Name: a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

1. Fastställande av Suspension cellkulturer <ol><li> Förbereda flytande BY-2 media genom att tillsätta 4,43 g Linsmaier &amp; Skoog basala medier, 30 g sackaros, 200 mg KH 2 PO 4, och 200 | j, g av 2,4-diklorfenoxiättiksyra (2,4-D) till 900 ml destillerat vatten och pH-värdet till 5,8 med 0,1 M KOH. Efter justering av pH, justera slutvolymen till 1000 ml med destillerat vatten och autoklav. Media kan lagras upp till 2 veckor vid 4 ° C. </li><li> Inokulera en 250 ml Erlenmeyer-kolv med 100 m...

Protokollet som beskrivs ovan har framgångsrikt validerats för protoplastisolering, uppräkning, och transformation med hjälp av BY-2 tobakssuspensionscellkultur; kunde dock protokollet lätt utökas till alla växter suspensionskultur. För närvarande har protoplastisolering och omvandling uppnåtts i många växter, inklusive majs (Zea mays) 10, morot (Daucus carota) 32, poppel (Populus euphratica) 33, druva (Vitis vinifera) 34, oljepa...

Under de senaste åren har det skett en betydande drivkraft placeras på utformningen av genmodifierade grödor för att övervinna olika sjukdomar 1, förse herbicidresistens 2, ger torka 3,4 och salttolerans 5, förhindra herbivori 6, öka biomassa avkastning 7, och minska cellväggen motspänstighet 8. Denna trend har med hjälp av utveckling av nya molekylära verktyg för att generera transgena växter, inklusive genomet redigering med hjälp av crispr och Talens 9, och genen tysta genom dsRNA 10, miRNA 11, och siRNA 12. Medan dessa tekniker har förenklat generering av transgena växter, har de också skapat en flaskhals, där det stora antalet transgena växter som genereras inte kan screenas med användning av traditionella system som är beroende av växtregenerering. Relaterat till denna flaskhals, medan tysta och genomet-redigerings konstruktioner kan snabbt införas i växter, många av deriktade drag inte ger önskad effekt, som ofta inte upptäcks förrän växter analyseras i växthuset. I detta arbete har vi utvecklat en metod för snabb, automatiserad, high-throughput screening av växtprotoplaster, särskilt för att ta itu med den nuvarande flaskhalsen i början av screening av ett stort antal genomet redigering och geners uttryck mål. Användning av protoplaster, i motsats till intakta växtceller, har flera fördelar för utveckling av en automatiserad plattform. Först är protoplaster isolerades efter digerering av växtcellväggen, och med denna barriär inte längre är närvarande, är transformationseffektiviteten ökas 13. I intakta växtceller finns det bara två väl etablerade metoder för transformation, biolistik 14 och Agrobacterium-medierad transformation 15. Ingen av dessa metoder kan lätt översättas till flytande plattformar hantering, som biolistik kräver specialutrustning för Transformation, medan Agrobacterium-medierad transformation kräver co-kultur och efterföljande avlägsnande av bakterierna. Varken är mottagliga för hög genomströmning metoder. I fallet med protoplaster, är transformation rutinmässigt användning av polyetylenglykol (PEG) -medierad transfektion 16, som endast kräver flera lösning utbyte, och är idealisk för flytande plattformar hantering. För det andra, protoplaster, per definition, är encelliga kulturer, och därmed de problem som är förknippade med klumpar och kedja bildning i växtcellodlingar, inte observeras i protoplaster. I termer av snabb screening med användning av en plattbaserad spektrofotometer, hopklumpning av celler, eller celler i flera plan kommer att leda till svårigheter i att förvärva konsekventa mätningar. Eftersom protoplaster är också tätare än deras odlingsmedier, de sedimenterar till botten av brunnar, som bildar ett monoskikt, vilket är gynnsamt för plattbaserad spektrofotometri. Slutligen medan växtcellsuspensionsodlingar är Primarily härrör från callus 17, kan protoplaster skördas från ett antal växtvävnader, vilket leder till förmågan att identifiera vävnadsspecifika uttryck. Till exempel, förmågan att analysera rot- eller bladspecifik expression av en gen kan vara mycket viktigt att fenotyp förutsägelse. Av dessa skäl har de protokoll som utvecklats i detta arbete valideras med hjälp av protoplaster isolerade från utbredda tobak (Nicotiana tabacum L.) Bright Yellow &quot;2 (BY-2) suspensionskultur. BY-2 suspensionskultur har beskrivits som den &quot;HeLa&quot; cell av högre växter, på grund av dess allmänt utbredda användning i molekylär analys av växtceller 18. Nyligen BY-2-celler har använts för att studera effekterna av växtstress 19-22, intracellulär proteinlokalisering 23,24, och grundläggande cellbiologi 25-27 visar den breda användbarheten av dessa kulturer i växtbiologi. En ytterligare fördel med med-2-odlingar är denmöjligheten att synkronisera kulturerna med afidikolin, vilket kan leda till ökad reproducerbarhet för genuttryck studerar 28. Vidare har metoder utvecklats för utvinning av BY-2 protoplasts använder låga enzymer 29,30, som enzymer som traditionellt används för att generera protoplaster är kostnadseffektiva oöverkomliga för hög genomströmning system. Som sådan har det protokoll som beskrivs nedan validerats med användning av BY-2 suspensionskultur, men det bör vara möjligt att ändra till någon växtcellsuspensionskultur. Proof-of-concept experiment utförs med en orange fluorescerande protein (OFP) reportergen (pporRFP) från de hårda korall porites porites 31 under kontroll av CaMV 35S-promotorn.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Orbitor RS Microplate mover</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Bravo Liquid Handler</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Synergy H1 Multi-mode Reader</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td>
			<td style="width:157px;">BioTek</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Teleshake</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>3800048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CPAC Ultraflat Heater/cooler</td>
			<td style="width:157px;">Inheco</td>
			<td>7000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Vworks Automation Software</td>
			<td style="width:157px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:255px;">Momentum Software</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:255px;">Liquid Handling Control 2.17 Software</td>
			<td style="width:157px;">Biotek</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:157px;">Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Zyla 3-Tap microscope camera</td>
			<td style="width:157px;">Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">ET-CY3/TRITC Filter Set</td>
			<td style="width:157px;">Chroma Technology Corp</td>
			<td>49004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohament CL</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost cellulase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect UF</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Rohapect 10L</td>
			<td style="width:157px;">AB Enzymes</td>
			<td style="width:185px;">sample bottle</td>
			<td>low-cost pectinase/arabinase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Linsmaier &#38; Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">L689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2,4 dichlorophenoxyacetic acid</td>
			<td style="width:157px;">Phytotechnology Laboratories</td>
			<td style="width:185px;">D295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Poly (ethylene glycol) 4000</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">95904-250G-F</td>
			<td>Formerly Fluka PEG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">25535-16-4</td>
			<td>Acros Organics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaCl2</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C7902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Mannitol</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sucrose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC424205000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KOH</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Gelzan CM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">G1910-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">103184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96-well 1.2 ml deep well plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AB-0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">96 well optical bottom plate</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;">9405 163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">NaCl</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">KCl</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P4504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MES</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">AC17259-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">MgCl2</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

Under det senaste årtiondet har det skett ett uppsving i användningen av växtprotoplaster som sträcker sig från modellarter att beskära arter, för analys av signaltransduktionsvägar, transkriptionella regulatoriska nätverk, genuttryck, genomet redigering och gen-tyst. Dessutom har betydande framsteg gjorts när det gäller förnyelse av växter från protoplaster, som har genererat ännu mer intresse för användningen av dessa system för växtgenomik. I detta arbete har ett protokoll utvecklats för automatisering av protoplastisolering och omvandling från en &quot;Bright Yellow &#39;2 (BY-2) tobakssuspensionskultur med hjälp av en robot plattform. De transformationsförfaranden validerades med en orange fluorescerande protein (OFP) reportergen (pporRFP) under kontroll av blomkålsmosaikvirus 35S-promotor (35S). OFP uttryck i protoplaster bekräftades av epifluorescensmikroskopi. Analyser ingår också protoplastproduktionseffektivitet metoder med användning propidium jodid. Slutligen var låga livsmedelskvalitet enzymer som används för protoplastisoleringsproceduren, kringgår behovet av labbkvalitet enzymer som är för dyra i hög genomströmning automatiserad protoplastisolering och analys. Baserat på protokoll som utvecklats i detta arbete, kan hela förfarandet från protoplastisolering transformation utföras i enlighet med 4 timmar, utan någon input från operatören. Medan protokoll som utvecklats i detta arbete har validerats med BY-2 cellkultur, bör de förfaranden och metoder kunna översättas till alla växter suspensionskultur / protoplastsystem, som skulle göra det möjligt acceleration av skörde genforskningen.

I den aktuella studien, dubbleringshastighet av BY-2 varierade från 14 till 18 h beroende av den temperatur vid vilken kulturerna inkuberades, i överensstämmelse med tidigare rapporter om en medelcellcykellängd av 15 h. Med denna fördubbling takt, en 1: var 100 börjar inokulum användes för att initiera kulturer, vilket leder till odlingar med en packad cellvolym (PCV) av 50% i 5-7 dagar. I det nuvarande protokollet, där kulturer odlades i 200 ml av media, var en PCV av 100 ml ge...

Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

En hög genomströmning, automatiserad produktion och omvandling tobaksprotoplast metod beskrivs. Robotsystemet möjliggör massivt parallell genuttryck och upptäckter i modellen BY-2-systemet som ska kunna översättas till icke-modellgrödor.

En Robotic plattform för hög kapacitet Protoplast Isolering och Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Störningar av cirkulerande miRNAs i Irritable Bowel Syndrome detekteras med hjälp av en Multiplex hög kapacitet Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Hög genomströmning Robotsvetsad Assisted Isolering av temperaturkänslig dödliga mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet utfodring och hög genomströmning Triacylglyceride test på Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: En hög genomströmning sekvensering-baserad teknik för att identifiera sent replikera regioner i genomet

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion för herbarieexemplar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Hög genomströmning identifiering av synergistisk läkemedelskombinationer med överlappning2 Metod

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Den replika Set-metoden: En hög genomströmning strategi att kvantitativt mäta Caenorhabditis elegans livslängd

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Hög genomströmning DNA plasmid Multiplexing och transfektion med akustisk Nanodispenseringsteknik

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...