Name: a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00
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This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

懸濁細胞培養の1の確立<ol><li>蒸留900 mlの4.43 gでLinsmaier＆スクーグ基本培地、スクロース30gを、200mgのKH 2 PO 4、及び2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）200μgのを添加することにより、BY-2培地液を調製水および0.1 M KOHで5.8にpHを。 pHを調整した後、蒸留水、オートクレーブで千ミリリットルへの最終的な音量を調整します。培地は4℃​​で2週間まで保存することができます。 </...

上記のプロトコルが正常BY-2タバコ懸濁細胞培養を用いてプロトプラスト単離、列挙、および形質転換のために検証されています。しかしながら、このプロトコルは容易に任意の植物懸濁培養に拡張することができます。現時点では、プロトプラストの分離および形質転換は、トウモロコシ（ トウモロコシ ）10、ニンジン（ ニンジン属のcarota）32、ポプラ（ ?...

除草剤抵抗性2を与える、様々な疾患1を克服するために、トランスジェニック作物の設計上に配置された有意な刺激があった近年、バイオマス収率7を高める、草食性6を防ぐ、干ばつ3,4および塩耐性5を付与し、細胞壁の反抗を減少させます8。この傾向は、CRISPRとTALENs 9を用いて、ゲノム編集、およびdsRNAの10、miRNAの11、およびsiRNA 12を介して遺伝子サイレンシングを含むトランスジェニック植物を生成するための新たな分子ツールの開発によって支援されています。これらの技術は、トランスジェニック植物の生成を簡略化しているが、彼らはまた、生成されたトランスジェニック植物の膨大な数は植物体再生に依存している従来のシステムを用いてスクリーニングすることができないボトルネックを作成しました。 、多くのサイレンシングゲノム編集構築物が急速に植物内に挿入することができるが、このボトルネックに関連します標的の形質は、植物を温室内で分析されるまで、頻繁に発見されていない所望の効果を生み出すことができません。この研究では、特異的ゲノム編集及び遺伝子サイレンシングの標的の多数の初期スクリーニングにおいて現在のボトルネックに対処するために、植物プロトプラストの迅速、自動化、ハイスループットスクリーニングのための方法を開発しました。 無傷の植物細胞とは対照的に、プロトプラストの使用は、自動化されたプラットフォームの開発のためのいくつかの利点を有します。まず、プロトプラストは、植物細胞壁の消化後に単離されており、もはや存在し、このバリアと、形質転換効率は、13に増加します。無傷の植物細胞14およびアグロバクテリウム媒介形質転換15遺伝子銃形質転換のために2つだけの十分に確立された方法があります。微粒子銃がtransfoのための特殊な装置を必要とするこれらの方法のいずれもが簡単に、液体ハンドリングプラットフォームに変換することができますアグロバクテリウムを介した形質転換一方rmationは、共培養し、細菌のその後の除去を必要とします。どちらも高スループット方法のために適していません。プロトプラストの場合には、変換は、日常的にのみ、いくつかの溶液交換を必要とし、理想的には、液体ハンドリングプラットフォームに適しているポリエチレングリコール（PEG）媒介性トランスフェクション16を用いて行われます。第二に、プロトプラストは、定義により、単一細胞培養物であり、従って、植物細胞培養物中で凝集し、鎖形成に関連する問題は、プロトプラストでは観察されません。プレートベースの分光光度計を用いて迅速なスクリーニングの観点から、複数の平面内の細胞、または細胞の凝集は、一貫した測定値を取得することの困難につながります。プロトプラストは、それらの培地よりも密であるので、それらは、プレートベースの分光光度法のために助長している単分子層を形成し、ウェルの底に沈降します。最後に、植物細胞懸濁培養物はprimarいる間ILYカルス17由来のプロトプラストは、組織特異的発現を同定する能力をもたらす、植物組織の数から採取することができます。例えば、遺伝子のルートで、または葉特異的発現を分析する能力は、表現型の予測にとって非常に重要であることができます。これらの理由から、本研究で開発されたプロトコルが広く使用されているタバコ（ タバコ L.）「明るい黄色&#39;2（BY-2）懸濁培養物から単離したプロトプラストを用いて検証しました。 BY-2浮遊培養は、植物細胞18の分子分析におけるその遍在使用のために、高等植物の「HeLa細胞」細胞として記載されています。最近、BY-2細胞は、植物の効果を研究するために使用されている、細胞内タンパク質局在23,24、および植物生物学において、これらの培養物の広範な有用性を示す基本的な細胞生物学25-27を 19-22をストレッサー。 BY-2培養物のさらなる利点は遺伝子発現研究28向けに拡張再現性につながる可能性がアフィディコリン、と文化を同期する機能。さらに、方法は、伝統的に、プロトプラストを生成するために使用される酵素は、コスト高スループットシステムのために禁止されているように、低コストの酵素29,30を用いた BY-2プロトプラストの抽出のために開発されてきました。そのようなものとして、以下に記載されるプロトコルは、BY-2浮遊培養を用いて検証されていますが、それは任意の植物細胞懸濁培養に修正可能でなければなりません。概念実証実験は、ハードサンゴハマからオレンジ色蛍光タンパク質（OFP）レポーター遺伝子（pporRFP）はCaMV35Sプロモーターの制御下で、31を ハマ使用して実行されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Orbitor RS Microplate mover</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Bravo Liquid Handler</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Synergy H1 Multi-mode Reader</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Teleshake</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>3800048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CPAC Ultraflat Heater/cooler</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>7000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Vworks Automation Software</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:255px;">Momentum Software</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Liquid Handling Control 2.17 Software</td>
			<td style="width:157px;">Biotek</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Zyla 3-Tap microscope camera</td>
			<td style="width:157px;">Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">ET-CY3/TRITC Filter Set</td>
			<td style="width:157px;">Chroma Technology Corp</td>
			<td>49004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohament CL</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost cellulase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect UF</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect 10L</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase/arabinase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Linsmaier &#38; Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">L689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2,4 dichlorophenoxyacetic acid</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">D295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Poly (ethylene glycol) 4000</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">95904-250G-F</td>
			<td>Formerly Fluka PEG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">25535-16-4</td>
			<td>Acros Organics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaCl2</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C7902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Mannitol</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC424205000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KOH</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Gelzan CM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">G1910-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">103184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96-well 1.2 ml deep well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AB-0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96 well optical bottom plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">9405 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">NaCl</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KCl</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MES</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC17259-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MgCl2</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

過去10年間のシグナル伝達経路、転写制御ネットワーク、遺伝子発現、ゲノム編集、および遺伝子サイレンシングの分析のため、モデル種からの作物種に及ぶ植物プロトプラストの使用に復活がありました。さらに、重要な進展は、植物ゲノミクスのためのこれらのシステムの使用であってもより多くの関心を生成したプロトプラストからの植物の再生、で行われています。この作業では、プロトコルは、ロボットプラットフォームを使用して「明るい黄色 &#39;2（BY-2）タバコ懸濁培養からのプロトプラストの分離および形質転換の自動化のために開発されてきました。形質転換手順は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（35S）の制御下で、オレンジ色蛍光タンパク質（OFP）レポーター遺伝子（pporRFP）を用いて検証しました。プロトプラストにおけるOFPの発現は、エピ蛍光顕微鏡によって確認されました。分析はまたpropidiuを用いてプロトプラスト生産効率の方法を含めメートルヨウ化。最後に、低コストの食品グレードの酵素は、ハイスループット自動プロトプラスト単離および分析にコスト高である実験室グレードの酵素の必要性を回避する、プロトプラスト単離手順のために使用しました。今回開発したプロトコルに基づいて、変換へのプロトプラスト単離からの完全な手順は、オペレータからの入力なしに、4時間の下で行うことができます。今回開発したプロトコルは、BY-2細胞培養で検証されたが、手順および方法は、作物ゲノム研究の加速を有効にする必要があります任意の植物懸濁培養/プロトプラストシステムに翻訳可能でなければなりません。

現在の研究では、BY-2の倍加速度は、培養物は、15時間の平均細胞周期の長さの以前の報告と一致して培養したときの温度に依存して14から18時間から変化しました。この倍加速度で、1：100の出発接種材料は5-7日で50％のパック細胞容積（PCV）での文化につながる、培養を開始するために使用されました。培養物を培地200mlに成長された現在のプロトコルでは、100mlとPCV 3...

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

ハイスループット、自動化され、タバコプロトプラストの生産と変換方法について説明します。ロボットシステムは、非モデル作物に翻訳可能であるべきであるBY-2システムモデルにおける大規模並列遺伝子発現と発見を可能にします。

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

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ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します<em&gt;クラミドモナス</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

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高脂肪食給餌とキイロショウジョウバエの高スループット Triacylglyceride 試金

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

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重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

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レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

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円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...