Name: a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00
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This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

1. Mise en place de la suspension des cultures cellulaires <ol><li> Préparer liquide par 2 supports en y ajoutant 4,43 g Linsmaier &amp; Skoog basal, 30 g de saccharose, 200 mg de KH 2 PO 4 et 200 pg d&#39;acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) à 900 ml d&#39; eau distillée l&#39;eau et le pH à 5,8 avec 0,1 M KOH. Après ajustement du pH, ajuster le volume final à 1000 ml avec de l&#39;eau distillée et autoclave. Les médias peuvent être stockés jusqu&#39;à 2 semaines à 4 ° C. </l...

Le protocole décrit ci-dessus a été validé avec succès pour l&#39;isolement de protoplastes, l&#39;énumération et la transformation du tabac en utilisant une culture de cellules en suspension BY-2; Toutefois, le protocole pourrait facilement être étendu à toute culture de suspension de la plante. À l&#39; heure actuelle, l&#39; isolement de protoplastes et la transformation ont été réalisés dans de nombreuses plantes, notamment le maïs (Zea mays) 10, la carotte (Daucus carota)</em...

Ces dernières années , il y a eu une impulsion significative placé sur la conception des cultures transgéniques pour surmonter diverses maladies 1, conférer une résistance aux herbicides 2, confère la sécheresse 3,4 et la tolérance au sel 5, prévenir herbivory 6, augmenter le rendement de la biomasse 7, et de diminuer la paroi cellulaire récalcitrante 8. Cette tendance a été favorisée par le développement de nouveaux outils moléculaires pour générer des plantes transgéniques, y compris le génome d&#39;édition en utilisant CRISPR et TALENs 9 et silençage génique par ARNdb 10, miRNA 11 et siRNA 12. Bien que ces technologies ont simplifié la génération de plantes transgéniques, ils ont également créé un goulot d&#39;étranglement, où le grand nombre de plantes transgéniques générées ne peuvent pas être criblée en utilisant les systèmes traditionnels qui reposent sur la régénération des plantes. Associés à ce goulot d&#39;étranglement, tout en réduisant au silence et génome édition constructions peuvent être insérés rapidement dans les plantes, un grand nombre detraits ciblés ne parviennent pas à produire l&#39;effet désiré, qui est souvent découverte que les plantes sont analysées dans la serre. Dans ce travail, nous avons développé une méthode pour rapide automatisée, le dépistage, à haut débit de protoplastes végétaux, en particulier pour résoudre le goulot d&#39;étranglement dans le dépistage précoce d&#39;un grand nombre de génomes d&#39;édition et le gène silencieux cibles. L&#39;utilisation de protoplastes, par opposition à des cellules végétales intactes, présente plusieurs avantages pour le développement d&#39;une plateforme automatisée. Tout d&#39; abord, les protoplastes sont isolés après digestion de la paroi cellulaire de la plante, et cette barrière ne présentent plus, l&#39; efficacité de transformation 13 est augmentée. Dans les cellules végétales intactes il y a seulement deux méthodes bien établies pour la transformation, biolistique 14 et Agrobacterium transformation médiée 15. Aucune de ces méthodes peuvent être facilement convertis aux plates-formes de manipulation de liquides, comme biolistique nécessite un équipement spécialisé pour transformation, alors que Agrobacterium transformation médiée nécessite co-culture et l&#39; élimination ultérieure des bactéries. Ni se prêtent à des procédés à haut débit. Dans le cas de protoplastes, la transformation est habituellement effectuée en utilisant le polyéthylène glycol (PEG) de transfection médiée 16, qui ne nécessite plusieurs échanges de solutions, et est idéale pour les plates - formes de manipulation de liquides. En second lieu, les protoplastes, par définition, sont des cultures monocellulaires, et donc les problèmes associés à l&#39;agglutination et la formation chaîne dans des cultures de cellules végétales, ne sont pas observés dans les protoplastes. En termes de dépistage rapide à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre à base de plaque, l&#39;agglutination des cellules, ou des cellules dans plusieurs plans vont conduire à des difficultés dans l&#39;acquisition de mesures cohérentes. Etant donné que les protoplastes sont aussi plus denses que les milieux de culture, ils sédimentent au fond du puits, la formation d&#39;une monocouche, ce qui est favorable à la spectrophotométrie sur la base de plaque. Enfin, alors que les cultures en suspension de cellules végétales sont primarille dérivé de 17 cals, les protoplastes peuvent être récoltées à partir d&#39; un certain nombre de tissus végétaux, conduisant à la possibilité d&#39;identifier une expression spécifique d&#39; un tissu. Par exemple, la capacité d&#39;analyser root- ou une expression spécifique de feuille d&#39;un gène peut être très important pour la prédiction du phénotype. Pour ces raisons, les protocoles mis au point dans ce travail ont été validées en utilisant des protoplastes isolés du tabac largement utilisé (Nicotiana tabacum L.) 2 (PAR-2) de culture en suspension &#39;Bright Yellow&#39;. La culture en suspension BY-2 a été décrite comme étant la cellule &quot;Hela&quot; des plantes supérieures, en raison de son utilisation généralisée dans l&#39; analyse moléculaire des cellules végétales 18. Récemment, PAR-2 cellules ont été utilisées pour étudier les effets de facteurs de stress plante 19-22, protéine intracellulaire localisation 23,24, et la biologie cellulaire de base 25-27 démontrant l&#39;utilité générale de ces cultures en biologie végétale. Un avantage supplémentaire de BY-2 est la culturepossibilité de synchroniser les cultures avec aphidicoline, ce qui peut conduire à une meilleure reproductibilité pour l&#39; expression génique des études 28. En outre, des méthodes ont été mises au point pour l&#39;extraction de PAR-2 protoplastes utilisant des enzymes à faible coût 29,30, comme enzymes traditionnellement utilisées pour générer des protoplastes sont des coûts prohibitifs pour les systèmes à haut débit. En tant que tel, le protocole décrit ci-dessous a été validé en utilisant la culture en suspension BY-2, mais il devrait être amendable à une culture usine de suspension cellulaire. Les expériences de validation de concept sont effectuées en utilisant une protéine de fluorescence orange (OFP) gène rapporteur (pporRFP) des Porites de coraux durs porites 31 sous le contrôle du promoteur CAMV 35S.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Orbitor RS Microplate mover</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Bravo Liquid Handler</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Synergy H1 Multi-mode Reader</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Teleshake</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>3800048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CPAC Ultraflat Heater/cooler</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>7000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Vworks Automation Software</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:255px;">Momentum Software</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Liquid Handling Control 2.17 Software</td>
			<td style="width:157px;">Biotek</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Zyla 3-Tap microscope camera</td>
			<td style="width:157px;">Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">ET-CY3/TRITC Filter Set</td>
			<td style="width:157px;">Chroma Technology Corp</td>
			<td>49004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohament CL</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost cellulase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect UF</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect 10L</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase/arabinase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Linsmaier &#38; Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">L689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2,4 dichlorophenoxyacetic acid</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">D295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Poly (ethylene glycol) 4000</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">95904-250G-F</td>
			<td>Formerly Fluka PEG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">25535-16-4</td>
			<td>Acros Organics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaCl2</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C7902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Mannitol</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC424205000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KOH</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Gelzan CM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">G1910-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">103184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96-well 1.2 ml deep well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AB-0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96 well optical bottom plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">9405 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">NaCl</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KCl</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MES</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC17259-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MgCl2</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

Au cours de la dernière décennie, il y a eu une résurgence de l&#39;utilisation des protoplastes végétaux qui vont des espèces modèles pour recadrer les espèces, pour l&#39;analyse des voies de signalisation de la transduction, les réseaux de régulation transcriptionnelle, l&#39;expression des gènes, génome d&#39;édition, et la neutralisation des gènes. En outre, des progrès significatifs ont été réalisés dans la régénération des plantes à partir de protoplastes, qui a généré encore plus d&#39;intérêt dans l&#39;utilisation de ces systèmes pour la génomique végétale. Dans ce travail, un protocole a été mis au point pour l&#39;automatisation de l&#39;isolement de protoplastes et la transformation de 2 (PAR-2) la culture du tabac en suspension un «Bright Yellow» en utilisant une plate-forme robotique. Les procédures de transformation ont été validés à l&#39;aide d&#39;une protéine fluorescente orange (OFP) gène rapporteur (pporRFP) sous le contrôle du promoteur de chou-virus de la mosaïque 35S (35S). OFP expression dans des protoplastes a été confirmée par microscopie à épifluorescence. Les analyses comprenaient également des méthodes d&#39;efficacité de production protoplastes utilisant propidium iodure. Enfin, les enzymes de qualité alimentaire à faible coût ont été utilisés pour la procédure d&#39;isolement de protoplastes, de contourner la nécessité d&#39;enzymes de laboratoire de qualité qui sont un coût prohibitif en haut débit automatisé isolement et l&#39;analyse protoplastes. Basé sur le protocole mis au point dans ce travail, la procédure complète de l&#39;isolement de protoplastes à la transformation peut être réalisée en moins de 4 heures, sans aucune intervention de l&#39;opérateur. Alors que le protocole mis au point dans ce travail a été validé avec la culture cellulaire BY-2, les procédures et les méthodes doivent être traduisible à tout système de culture en suspension végétale / protoplastes, ce qui devrait permettre une accélération de la recherche en génomique des cultures.

Dans la présente étude, le taux de doublement de BY-2 a varié de 14 à 18 h dépendant de la température à laquelle les cultures ont été incubées, en accord avec les rapports précédents, d&#39;une longueur moyenne de 15 heures du cycle cellulaire. Avec ce taux de doublement, 1: 100 à partir inoculum a été utilisé pour initier des cultures, ce qui conduit à des cultures avec un volume cellulaire tassé (CVP) de 50% en 5-7 jours. Dans le protocole actuel, dans lequel les cul...

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Une méthode à haut débit automatisée, la production de tabac en protoplastes et la transformation est décrite. Le système robotisé permet l&#39;expression du gène massivement parallèle et de découverte dans le système modèle BY-2 qui devrait être traduisible aux cultures non-modèle.

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