Name: aggregate size optimization in microwells for suspension-based cardiac differentiation of human pluripotent stem cells
Uploaded: 2016-09-25T15:00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

We thank Dr. Peter Zandstra, in whose laboratory this protocol was developed, and Drs. Mark Gagliardi and Gordon Keller who provided assistance in establishing the initial methods on which this process was based. Protocol development was supported by an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology to C.B. and a grant from the Heart and Stroke Foundation of Ontario to Peter Zandstra.

<ol>
	<li>Wintermantel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+scaffolds+using+superstructures.">Tissue engineering scaffolds using superstructures.</a> Biomaterials. 17, 83-91 (1996).</li><li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+for+use+in+a+bioartificial+liver.">Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver.</a> Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).</li><li>Sachlos, E., Auguste, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoid+body+morphology+influences+diffusive+transport+of+inductive+biochemicals:+a+strategy+for+stem+cell+differentiation.">Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).</li><li>Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+chondrogenesis+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells.">In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells.</a> Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).</li><li>Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+differential+adhesion+govern+self-assembly+processes+in+histogenesis?+Equilibrium+configurations+and+the+emergence+of+a+hierarchy+among+populations+of+embryonic+cells.">Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells.</a> J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).</li><li>Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Round-bottom+96-well+Polystyrene+Plate+Coated+with+2-methacryloyloxyethyl+Phosphorylcholine+as+an+Effective+Tool+for+Embryoid+Body+Formation.">A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation.</a> Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).</li><li>Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust,+reproducible+hematopoietic+differentiation.">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106, 1601-1603 (2005).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability.">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PloS One. 3, e1565 (2008).</li><li>Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+generation+and+differentiation+of+neural+precursor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).</li><li>Ungrin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).</li><li>Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+as+models+of+trophoblast+differentiation:+progress,+opportunities,+and+limitations.">Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations.</a> Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).</li><li>Markway, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell.">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell.</a> Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).</li><li>Wallace, L., Reichelt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+3D+culture+to+investigate+the+role+of+mechanical+signaling+in+keratinocyte+stem+cells.">Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells.</a> Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).</li><li>Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+human+embryonic+stem+cells.">Phenotypic analysis of human embryonic stem cells.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. JoVE. , e52010 (2014).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+signaling+through+TGF&#946;+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Stage-specific signaling through TGF&#946; family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).</li><li>Niebruegge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+mesoderm+and+cardiac+cells+using+size-specified+aggregates+in+an+oxygen-controlled+bioreactor.">Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).</li></ol>

M.U. has a financial interest in the underlying microwell technology.

وقد لوحظ أن التمايز القلب كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة هي عملية شديدة التباين. وفي حين أنه ليس من المستغرب أن خطوط مختلفة من الخلايا يحمل نزعات مختلفة للقدرة التمايز إلى أنواع معينة من الخلايا، فقد لوحظ أن كفاءة التمايز القلب يتقلب بشكل كبير بين تكرار يدير باستخدام نفس خط 6 خلايا. بروتوكول الموصوفة هنا يتناول مصدر رئيسي واحد من هذا التغير عن طريق التحكم مباشرة في عدد الخلايا مساهمة في مجموع المباراتين. لمزيد من خفض التباين بين أشواط، فمن المستحسن أن خطوط hPSC تكييفها لالركض خلية واحدة تستخدم، حيث إن هذا النوع من توسعة وصيانة النتائج hPSC في السكان المحفزة أكثر اتساقا مع الاحترام لترددات التعبير عن علامات تعدد القدرات (على سبيل المثال، Oct4، NANOG، هيئة تنظيم الاتصالات-1-60، الخ.). البروتوكول كما هو مكتوب هنا يحدد حجم الكلي من 1000 الخلايا للسالحث القلب ptimal من الجنينية خط الخلايا الجذعية HES-2. لتطبيق هذا البروتوكول على خطوط مختلفة من الخلايا، فمن الأهمية بمكان أن يتم إجراء شاشة الأولية حجم الكلي لتحديد الحجم الأمثل الكلي خلية خط معين. في حين أنها لا تؤثر بشكل مباشر على الإجراءات الواجب اتباعها هنا، أن نذكر القارئ أن التغيرات في حجم الكلي وكثافة الخلايا الشاملة من المتوقع أن تؤثر على تسليم الأكسجين. قد يصبح هذا عاملا مهما في التطبيقات المصب. بالإضافة إلى ذلك، أفكارك موت الخلية هو مصدر قلق خلال تفكك hPSCs إلى الخلايا وحيدة. لذا، فمن الأهمية بمكان لضمان المانع ROCK موجودا خلال تجميع خلية القسري في microwells. وأخيرا، فمن الأهمية بمكان أن يوم 4 من التمايز المجاميع يتم غسلها جيدا لإزالة أثر Activin A، موجودة في متوسط ​​التعريفي 1، قبل إعادة تعليق في الحث 2 متوسط. بعد يوم 4 من التمايز، Activin ويعزز الأديم التمايز على حساب المتوسطديرم تحريض 20. التطبيق الرئيسي من هذه التقنية هو لفحص الأحجام الإجمالية التي تعزز التفرقة القلب كفاءة. ومع ذلك، واحدة من القيود المفروضة على تقنية الحالية هو أنه يمثل تحديا لتوسيع نطاق إنتاج القلب إلى المستويات ذات الصلة سريريا باستخدام لوحات microwell. ويتم على نطاق وتتكون من التمايز القلب عادة في ظروف ثقافة السائبة في المفاعلات الحيوية تعليق أثار 21. لذلك، مرة واحدة تم استخدام نظام microwell لتحديد نطاقات مقبولة من حجم الكلي لتحريض القلب كفاءة، فإن الخطوة التالية لزيادة هي تحديد سرعات مفاعل حيوي المكره التي يمكن أن تولد المطلوب حجم الخلية مجموع المباراتين. أحد الفروق الهامة لهذه التقنية فيما يتعلق بأساليب أخرى للتمايز القلب مقرها الكلي، غير أنه يمكن التحقيقات المباشرة في تحوير آثار إشارات الذاتية في المجاميع وكذلكالثقافة المشتركة من أنواع الأنسجة الاستقرائي / المثبطة مع hPSCs في الكلي 13. هذه الأنواع من التحقيقات يمكن أن تبلغ تطوير عملية الإنتاج القلب على نطاق واسع.

في زراعة الخلايا في المختبر يمكن أن يؤديها في إطار عدد من الطرائق، ولكن يتم عادة إما في ظروف ملتصقة ثنائية الأبعاد أو في ظروف تعليق ثلاثية الأبعاد أن ألخص بشكل كامل في أنظمة الجسم الحي. ونتيجة لذلك هناك اتجاه متزايد في العديد من مجالات البحوث لتطوير طرق فعالة لتوليد بنيات الأنسجة ثلاثية الأبعاد. في سيناريوهات حيث تتطلب أنواع وعمليات الخلية الداعمة المصفوفة خارج الخلية (ECM) السطحية والتصاق الإشارات، ويمكن تطبيق ثلاثي الأبعاد الثقافة عبر بنيات scaffolded، حيث الخلايا مثقف أو في خارجية المنشأ دعم مصفوفة 1. ويمكن إجراء الخلايا والعمليات التي لا تتطلب الانضمام إلى مصفوفة داعمة في تعليق كأنظمة unscaffolded تتألف أساسا أو حصرا من الخلايا (التي قد ثم المضي قدما لتوليد مصفوفات الذاتية الخاصة بهم) 2،3. هنا، نقدم بروتوكول للالقلب التمايز سالخلايا الجذعية المحفزة الإنسان و (hPSCs - الخلايا الجذعية قادرة على أن تصبح أي نوع من الخلايا في الجسم، سواء كانت من مصادر الجنينية أو غيرها) في والزي الرسمي، وحدات unscaffolded التي تسيطر عليها الحجم. وتشهد التفريق بين hPSCs كما المجاميع التعليق من الاختلافات الكبيرة في حجم الكلي سواء داخل تشغيل وبين أشواط. هذا التباين هو نتيجة للطريقة وعادة ما تستخدم لتوليد هذه المجاميع، والذي ينطوي على التفكك الميكانيكي للمستعمرات الخلايا. للحد من هذه التقلبات، وقد تم استخدام عدد من الأساليب للسيطرة على عدد من الخلايا في مجموع المباراتين وكذلك القطر الكلي والتوحيد. ومن الأمثلة على ذلك تشكيل المجاميع في أنابيب microcentrifuge 4 أو كما شنقا قطرات 5، micropatterning تعريف ثنائية الأبعاد المستعمرات hPSC 6 ومن ثم يمكن نقلها إلى تعليق، أو الطرد المركزي من الخلايا في U- أو لوحات-V أسفل متعددة جيدا 7،8، 9. ومع ذلك، كل هذه apprتقتصر oaches من الإنتاجية المنخفضة على توليد الكلي. النظم القائمة جيدا تستخدم نهجا مماثلا لأنظمة لوحة-V أسفل، ولكن حجم أصغر من microwells (في هذا البروتوكول كل وجود عرض من 400 ميكرون) يمكن توليد أعداد أكبر من المجاميع موحدة من ثقافة لوحة واحدة بشكل جيد (القطر القياسي لل~ 15.5 ملم تحتوي على ~ 1200 microwells) من شأنه أن تتولد من-V السفلي كلها لوحة 10. وقد استخدم تشكيل الكلي مقرها أيضا في عدد من الإعدادات بما في ذلك التفريق بين hPSCs إلى الأدمة 11، الأديم الباطن 12، أرومية متوسطة 13 و 14 خارج الجنين مصائر. تكون الغضروف من خلايا الجذعية الوسيطة 15؛ جيل من ركائز موحدة لفحص السمية 16؛ والتحقيق في ميكانيكا الأحياء 17. واحد تحديا كبيرا في تطوير بروتوكولات صناعة قوية لإنتاج cardiom المستمدة hPSC-وقد yocytes عدم وجود استنساخ في كفاءة التمايز القلب بين أشواط. أثبتنا سابقا أن هذا التغير يمكن أن يعزى إلى عدم التجانس في السكان hPSC ابتداء، والتي تضم كل من خلايا hPSCs والتفريق تجديد الذات التي تعبر عن الجينات المرتبطة الأديم الباطن والعصبية التمايز 6،18. الإشارات التي يفرزها هذه الخلايا التفريق تؤثر تحريض القلب. على وجه التحديد، الأديم خارج الجنين يعزز تحريض القلب، في حين تمنع الأسلاف العصبية تحريض القلب. على hPSC التجميع، الخلايا داخل يفرق الكلي وتنظيم بحيث تحيط hPSCs غير متمايزة طبقة من خلايا الأديم خارج الجنين التي تضع على السطح الكلي 13. من خلال التحكم في حجم الكلي، ونحن يمكن أن تعدل نسبة الخلايا الأديم الباطن الذي يحفز القلب على hPSCs غير متمايزة (مساحة السطح إلى نسبة الحجم) وتحسين هذه النسبة لأقصى قدر من الحث القلب 13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette aid</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#160;Serological pipettes (5 to 25 mL)&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator or Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;15 and 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fume hood</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Hypoxic (low oxygen) incubator</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Corning/Costar</td>
			<td style="width:119px;">3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bench-top microcentrifuge</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Ultrapure distilled water</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">-20C freezer</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Monothioglycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6145</td>
			<td>Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 &#176;C for up to 3 months, -20 &#176;C is recommended for long-term storage.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StemPro-34 Medium</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10639-011</td>
			<td>Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 &#176;C and the basal medium at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transferrin</td>
			<td style="width:143px;">Roche</td>
			<td>10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">BMP-4</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">bFGF</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">VEGF</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Activin A</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IWP-2</td>
			<td style="width:143px;">Reagents Direct</td>
			<td style="width:119px;">57-G89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrochloric acid&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X L-glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Knockout Serum Replacement</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TrypLE Select</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12563</td>
			<td>Dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aggrewell 400 plates</td>
			<td style="width:143px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">27845</td>
			<td>Microwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aggrewell Rinsing Solution</td>
			<td style="width:143px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7010</td>
			<td>Microwell Rinsing Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Y-27632 ROCK Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type II</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96 well plate (for FACS staining)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Intraprep Permeabilization Reagent</td>
			<td style="width:143px;">Beckman Coulter</td>
			<td>IM2389</td>
			<td>Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cTnT antibody</td>
			<td>Neomarkers&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MS-295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5 mL round bottom flow cytometry tubes</td>
			<td style="width:143px;">FACS machine dependent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aggregate size optimization in microwells for suspension-based cardiac differentiation of human pluripotent stem cells

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

على نحو فعال المجاميع التي تسيطر عليها حجم hPSCs سيتم تشكيلها باستخدام نظام microwell، تعتمد فقط على تركيز الخلايا ومساحة microwell. بعد الطرد المركزي قصيرة، يتم إحضارها الأعداد المناسبة من الخلايا (1000 في هذا البروتوكول) معا في كل microwell (الشكل 1A). الأهم من ذلك، هذه الخلايا تأسيس اتصالات بين الخلايا خلال 24 ساعة، ويجب أن لم يعد ملء البئر، ولكن يبدو كما المجاميع التعاقد مع حواف ناعمة (الشكل 1B). وتوفر هذه المجاميع على المواد الأولية لمزيد من التمايز نحو مصير القلب. إذا فشلت الخلايا لتشكيل مجموعات ضيقة، وهذا يشير إلى احتمال موت الخلية التالية التفكك وإعادة تجميع، ومدى ملاءمة الركض الخلية ومثبط ROCK تركيزات واحدة للحصول على خط خلية معينة ينبغي أن تدرس. الأيام الثلاثة التالية في microwells تظهر تغيرا طفيفا في مورفو الكلي<html> بليد الحركة، على الرغم من أن بعض النمو هو واضح. عند إزالتها من microwells، يجب أن المجاميع الحفاظ على الجولة، مورفولوجيا معبأة بإحكام وتكون ذات حجم مماثل لبعضها البعض (الشكل 1C). والثقافة في ULA 24 لوحات جيدا تسمح مزيد من التوسع الخلايا والنمو. يوم 8، بعد تعرض الأول لActivin الإشارات، وتثبيط WNT، وسوف تبدأ المجاميع لتبدو وكأنها المجاميع أكبر وأكثر إشراقا (1D الشكل). خلال هذه الفترة، والحطام الخلوي كبير يكون واضحا في الجزء السفلي من كل جانب، ويجب أن يتم التوقف عن السماح المجاميع ليستقر قبل إزالة وسائل الإعلام. في بعض الأحيان، فإن العديد من المجاميع تلتحم مع بعضها. هذا لن تحول دون التفريق بين المجاميع الأخرى في البئر، على الرغم من أن هذه &quot;المجاميع سوبر&quot; لا تميل إلى إظهار التغيرات المورفولوجية رأينا مع مجاميع أصغر وأقل عرضة للخضوع التمايز الكامل. <html> &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; استمرار النتائج التمايز في التغيرات المورفولوجية ملحوظا في المجاميع مع زيادة حجم ومظهر المناطق الليفية المنظمة. يوم 12، وحدات التعاقد يمكن ملاحظتها. وسوف يكون دائما تتكون هذه الخلايا كبيرة وشفافة وغالبا ما تشمل المصفوفة خارج الخلية واسعة خارج مجموع المباراتين (الشكل 2). في حين تقلصات واسعة الإجمالية، تشير إلى وجود تمايز ناجحة والتعبير علامة القلب ويمكن أيضا أن تراعى في المجاميع التي لا تظهر للتعاقد. وبعد تفكك وحدات العمل وimmunolabeling، فإن الغالبية العظمى من الخلايا تكون إيجابية لcTnT cardiomyocyte علامة التدفق الخلوي (الشكل 3). التعبير عن هذه العلامة هو مستقر في الخلايا ويمكن ملاحظة في المجاميع في وقت متأخر من يوم 19 من التمايز. 1.JPG &quot;/&gt; الشكل 1: الجدول الزمني للhPSC متباينة نحو مصير القلب مباشرة بعد تجميع الخلايا ملء ما يقرب من كل microwell (A). في وقت لاحق يوم واحد، يبدو المجاميع مكثف وسلس (B). استمر هذا التشكل حتى عندما تتم إزالة الركام من microwells ومطلي في لوحات جيدة (C). يوم 8، تبدأ المجاميع لتوسيع ويبدو أخف في اللون (D). شريط مقياس: 250 ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig2.jpg" /> الشكل 2: المجاميع تبدأ المتعاقدة التي كتبها يوم 12 من التمايز بعد، لوحظت تقلصات على نطاق مجموع قوية ستة أيام في قلب الحث المرحلة 3 متوسط (أعلى لوحة: الاسترخاءأوجه والمتوسطة لوحة: انكماش). مشتق لوحة أقل من طرح لوحات العليا والمتوسطة، مع معظم اختلافات كبيرة كما تظهر سوداء أو بيضاء (السهام). شريط مقياس: 250 ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig3.jpg" /> الرقم 3: Immunolabeling عن القلب تروبونين تي في المتباينة hPSCs في يوم 17، ومعظم الخلايا إيجابية لتي تروبونين القلب عن طريق التدفق الخلوي (شغل في الرسم البياني). كما هو مبين خلايا ملطخة الضد الثانوية وحدها (الرسم البياني شاغرة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

الأساليب التقليدية لبدء التمايز القلب تعليق مجموع المباراتين على أساس من المحفزة الإنسان ينبع الخلايا (hPSCs) تعاني مع عدم تجانس الثقافة فيما يتعلق حجم الكلي والشكل. هنا، نحن تصف طريقة قوية للتمايز القلب توظيف microwells لتوليد تسيطر عليها حجم hPSC المجاميع مثقف في ظل الظروف التي تشجع القلب.

إجمالي الحجم الأمثل في Microwells لالقائم على تعليق القلب تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

الاستنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية لجس التنظيم المكاني للتمايز الأقدار

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

السريع العصبية تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لقياس نشاط الشبكة على المصفوفات الدقيقة الكهربائي

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

المحفزة الخلايا الجذعية المشتقة خلايا القلب لإصلاح عضلة القلب

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

في المختبر تمايز متعددة القدرات البشرية الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

البطانة الظهارة الظهارية الظهارة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حالة محددة خالية من التغذية وXeno

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...