af højere planter, på grund af sin allestedsnærværende anvendelse i molekylær analyse af planteceller 18. For nylig, AF-2-celler er blevet anvendt til at undersøge virkningerne af plante stressfaktorer 19-22, intracellulært protein lokalisering 23,24, og grundlæggende cellebiologi 25-27 demonstrerer den brede anvendelighed af disse kulturer i plantebiologi. En yderligere fordel ved BY-2-kulturer ermulighed for at synkronisere kulturerne med aphidicolin, hvilket kan føre til øget reproducerbarhed for genekspressionsstudier 28. Endvidere er der udviklet metoder til udvinding af BY-2 protoplaster ved anvendelse lavpris enzymer 29,30, som enzymer, der traditionelt anvendes til generering af protoplaster er omkostningseffektive uoverkommelige for højt gennemløb systemer. Som sådan har den nedenfor beskrevne protokol blevet valideret ved anvendelse af BY-2 suspensionskultur, men det bør kunne ændres til en celle suspension plante kultur. Proof-of-concept eksperimenter udføres under anvendelse af en orange fluorescens protein (OFP) reportergen (pporRFP) fra de hårde koraller Porites porites 31 under styring af CaMV 35S-promotoren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Orbitor RS Microplate mover</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Bravo Liquid Handler</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Synergy H1 Multi-mode Reader</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Teleshake</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>3800048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CPAC Ultraflat Heater/cooler</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>7000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Vworks Automation Software</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:255px;">Momentum Software</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Liquid Handling Control 2.17 Software</td>
			<td style="width:157px;">Biotek</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Zyla 3-Tap microscope camera</td>
			<td style="width:157px;">Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">ET-CY3/TRITC Filter Set</td>
			<td style="width:157px;">Chroma Technology Corp</td>
			<td>49004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohament CL</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost cellulase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect UF</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect 10L</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase/arabinase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Linsmaier &#38; Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">L689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2,4 dichlorophenoxyacetic acid</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">D295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Poly (ethylene glycol) 4000</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">95904-250G-F</td>
			<td>Formerly Fluka PEG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">25535-16-4</td>
			<td>Acros Organics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaCl2</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C7902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Mannitol</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC424205000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KOH</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Gelzan CM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">G1910-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">103184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96-well 1.2 ml deep well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AB-0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96 well optical bottom plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">9405 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">NaCl</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KCl</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MES</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC17259-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MgCl2</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

I det sidste årti har der været en genopblussen i brugen af ​​planteprotoplaster, der spænder fra modelarter at beskære arter, til analyse af signaltransduktionsveje, transkriptionelle regulatoriske netværk, genekspression, genom-redigering og gendæmpning. Endvidere er der gjort betydelige fremskridt i regenerering af planter fra protoplaster, der har genereret endnu mere interesse for brugen af ​​disse systemer til plantegenomik. I dette arbejde har en protokol udviklet til automatisering af protoplast isolation og transformation fra en &#39;Bright Yellow »2 (BY-2) suspension tobak kultur ved hjælp af en robot platform. De transformationsprocedurer valideret ved anvendelse af en orange fluorescerende protein (OFP) reportergen (pporRFP) under kontrol af blomkålsmosaikvirus 35S-promotoren (35S). OFP ekspression i protoplaster blev bekræftet ved epifluorescens-mikroskopi. Analyser omfattede også protoplast produktion effektivitet metoder ved hjælp propidium iodid. Endelig blev lavpris fødevarekvalitet enzymer anvendes til protoplastisolering procedure, omgår behovet for lab-grade enzymer, som er omkostnings-prohibitivt i high-throughput automatiseret protoplastisolering og analyse. Baseret på den protokol udviklet i dette arbejde, kan udføres hele proceduren fra protoplast isolation til transformation i under 4 timer, uden input fra operatøren. Mens den protokol udviklet i dette arbejde blev valideret med BY-2 cellekultur, bør de procedurer og metoder være oversættes til enhver plante suspension kultur / protoplast system, som skal gøre det muligt acceleration afgrøde genomforskning af.

I den aktuelle undersøgelse, den fordobling på BY-2 varierede fra 14-18 timer afhængig af temperaturen, hvorved kulturerne blev inkuberet, i overensstemmelse med tidligere rapporter om en gennemsnitlig cellecykluslængden af ​​15 timer. Med denne fordobling sats, en 1: blev 100 startende inokulum anvendes til at initiere kulturer, hvilket fører til kulturer med en pakket cellevolumen (PCV) på 50% i 5-7 dage. I den nuværende protokol, hvori kulturer blev dyrket i 200 ml medium, ...

Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

En høj-throughput, automatiseret, tobak protoplast produktion og transformation metodik er beskrevet. Det robotsystem giver massivt parallelle genekspression og opdagelse i modellen BY-2-systemet, der bør være oversættes til ikke-model afgrøder.

En robot platform for High-throughput protoplastisolering og Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Forstyrrelser af Cirkulerende miRNA i irritabel tyktarm Opdagede Ved hjælp af en Multiplexed Højkapacitetsforskning Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput robotersvejsede Assisted Isolering af temperaturfølsomme Lethal mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Høj fedt diæt fodring og High Throughput Triacylglyceride Assay i Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation af indfødte kromatin Immunoprecipitation sekventering biblioteker for Nucleosome tæthed analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: En High Throughput sekventering-baseret teknik til identifikation af sent replikerende regioner i genomet

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isoleret og høj overførselshastighed sekventering bibliotek konstruktion til Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Høj overførselshastighed identifikation af synergistiske Drug kombinationer af overlapning2 metode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Den replika sæt metode: En høj overførselshastighed tilgang til kvantitativt foranstaltning Caenorhabditis elegans levetid

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

High-gennemløb DNA plasmid multiplexing og Transfection ved hjælp af akustisk Nanodispenserings teknologi

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...