Name: a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

1. Etablering av Suspension cellekulturer <ol><li> Fremstille flytende BY-2-medier ved tilsetning av 4,43 g Linsmaier &amp; Skoog Basal Media, 30 g sukrose, 200 mg KH 2PO 4, og 200 ug av 2,4-diklorfenoksyeddiksyre (2,4-D) til 900 ml destillert vann og pH-verdien til 5,8 med 0,1 M KOH. Etter justering av pH-verdien, justere sluttvolumet til 1000 ml med destillert vann og autoklav. Media kan lagres opp til 2 uker ved 4 ° C. </li><li> Inokulere en 250 ml Erlenmeyer-kolbe med 100 ml flytende PR-2-me...

Protokollen er beskrevet ovenfor har blitt validert for protoplasten isolasjon, telling, og transformasjon ved hjelp av PR-2 tobakksuspensjonscellekultur; imidlertid protokollen kan lett utvides til en hvilken som helst plante suspensjonskultur. I dag har protoplast isolasjon og transformasjon er oppnådd i mange planter, inkludert mais (Zea mays) 10, gulrot (Daucus carota) 32, poppel (Populus Euphratica) 33, drue (Vitis vinifera) 34, oljepa...

I de senere årene har det vært en betydelig drivkraft plassert på utformingen av transgene avlinger til å overvinne ulike sykdommer 1, gi gave til ugressmiddel motstand 2, jf tørke 3,4 og salttoleranse 5, forhindre herbivory 6, øke biomassen utbyttet 7, og redusere celleveggen recalcitrance 8. Denne trenden har blitt hjulpet av utviklingen av nye molekylære verktøy for generering av transgene planter, inkludert genom-redigering med CRISPR og Talens 9, og genet stanse gjennom dsRNA 10, miRNA 11, og siRNA 12. Selv om disse teknologiene har forenklet generering av transgene planter, har de også opprettet en flaskehals, der det store antallet av transgene planter som genereres kan ikke bli vist ved hjelp av tradisjonelle systemer som er avhengige av plante regenerering. Relatert til dette flaskehalsen, mens tie og genom-redigering konstruksjoner kan raskt settes inn planter, mange avmålrettede egenskaper mislykkes i å gi den ønskede effekten, som ofte ikke oppdages før plantene er analysert i drivhuset. I dette arbeidet har vi utviklet en metode for rask, automatisert, high-throughput screening av planteprotoplaster, spesielt for å møte den nåværende flaskehals tidlig screening av et stort antall genom-redigering og genet Slå mål. Bruken av protoplaster, i motsetning til intakte planteceller, har flere fordeler for utvikling av en automatisert plattform. Først blir protoplaster isoleres etter oppslutning av plantecelleveggen, og med denne barrieren ikke lenger er til stede, er transformasjonseffektiviteten økes 13. I intakte planteceller er det bare to godt etablerte metoder for transformasjon, biolistics 14 og Agrobacterium-formidlet transformasjon 15. Ingen av disse metodene kan lett oversettes til væskehåndtering plattformer, som biolistics krever spesialisert utstyr for transformation, mens Agrobacterium-formidlet transformasjon krever ko-kultur og etterfølgende fjerning av bakteriene. Verken er mottagelig for høy gjennomstrømning metoder. I tilfelle av protoplaster, blir transformasjonen rutinemessig utført ved bruk av polyetylenglykol (PEG) -mediert transfeksjon 16, som bare krever flere løsnings utveksling, og er ideelt egnet for væskehåndtering plattformer. For det andre protoplaster, ved definisjon, er enkelt-cellekulturer, og dermed de problemer som er forbundet med klumpdannelse og kjededannelse i plantecellekulturer, ikke blir observert i protoplaster. I form av rask screening ved hjelp av en plate-baserte spektrofotometer, klumper av celler eller celler i flere plan vil føre til vanskeligheter med å skaffe konsistente målinger. Siden protoplaster er også tettere enn deres kulturmedia, de sedimentere til bunnen av brønner, å danne et monolag, som er rette for platebasert spektrofotometri. Til slutt, mens plantecellesuspensjonskulturer er Primarily avledet fra callus 17, kan protoplaster høstes fra en rekke plantemateriale, som fører til evnen til å identifisere vev-spesifikk ekspresjon. For eksempel, evnen til å analysere rot-eller blad-spesifikk ekspresjon av et gen som kan være svært viktig for fenotype forutsigelse. Av disse grunner ble protokollene utviklet i dette arbeidet validert ved bruk av protoplaster isolert fra den mye brukte tobakk (Nicotiana tabacum L.) «Bright Yellow &#39;2 (PR-2) suspensjonskultur. Den BY-2 suspensjonskultur er blitt beskrevet som &quot;HeLa&quot; celle fra høyere planter, på grunn av dens utbredte anvendelse ved molekylær analyse av planteceller 18. Nylig, AV-2 celler har blitt brukt til å studere effekter av stressfaktorer 19-22, intracellulær protein lokalisering 23,24, og grunnleggende cellebiologi 25-27 demonstrere bred nytten av disse kulturene i plantebiologi. En ekstra fordel av PR-2 kulturer erevne til å synkronisere kulturene med aphidicholin, noe som kan føre til forbedret reproduserbarhet for genuttrykkstudier 28. Videre fremgangsmåter er blitt utviklet for utvinning av PR-2-protoplaster ved hjelp av rimelige enzymer 29,30, som enzymer som tradisjonelt brukes for generering av protoplaster er kostnads prohibitive for high-throughput-systemer. Som sådan har den protokoll som er beskrevet nedenfor blitt validert ved hjelp av PR-2 suspensjonskultur, men det bør være amendable til en hvilken som helst plante cellesuspensjonskultur. Proof-of-concept eksperimenter er utført ved hjelp av et oransje fluorescens protein (OFP) reporter-gen (pporRFP) fra den harde koraller Porites porites 31 under kontroll av CaMV 35S-promotoren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Orbitor RS Microplate mover</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Bravo Liquid Handler</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Synergy H1 Multi-mode Reader</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Teleshake</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>3800048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CPAC Ultraflat Heater/cooler</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>7000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Vworks Automation Software</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:255px;">Momentum Software</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Liquid Handling Control 2.17 Software</td>
			<td style="width:157px;">Biotek</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Zyla 3-Tap microscope camera</td>
			<td style="width:157px;">Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">ET-CY3/TRITC Filter Set</td>
			<td style="width:157px;">Chroma Technology Corp</td>
			<td>49004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohament CL</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost cellulase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect UF</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect 10L</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase/arabinase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Linsmaier &#38; Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">L689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2,4 dichlorophenoxyacetic acid</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">D295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Poly (ethylene glycol) 4000</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">95904-250G-F</td>
			<td>Formerly Fluka PEG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">25535-16-4</td>
			<td>Acros Organics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaCl2</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C7902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Mannitol</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC424205000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KOH</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Gelzan CM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">G1910-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">103184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96-well 1.2 ml deep well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AB-0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96 well optical bottom plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">9405 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">NaCl</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KCl</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MES</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC17259-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MgCl2</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

I løpet av det siste tiåret har det vært en oppblomstring i bruk av planteprotoplaster som spenner fra modellarter for å beskjære arter, for analyse av signaloverføringsveier, transkripsjonsregulerende nettverk, genekspresjon, genom-redigering, og gene-demping. Videre har betydelige fremskritt er gjort i regenerering av planter fra protoplaster, som har generert enda mer interesse i bruken av disse systemene for plantegenomforskning. I dette arbeidet har en protokoll utviklet for automatisering av protoplast isolasjon og transformasjon fra en &quot;Bright Yellow &#39;2 (BY-2) tobakk suspensjonskultur ved hjelp av en robot plattform. De transformasjonsprosedyrer ble validert ved bruk av et oransje fluorescerende protein (OFP) reporter-gen (pporRFP) under kontroll av blomkål mosaikkvirus 35S-promotoren (35S). OFP uttrykk i protoplaster ble bekreftet av epifluorescence mikroskopi. Analyser også inkludert protoplast produksjon effektivitet metoder ved hjelp propidium jod. Til slutt ble lavkost mat-grade enzymer brukes til protoplasten isoleringsprosedyren, omgå behovet for laboratorie vurder enzymer som er kostnads ​​uoverkommelige i high-throughput automatisert protoplast isolasjon og analyse. Basert på den protokoll som er utviklet i dette arbeidet, kan hele prosedyren fra protoplast isolasjon til transformasjon utføres i henhold til 4 timer, uten noen inndata fra operatør. Mens protokoll utviklet i dette arbeidet ble validert med BY-2 cellekultur, bør de prosedyrer og metoder være settes til alle anlegg suspensjon kultur / protoplast system, som skal gjøre det mulig akselerasjon av avlingsgenomforskning.

I denne studien, doblings frekvensen av PR-2 varierte 14-18 timer avhengig av temperaturen ved hvilken kulturene ble inkubert, i samsvar med tidligere rapporter om en midlere cellesykluslengde av 15 timer. Med denne dobling hastighet, en 1: Det ble 100 starter inokulum anvendt for å initiere kulturer, noe som fører til kulturene med en pakket cellevolum (PCV) av 50% i 5-7 dager. I den nåværende protokoll, i hvilket kulturer ble dyrket i 200 ml medium, ble en hematokrit på 100 ml ble...

Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

En høy gjennomstrømming, automatisert, tobakk protoplast produksjon og transformasjon metodikk er beskrevet. Den robotsystem gjør massivt parallell genekspresjon og funn i modellen BY-2 system som skal være oversettes til ikke-modellen avlinger.

En robot plattform for High-throughput Protoplast Isolering og Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Forstyrrelser av sirkulerende mirnas i Irritabel tarm syndrom oppdages ved hjelp av en multiplekset Høy throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Høy gjennomstrømming robot pasning Isolering av temperaturfølsomme Lethal Mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Høy fett diett fôring og høy gjennomstrømning Triacylglyceride analysen i Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generasjon av innfødte Chromatin Immunoprecipitation sekvensering biblioteker til Nucleosome tetthet analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: En høy gjennomstrømning sekvensering-basert teknikk for å identifisere sent replikere regioner i genomet

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolasjon og høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket konstruksjon for Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Høy gjennomstrømming identifikasjon av synergistisk rusmiddelkombinasjoner av overlapping2 metoden

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Metoden sett replika: En høy gjennomstrømming tilnærming til kvantitativt mål Caenorhabditis elegans levetid

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Høy-gjennomstrømning DNA plasmider multipleksing og Transfeksjoner bruke akustisk Nanodispensing teknologi

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...