Name: a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

1. De vaststelling van Suspension Cell Cultures <ol><li> Bereid vloeibare BY-2 media door het toevoegen van 4,43 g Linsmaier &amp; Skoog basale media, 30 g sucrose, 200 mg KH 2PO 4 en 200 ug van 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur (2,4-D) aan 900 ml gedestilleerd water en pH 5,8 met 0,1 M KOH. Na het aanpassen van de pH, aan te passen uiteindelijke volume tot 1000 ml met gedestilleerd water en autoclaaf. Media kunnen tot 2 weken bewaard bij 4 ° C. </li><li> Inoculeren een 250 ml Erlenmeyer fles met 100 ...

De hierboven beschreven protocol is met succes gevalideerd voor protoplastisolatie, telling, en transformatie met behulp van de door-2 tabak schorsing celkweek; echter, kon het protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar alle planten schorsing cultuur. Op dit moment heeft protoplastisolatie en transformatie gerealiseerd in tal van planten, met inbegrip van maïs (Zea mays) 10, wortel (wilde peen) 32, populier (Populus euphratica) 33, druif (Vitis vinifera)<...

In de afgelopen jaren is er een belangrijke impuls gelegd aan het ontwerp van transgene gewassen voor verschillende ziekten 1 te overwinnen, schenken herbicide weerstand 2, overleggen droogte 3,4 en zouttolerantie 5 geweest, herbivorie 6 te voorkomen, te verhogen biomassaopbrengst 7 en celwand weerspannigheid verlagen 8. Deze trend is geholpen door de ontwikkeling van nieuwe moleculaire technieken voor het genereren van transgene planten, waaronder genoom-bewerk, CRISPR Talens en 9, en silencing tot dsRNA 10, 11 miRNA en siRNA 12. Hoewel deze technologieën het genereren van transgene planten hebben vereenvoudigd, hebben ze ook een bottleneck, waarbij het grote aantal transgene planten gegenereerd kunnen niet worden gescreend met behulp van traditionele systemen die afhankelijk zijn van planten regeneratie. Voor dit knelpunt, terwijl zwijgen en genoom-editing constructen kunnen snel in planten worden ingebracht, velegerichte eigenschappen niet het gewenste effect, die vaak niet ontdekt tot planten worden geanalyseerd in de kas te produceren. In dit werk hebben we een werkwijze voor snelle, geautomatiseerde high-throughput screening van plantenprotoplasten ontwikkeld, specifiek de huidige bottleneck begin screening van grote aantallen genoom-editing en silencing streefwaarden. Het gebruik van protoplasten, in tegenstelling tot intacte plantencellen, heeft een aantal voordelen voor de ontwikkeling van een geautomatiseerd platform. Eerst worden protoplasten geïsoleerd na digestie van de plantencelwand, en deze barrière niet meer aanwezig, wordt transformatie-efficiëntie verhoogd 13. In intacte plantencellen zijn er slechts twee gevestigde methoden voor transformatie, biolistica 14 en Agrobacterium-gemedieerde transformatie 15. Geen van deze methoden kan gemakkelijk worden vertaald naar liquid handling platforms, zoals biolistica vereist gespecialiseerde apparatuur voor transformatie, terwijl Agrobacterium-gemedieerde transformatie vereist co-cultuur en de daarop volgende verwijdering van de bacteriën. Niet vatbaar voor high throughput methode. Bij protoplasten, transformatie wordt routinematig uitgevoerd met polyethyleenglycol (PEG) bemiddelde transfectie 16, die op verschillende oplossing vereist uitwisseling, en is ideaal voor vloeistofverwerking platforms. Anderzijds protoplasten per definitie zijn eencellige kweken, en dus de problemen van klontering en ketenvorming in plantencelkweken, worden niet waargenomen in protoplasten. In termen van een snelle screening met behulp van een plaat gebaseerde spectrofotometer, samenklontering van cellen, of cellen in meerdere vlakken zal leiden tot moeilijkheden bij het verkrijgen van consistente metingen. Aangezien protoplasten ook dichter dan de kweekmedia ze bezinken op de bodem van putjes, waarbij een monolaag, die bevorderlijk is voor platen gebaseerde spectrofotometrie. Tot slot, terwijl de fabriek celsuspensieculturen zijn primarily afgeleid van callus 17, kunnen protoplasten worden verzameld van verschillende plantenweefsels, waardoor de mogelijkheid om weefselspecifieke expressie te identificeren. Bijvoorbeeld, het vermogen om wortel- of blad-specifieke expressie van een gen te analyseren kan zeer belangrijk fenotype te voorspellen. Daarom werden de die in dit werk protocollen gevalideerd middels protoplasten geïsoleerd uit de veel gebruikte tabak (Nicotiana tabacum L.) Bright Yellow &#39;2 (BY-2) suspensiekweek. Het BY-2 suspensiekweek is beschreven als het &quot;HeLa&quot; cel van hogere planten door zijn alomtegenwoordige gebruik in moleculaire analyse van 18 plantencellen. Onlangs BY-2 cellen werden gebruikt om de effecten te bestuderen van plantaardige stressoren 19-22, intracellulair eiwit lokalisatie 23,24 en fundamentele celbiologie 25-27 tonen de brede bruikbaarheid van deze culturen in plantenbiologie. Een bijkomend voordeel van BY-2 culturen demogelijkheid om de kweken te synchroniseren met aphidicoline, wat kan leiden tot verbeterde reproduceerbaarheid genexpressiestudies 28. Bovendien zijn werkwijzen ontwikkeld voor de extractie van BY-2 protoplasten met behulp van goedkope enzymen 29,30, enzymen traditioneel gebruikt voor het genereren van protoplasten onbetaalbaar voor high-throughput systemen. Als zodanig heeft de hieronder beschreven protocol gevalideerd met de door-2 suspensiekweek, maar het moet geamendeerd om alle planten celsuspensie cultuur. Proof-of-concept experimenten uitgevoerd met een fluorescentie eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) vanaf het harde koraal Porites Porites 31 onder de controle van de CaMV35S-promoter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Orbitor RS Microplate mover</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Bravo Liquid Handler</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Synergy H1 Multi-mode Reader</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Teleshake</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>3800048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CPAC Ultraflat Heater/cooler</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>7000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Vworks Automation Software</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:255px;">Momentum Software</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Liquid Handling Control 2.17 Software</td>
			<td style="width:157px;">Biotek</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Zyla 3-Tap microscope camera</td>
			<td style="width:157px;">Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">ET-CY3/TRITC Filter Set</td>
			<td style="width:157px;">Chroma Technology Corp</td>
			<td>49004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohament CL</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost cellulase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect UF</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect 10L</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase/arabinase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Linsmaier &#38; Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">L689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2,4 dichlorophenoxyacetic acid</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">D295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Poly (ethylene glycol) 4000</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">95904-250G-F</td>
			<td>Formerly Fluka PEG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">25535-16-4</td>
			<td>Acros Organics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaCl2</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C7902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Mannitol</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC424205000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KOH</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Gelzan CM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">G1910-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">103184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96-well 1.2 ml deep well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AB-0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96 well optical bottom plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">9405 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">NaCl</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KCl</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MES</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC17259-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MgCl2</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

In het laatste decennium is er een opleving in het gebruik van plantaardige protoplasten die variëren van model soort tot soort gewas, voor de analyse van signaaloverdracht, transcriptionele regulatorische netwerken, genexpressie, genoom-editing, en gen-silencing is geweest. Bovendien is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de regeneratie van planten uit protoplasten, die nog meer belangstelling voor het gebruik van deze systemen voor plantengenomics heeft gegenereerd. In dit werk is een protocol ontwikkeld voor de automatisering van protoplastisolatie en transformatie van een &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tabak schorsing cultuur met behulp van een robot platform. De transformatie procedures zijn gevalideerd met een oranje fluorescerend eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) onder controle van de bloemkoolmozaïekvirus 35S-promoter (35S). OFP expressie in protoplasten werd bevestigd door epifluorescentie microscopie. Analyses omvatte ook protoplast efficiëntie van de productie methoden waarbij propidium jodide. Tenslotte werden goedkope food-grade enzymen die voor de protoplast isolatiewerkwijze, omzeilen de noodzaak van lab-klasse enzymen die kosten prohibitief in high-throughput geautomatiseerde protoplastisolatie en analyse. Op basis van het protocol ontwikkeld in dit werk, kan de volledige procedure van protoplastisolatie transformatie worden uitgevoerd in minder dan 4 uur, zonder enige inbreng van de operator. Terwijl de ontwikkelde in dit werk protocol werd gevalideerd met de BY-2 celkweek, moeten de procedures en methodes vertaalbaar naar alle planten schorsing cultuur / protoplast-systeem, dat de versnelling van het gewas genomics onderzoek moet mogelijk te maken.

In de huidige studie, de verdubbelingstijd percentage BY-2 varieerde 14-18 uur afhankelijk van de temperatuur waarbij de kweken werden geïncubeerd, in overeenstemming met eerdere rapporten van een gemiddelde lengte van de celcyclus van 15 uur. Met deze verdubbeling rate, een 1: 100 werd beginnen entstof gebruikt om culturen te initiëren, wat leidt tot culturen met een hematocriet (PCV) van 50% in 5-7 dagen. In het huidige protocol, waarin kweken werden gekweekt in 200 ml medium, een PC...

Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Verstoringen van circulerende miRNAs in het prikkelbare darm syndroom gedetecteerd met een multiplexverzending High-throughput genexpressie Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Hoog vet dieet voeding en High Throughput triglyceride test bij Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generatie van inheemse chromatine Immunoprecipitation Sequencing bibliotheken nucleosoom dichtheid p.a.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput identificatie van synergetische Drug combinaties door de overlapping2 methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...